胰高血糖素样肽-2(glp-2)类似物的制作方法

专利名称：胰高血糖素样肽-2(glp-2)类似物的制作方法
技术领域：
本发明涉及胰高血糖素样肽-2(GLP-2)类似物及其医药用途，例如在预防或治疗胃和肠相关病症以及减轻化学疗法和放射疗法的副作用中的用途。

背景技术：
GLP-2是胰高血糖素原在肠的肠内分泌L细胞以及脑干特定区域中翻译后加工所释放的33个氨基酸的肽。它与胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、胃泌酸调节素和肠高血糖素(glicentin)一起应答于养分摄食而共分泌。
GLP-2通过刺激隐窝中干细胞增殖和抑制绒毛凋亡来诱导小肠粘膜上皮的显著生长(Drucker等Proc Natl Acad Sci U S A.1996，937911-6)。GLP-2还抑制胃排空和胃酸分泌(Wojdemann等J ClinEndocrinol Metab.1999，842513-7)、增强肠屏障功能(Benjamin等.Gut.2000，47112-9)、通过上调葡萄糖转运蛋白来刺激肠的己糖转运(Cheeseman，.Am J Physiol.1997，R1965-71)以及提高肠的血流量(Guan等Gastroenterology.2003，125，136-47)。
GLP-2与属于II类胰高血糖素分泌家族(1)的单G蛋白偶联受体结合。GLP-2受体仅局限于小肠、结肠和胃中，这些部位是已知应答于GLP-2的部位(Yusta等.Gastroenterology.2000，119744-55)。然而，胃肠道中GLP-2受体刺激的靶细胞仍不清楚，并且对与GLP-2偶联的下游胞内中介体的了解甚少。
GLP-2在小肠中已被证实的特异性并有益的效果已经引起了人们在治疗肠疾病或损伤中使用GLP-2的极大兴趣(Sinclair和Drucker，Physiology 2005357-65)。而且，已显示GLP-2在多种临床前肠损伤模型中预防或降低粘膜上皮损伤，所述模型包括化学疗法诱导的粘膜炎、缺血-再灌注损伤、硫酸葡聚糖诱导的结肠炎以及炎性肠病的遗传模型(Sinclair and Drucker Physiology 2005357-65)。
GLP-2以具有以下序列的33个氨基酸的肽的形式分泌H-His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-OH。其迅速地被酶DPP IV在NH2端的2位丙氨酸(A)处切割，以形成失活的人GLP-2(3-33)。除了肾清除之外，GLP-2(1-33)的这种快速酶降解导致该肽的半衰期为约7分钟(Tavares等，Am.J.Physiol.Endocrinol.Metab.278E134-E139，2000)。
US5,994,500(Drucker等)描述了GLP-2拮抗剂及其对胃肠组织生长的影响。其提出了将所述拮抗剂配制成药物用于治疗增生或诱导发育不全。美国5,994,500通过突变例如替换和缺失来改变哺乳动物GLP-2的结构。
US6,184,208、US5,789,379和US6,184,201公开了GLP-2类似物及其医药用途。所述类似物全是通过人GLP-2的替换和/或缺失得到的。
DaCambra等(Biochemistry 2000，39，8888-8894)描述了GLP-2活性的结构决定簇。这样的决定簇的实例是Phe6和Thr5，所述Phe6和Thr5称为对GLP-2受体结合和活化是至关重要的。
WO97/39031公开了GLP-2类似物[Gly2]GLP-2。其中2位的丙氨酸被甘氨酸取代，以使所述肽抵抗DPP IV切割。显示丙氨酸的取代提高所述肽的稳定性和效能(potency)。该专利申请描述了如何使用GLP-2类似物对抗肠上皮粘膜炎症和破坏相关的疾病。它们包括大规模小肠切除、炎性肠病、化学疗法诱发的粘膜炎以及缺血性损伤。
WO02/066511描述了体内半衰期延长的GLP-2类似物及其作为治疗胃肠病症如炎性肠疾病的药物的用途。
WO01/41779描述了h[Gly2]GLP-2用作抑制化学疗法诱导的凋亡和促进细胞存活的预处理的用途。
本文引用的所有参考文献明确地以其整体通过参考并入本文。
许多科学家已经提出使用GLP-2或GLP-2类似物治疗多种疾病。然而，仍然存在对改善的、稳定的GLP-2类似物的需要。


发明内容
宽泛而言，本发明涉及GLP-2类似物，其与野生型GLP-2相比包含一种或多种替换，并且可能具有体内生物活性改善和/或化学稳定性(例如体外稳定性测定中评估的稳定性)改善的特点。更具体地，本发明优选的GLP-2类似物包含野生型GLP-2序列8位、16位、24位和/或28位中一个或多个位置上的替换，其任选地与2位(如引言所述)以及3、5、7、10和11位中一个或多个位置的其他替换和/或野生型GLP-2序列31至33位中一个或多个氨基酸的缺失和/或N-端或C-端稳定肽序列的添加组合。除了提供可能具有改善的化学稳定性和/或生物活性的GLP-2类似物之外，本发明还涉及提供这样的化合物其在小肠中比在结肠中具有优选的肠生长促进活性，反之亦然，尤其是通过包含野生型GLP-2 Asp3和/或Ser8和/或Asn16和/或Asn24和/或Gln28位中一个或多个位置上的修饰而产生的化合物。
因此，在一个方面中，本发明提供通式I代表的GLP-2类似物或其可药用盐或衍生物 R1-Z1-His-X2-X3-Gly-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-Ala-X19-X20- X21-Phe-Ile-X24-Trp-Leu-Ile-X28-Thr-Lys-X31-X32-X33-Z2-R2 其中 R1为氢、C1-4烷基(例如甲基)、乙酰基、甲酰基、苯甲酰基或三氟乙酰基 X2为Gly、Ala或Sar X3为Glu或Asp X5为Ser或Thr X6为Phe或Pro X7为Ser或Thr X8为Asp或Ser X9为Glu或Asp X10为Met、Leu、Nle或氧化稳定的Met取代氨基酸 X11为Asn、Ala、Lys或Ser X12为Thr或Lys X13为Ile、Glu或Gln X14为Leu、Met或Nle X15为Asp或Glu X16为Asn或Ala X17为Leu或Glu X18为Ala或Aib X19为Ala或Thr X20为Arg或Lys X21为Asp或Ile X24为Asn、Ala或Glu X28为Gln、Ala或Asn X31为Pro、Ile或缺失 X32为Thr或缺失 X33为Asp、Asn或缺失 R2为NH2或OH； Z1和Z2独立地为不存在或选自Ala、Leu、Ser、Thr、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、His、Met和Orn的3至20个氨基酸单位的肽序列；并且其中所述GLP-2类似物包含选自以下的一种或多种替换 X8为Ser和/或X16为Ala和/或X24为Ala和/或X28为Ala。
在另一实施方案中，本发明提供通式II代表的GLP-2类似物或者其可药用盐或衍生物 R1-Z1-His-Gly-X3-Gly-X5-Phe-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-Ala-X19-Arg- Asp-Phe-Ile-X24-Trp-Leu-Ile-X28-Thr-Lys-X31-X32-X33-Z2-R2 其中 R1为氢、C1-4烷基(例如甲基)、乙酰基、甲酰基、苯甲酰基或三氟乙酰基 X3为Glu或Asp X5为Ser或Thr X7为Ser或Thr X8为Asp或Ser X9为Glu或Asp X10为Met、Leu、Nle或氧化稳定的Met取代氨基酸 X11为Asn、Ala、Lys或Ser X12为Thr或Lys X13为Ile、Glu或Gln X14为Leu、Met或Nle X15为Asp或Glu X16为Asn或Ala X17为Leu或Glu X19为Ala或Thr X24为Asn或Ala X28为Gln、Ala或Asn X31为Pro、Ile或缺失 X32为Thr或缺失 X33为Asp或缺失 R2为NH2或OH； Z1和Z2独立地为不存在或选自Ala、Leu、Ser、Thr、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、His、Met和Orn的3至20个氨基酸单位的肽序列；并且其中所述GLP-2类似物包含选自以下的一种或多种替换X8为Ser和/或X16为Ala和/或X24为Ala和/或X28为Ala。
在另一实施方案中，本发明提供通式III代表的GLP-2类似物或者其可药用盐或衍生物 R1-Z1-His-Gly-X3-Gly-X5-Phe-X7-X8-Glu-X10-X11-Thr-Ile-Leu-Asp-X16-Leu-Ala-Ala-Arg- Asp-Phe-Ile-X24-Trp-Leu-Ile-X28-Thr-Lys-X31-X32-X33-Z2-R2 其中 R1为氢、C1-4烷基(例如甲基)、乙酰基、甲酰基、苯甲酰基或三氟乙酰基 X3为Glu或Asp X5为Ser或Thr X7为Ser或Thr X8为Asp或Ser X10为Met、Leu、Nle或氧化稳定的Met取代氨基酸 X11为Asn、Ala、Lys或Ser X24为Asn或Ala X28为Gln或Ala X31为Pro或缺失 X32为Thr或缺失 X33为Asp或缺失 R2为NH2或OH； Z1和Z2独立地为不存在或选自Ala、Leu、Ser、Thr、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、His、Met和Orn的3至20个氨基酸单位的肽序列；并且其中所述GLP-2类似物包含选自以下的一种或多种替换X8为Ser和/或X16为Ala和/或X24为Ala和/或X28为Ala。X16不是Ala时，它将是Asn。
在某些实施方案中，当存在Z1时，R1可以是H，当存在Z2时，R2可以是OH。
在本发明的一些实施方案中，GLP-2类似物与具有本申请引言中所公开序列的野生型GLP-2(1-33)具有至少60％的氨基酸序列同一性，更优选至少63％的序列同一性，更优选至少66％的序列同一性，并且还更优选至少69％的序列同一性。
就GLP-2多肽序列而言，“氨基酸序列同一性百分比(％)”定义为候选序列中与野生型GLP-2序列中氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比，所述定义在以下步骤后得出比对序列和必要时引入缺口以实现最高序列同一性百分比，并且不将任何保守性替换认为是序列同一性的一部分。本领域技术人员可使用本领域熟知的技术例如使用公众可用的软件如BLAST、BLAST2或Align软件进行序列比对，比对程序参阅AItschul等(Methods in Enzymology，266460-480(1996)；http://blast.wustl/edu/blast/README.html)或Pearson等(Genomics，46，24，36，1997)和http://molbiol.soton.ac.uk/compute/align.html。
使用这些程序及其默认设置测定本文使用的以及根据本发明的序列同一性百分比。更一般地，技术人员能够容易地确定用于测定比对的适当参数，包括在所比较序列的全长上实现最佳比对所需的任何算法。
在一些优选实施方案中，式I、II或III代表的GLP-2肽类似物包含X8、X16、X24和/或X28位中一个以上位置上的替换和/或这些替换与其它替换的组合，优选与X3、X5、X7、X10和/或X11位替换组合。
落入式I至III的X8位、X16位、X24和/或X28位替换组合的实例包括 Ser8，Ala16 Ser8，Ala24 Ser8，Ala28 Ala16，Ala24 Ala16，Ala28 Ala24，Ala28 Ser8，Ala16，Ala24 Ser8，Ala1 6，Ala28 Ser8，Ala24，Ala28 Ala16，Ala24，Ala28 Ser8，Ala1 6，Ala24，Ala28。
落入式I至III并且可与X8、X16、X24和/或X28位中一个或多个位置上的替换组合的X3、X5、X7、X10和/或X11位替换的实例包括 Glu3，Leu10，Ala11，24 Glu3，Thr5，Leu10，Ser11，Ala16，24，28 Glu3，Thr5，Leu10，Lys11，Ala16，24，28 Glu3，Thr5，Ser8，Leu10，Lys11，Ala16，24，28 Glu3，Thr5，Ser8，11，Leu10，Ala16，24，28 Glu3，Thr5，Ser8，11，Leu10，Ala16，24，28 Glu3，Ser8，11，Leu10，Ala16，24，28 Glu3，Leu10，Ser11，Ala16，24，28 Glu3，Leu10，Lys11，Ala16，24，28 Glu3，Thr5，Leu10，Ala11，16，24，28 Glu3，Thr5，Leu10，Ala11，16，24，26，Ile21 Glu3，Thr5，Ser8，Leu10，Ala11，16，24，28 Glu3，Ser8，Leu10，Ala11，16，24，28 Glu3，Leu10，Ala11，16，24，28 Thr7，Leu10，Ala11，24 Thr7，Leu10，Lys11，Ala24 Thr7，Leu10，Ser11，Ala24 Thr7，Leu10，Ser8，11，Ala24 Thr7，Ser8，Leu10，Ala11，24 Thr7，Ser8，Leu10，Lys11，Ala24 Ser8，Leu10，Ala11，24 Leu10，Ala24 Leu10，Ala11，Ala24 Leu10，Ala11，24，28 Leu10，Ala11，16，24，28 Leu10，Lys11，Ala24 Leu10，Ser11，Ala24 Leu10，Ser8，11，Ala24 或与上述8、16、24和/或28位变化组合的X31-X33位中一个或多个位置上的缺失。
下文的详细描述中公开了本发明GLP-2化合物的具体实例。
除了提供可能改善了化学稳定性和/或生物活性的GLP-2类似物以外，本发明还涉及提供这样的化合物其在小肠中具有比在结肠中优选的生长促进活性，反之亦然。具体而言，本文描述的实验显示，在对测试动物施用时，与结肠质量增加相比较，野生型GLP-2中Asp3和/或Ser8和/或Asn16和/或Asn24和/或Gln28位的替换提供优选的小肠重量增加。这些发现意味着示例性化合物可用于治疗这样的病症其中在小肠中具有提高的生长促进效应而在结肠中效应较低是有利的，反之亦然。
因此，优选用于引起小肠生长的化合物一般包含野生型GLP-2中3、8、16和/或28位中一个或多个位置上的替换。这样的化合物可选择性地引起小肠而不是结肠的生长。因此，它们可用于影响或涉及小肠的病症。
优选地，这样的小肠选择性化合物包含X3、X7、X16、X24、X28、X31、X32和/或X33位中一个以上位置上的替换。因此，小肠选择性化合物可包含一个以上的下列替换X3为Glu、X7为Ser、X16为Ala、X24为Ala、X28为Ala、X31为Ile、X32为Thr和X33为Asp。可任选地缺失X31、X32和X33位的氨基酸残基。
优选刺激小肠中上皮生长的示例性化合物包括1809、1818、1819、1820、1826、1827、1844、1845、1846、1848、1849、1850、1851、1852、1853、1855、1857、1858、1859。
另一方面，不具有这些改动的本发明化合物，例如包含10、11和/或24位中一个或多个位置上的替换的本发明化合物可能优选用于诱导结肠而不是小肠生长。因此，它们可用于治疗影响或涉及结肠的病症。
这样的结肠选择性化合物可包含X3、X8和/或X24位中一个以上位置上的替换。例如，它们可包含一个以上选自X3为Asp、X8为Asp和X24为Ala的替换。可以任选地缺失X31、X32和X33位的氨基酸残基。
优选地刺激结肠中上皮生长的示例性化合物包括1830、1831、1835、1836、1839、1840、1841和1843。
不引起小肠或结肠优选生长的示例性化合物[Gly2]GLP-2(即参照分子)、1559、1821、1822、1823、1825、1828、1829、1832、1833、1834、1842、1854。
本发明的化合物还具有提高的化学稳定性，例如针对酸水解、氧化和脱酰胺作用的稳定性。相信X3和/或X33位的替换可提高对酸水解的稳定性。X10位的替换可提高氧化稳定性。X11、X16和/或X24位中一个或多个位置的替换可提高针对脱酰胺作用的稳定性，因此，相对于Gly2-GLP-2，本发明的GLP-2类似物可显示出针对酸性溶液中降解、针对脱酰胺作用和/或针对氧化降解的稳定性的增强。
优选地，所述GLP-2类似物维持下文实施例7所述至少一个降解测试中起始纯度的至少70％的观察纯度。作为补充或替代，其在12天后可维持0.1M HCl溶液中起始纯度的至少60％的观察纯度。作为补充或替代，其在6天后可维持0.1M NH4HCO3溶液中起始纯度的至少70％的观察纯度。
在另一方面中，本发明提供包含与载体混合的本文定义的GLP-2类似物或者其盐或衍生物的组合物。在优选实施方案中，所述组合物为可药用组合物，所述载体为可药用载体。GLP-2肽类似物可以是GLP-2类似物的可药用酸加成盐。
在另一方面中，本发明提供用于治疗的本文定义的GLP-2类似物或其盐。
在另一方面中，本发明提供GLP-2类似物或者其盐或衍生物用于制备治疗和/或预防胃和肠相关病症的药物中的用途，比如治疗患有肠功能受损、骨质疏松和DPP-IV(二肽基肽酶-IV)介导的病症的新生儿。例如，所述胃和肠相关病症包括溃疡、胃炎、消化病症、吸收不良综合征、短肠综合征(short gut syndrome)、盲管综合征、炎性肠病、腹型斯泼卢腹泻(例如由麸质诱发的肠病或乳糜泻病引起)、热带型斯泼卢腹泻、低丙种球蛋白血症型斯泼卢腹泻、肠炎、局限性肠炎(克罗恩病)、溃疡性结肠炎、腹泻相关的肠易激综合征、小肠损伤或短肠综合征(short bowel syndrome)。
可用本发明GLP-2类似物治疗或可使用GLP-2类似物进行预防或治疗的其它病症包括放射性肠炎、传染性肠炎或感染后肠炎以及由于毒剂或其它化学治疗剂引起的小肠损伤。这可能需要在化学疗法或放射疗法的疗程之前、同时或之后施用GLP-2类似物，以降低化学疗法的副作用例如腹泻、腹部痛性痉挛和呕吐，以及降低其后由化学疗法或放射疗法引起的肠上皮结构和功能损伤。
因此，本发明还提供治疗药盒，其包含癌症放射疗法药物和本发明的GLP-2类似物，其中每一种均任选地与可药用载体组合。所述两种治疗剂可以分开包装(例如在分开的瓶中)以分别施用，或可以在同一组合物中提供。因此本发明还提供包含与可药用载体组合的癌症化学疗法药物和本发明GLP-2类似物的药物组合物。
对于患有胃肠粘膜瘤形成或胃肠粘膜瘤形成风险提高的患者，可能期望选择化合物以降低或消除已降低副作用(例如刺激或加重胃肠粘膜瘤形成)的风险。例如，选择用于治疗患有结肠瘤形成(良性或恶性)或有发生结肠瘤形成风险的患者的化合物时，选择对小肠的选择性高于结肠的化合物比非选择性化合物或对结肠的选择性高于小肠的化合物可能更合适。
在其他方面中，本发明提供GLP-2类似物用于制备治疗和/或预防营养不良(例如消耗综合征恶病质和厌食症之类的病症)的药物的用途。
在其他方面中，本发明提供包含编码本文定义GLP-2类似物的核酸序列的核酸分子。
在其他方面中，本发明提供包含任选地与指导其表达的序列组合的上述核酸序列的表达载体，以及用所述表达载体转化的宿主细胞。优选地，所述宿主细胞能够表达并分泌GLP-2类似物。在另一方面中，本发明提供生产GLP-2类似物的方法，所述方法包括在适于表达所述GLP-2类似物的条件下培养宿主细胞和纯化这样制备的GLP-2类似物。
本发明还提供用于治疗的本发明核酸、本发明表达载体或者能够表达并分泌本发明GLP-2类似物的宿主细胞。应当理解，所述核酸、表达载体和宿主细胞可用于治疗任何可用GLP-2类似物本身进行治疗的本文所述病症。因此提到包含本发明GLP-2类似物的治疗组合物或施用本发明的GLP-2类似物时，应解释为包括施用本发明的核酸、表达载体或宿主细胞，除非其上下文中另有说明。
在另一方面中，本发明提供通过施用有效量的本文定义的GLP-2类似物或者其盐或衍生物或者本发明的核酸、表达载体或宿主细胞来治疗有此需要的患者中胃和肠相关病症的方法。上文提供了胃和肠相关病症的实例。
在另一方面中，本发明提供治疗或预防有此需要的患者中化学疗法或放射疗法副作用的方法，所述方法包括施用有效量的本文定义的GLP-2类似物或者其盐或衍生物或者本发明的核酸、表达载体或宿主细胞。
在另一方面中，本发明提供治疗和/或预防有此需要的患者中营养不良(例如消耗综合征恶病质和厌食症之类的病症)的方法，所述方法包括施用有效量的本文定义的GLP-2类似物或者其盐或衍生物或者本发明的核酸、表达载体或宿主细胞。
用于举例而非限制地，现参照附图更详细地描述本发明的实施方案。



图1四种小肠选择性化合物(化合物编号1846、1855、1848和1858)在C57BL小鼠小肠(SI)质量上的完全剂量-应答数据的实施例。在三天中每日两次皮下注射施用以下剂量的化合物0(载体)、5、15、45、135、405nmol/kg(n＝6/剂量组)。将每个剂量下水平的应答与采用非选择性参照化合物[Gly2]GLP-2治疗的配对治疗小鼠中相同剂量水平下得到的应答进行比较。为了校正体重(BW)变化，SI质量表达为与BW的相对值(SI-BW比值)，并且用非选择性参照化合物[Gly2]GLP-2观察到的应答将每个剂量水平下的生长应答归一化。结果证明，在5至405nmol/kg的剂量范围内，小肠选择性化合物1846、1855、1848和1858的剂量-应答关系与非选择性参照化合物[Gly2]GLP-2存在显著差异(p＜0.05，两因素ANOVA)，所有四种化合物均以显著高于[Gly2]GLP-2的最大应答刺激小肠生长。值为平均值±SEM。*相对于等摩尔剂量[Gly2]GLP-2的p＜0.05。
图2，四种小肠选择性化合物(化合物编号1846、1855、1848、1858)在小肠(SI)-结肠敏感性指标上相对于非选择性参照化合物[Gly2]GLP-2的完全剂量-应答数据的实施例。在三天中每日两次对C57BL小鼠皮下注射施用以下剂量的化合物0(载体)、5、15、45、135、405nmol/kg(n＝6/剂量组)。将每个剂量下水平的应答与采用非选择性参照化合物[Gly2]GLP-2治疗的配对治疗小鼠中相同剂量水平下得到的应答进行比较。SI-结肠敏感性指标计算为相对于结肠质量的SI质量，并且用非选择性参照化合物[Gly2]GLP-2观察到的应答将每个剂量水平下的敏感性指标归一化。结果证明，在5至405nmol/kg剂量范围内，小肠选择性化合物1857和1820的剂量-应答关系与非选择性参照化合物[Gly2]GLP-2存在显著差异(p＜0.05，两因素ANOVA)，相对于[Gly2]GLP-2，化合物1846、1855和1848均显示最高小肠敏感性的提高。值为平均值±SEM。*相对于等摩尔剂量[Gly2]GLP-2的p＜0.05。
图3两种小肠选择性化合物(化合物编号1857、1849和1820)在C57BL小鼠小肠(SI)质量上的全部剂量-应答数据的实施例。在三天中每日两次皮下注射施用以下剂量的化合物0(载体)、5、15、45、135、405nmol/kg(n＝6/剂量组)。将每个剂量下水平的应答与采用非选择性参照化合物[Gly2]GLP-2治疗的配对治疗小鼠中相同剂量水平下得到的应答进行比较。为了校正体重(BW)变化，SI质量表达为与BW的相对值(SI-BW比值)，并且用非选择性参照化合物[Gly2]GLP-2观察到的应答将每个剂量水平下的生长应答归一化。结果证明，在5至405nmol/kg的剂量范围内，小肠选择性化合物1857、1849和1820的剂量-应答关系与非选择性参照化合物[Gly2] GLP-2存在显著差异(p＜0.05，两因素ANOVA)，两种化合物均以显著高于[Gly2]GLP-2的最大应答刺激小肠生长。值为平均值±SEM。*相对于等摩尔剂量[Gly2]GLP-2的p＜0.05。
图4三种小肠选择性化合物(化合物编号1857、1820、1849)在小肠(SI)-结肠敏感性指标上相对于非选择性参照化合物[Gly2]GLP-2的完全剂量-应答数据的实施例。在三天中每日两次对C57BL小鼠皮下注射施用以下剂量的化合物0(载体)、5、15、45、135、405nmol/kg(n＝6/剂量组)。将每个剂量下水平的应答与采用非选择性参照化合物[Gly2]GLP-2治疗的配对治疗小鼠中相同剂量水平下得到的应答进行比较。SI-结肠敏感性指标计算为相对于结肠质量的SI质量，并且用非选择性参照化合物[Gly2]GLP-2观察到的应答将每个剂量水平下的敏感性指标归一化。结果证明，在5至405nmol/kg剂量范围内，小肠选择性化合物1857、1820和1849的剂量-应答关系与非选择性参照化合物[Gly2]GLP-2存在显著差异(p＜0.05，两因素ANOVA)，相对于[Gly2]GLP-2，全部三种化合物均显示最高小肠敏感性的提高。值为平均值±SEM。*相对于等摩尔剂量[Gly2]GLP-2的p＜0.05。
图5非选择性化合物([Gly2]GLP-2)和小肠选择性化合物(化合物1848)在小肠、结肠和胃质量上的完全剂量-应答数据的实施例。在三天中每日两次对C57BL小鼠皮下注射施用以下剂量的化合物0(载体)、5、15、45、135、405nmol/kg(n＝6/剂量组)。结果证明，在5至405nmol/kg剂量范围内，[Gly2]GLP-2在小肠、结肠和胃中产生剂量依赖性生长刺激，而化合物1848仅在小肠中产生剂量依赖性生长刺激。值为平均值±SEM。*相对于载体的p＜0.05。
图6显示化合物1846(5、15、45、135、405和810nmol/kg，皮下，每日两次，n＝6/剂量组)对采用细胞抑制药物5-氟尿嘧啶(5-FU)处理的小鼠中A)小肠-体重比(SI-BW)和B)小肠长度(SI长度)的影响的实施例。化合物1846在施用每日一次腹膜内注射的50mg/kg5-FU之前施用3天，然后与5-FU一起施用4天。作为参照，对一组动物给予[Gly2]GLP-2(405nmol/kg)。还显示了仅使用载体(PBS)或5-FU处理的对照动物的结果。化合物1846阻止了C57BL小鼠中5-FU诱导的小肠萎缩(器官质量减少和缩短)。值为平均值±SEM。*相对于5-FU的p＜0.05。
图7显示化合物1848(5、15、45、135、405和810nmol/kg，皮下，每日两次，n＝6/剂量组)对采用细胞抑制药物5-氟尿嘧啶(5-FU)处理的小鼠中A)小肠-体重比(SI-BW)和B)小肠长度(SI长度)的影响的实施例。化合物1848在施用每日一次腹膜内注射的50mg/kg5-FU之前施用3天，然后与5-FU一起施用4天。作为参照，对一组动物给予[Gly2]GLP-2(405nmol/kg)。还显示了仅使用载体(PBS)或5-FU处理的对照动物的结果。化合物1848阻止了C57BL小鼠中5-FU诱导的小肠萎缩(器官质量减少和缩短)，并且高剂量的化合物1848比[Gly2]GLP-2更有效。值为平均值±SEM。*相对于[Gly2]GLP-2的p＜0.05。
图8显示化合物1855(5、15、45、135和405nmol/kg，皮下，每日两次，n＝6/剂量组)对采用细胞抑制药物5-氟尿嘧啶(5-FU)处理的小鼠中A)小肠-体重比(SI-BW)和B)小肠长度(SI长度)的影响的实施例。化合物1855在施用每日一次腹膜内注射的50mg/kg5-FU之前施用3天，然后与5-FU一起施用4天。作为参照，对一组动物给予[Gly2]GLP-2(405nmol/kg)。还显示了仅使用载体(PBS)或5-FU处理的对照动物的结果。化合物1855阻止了C57BL小鼠中5-FU诱导的小肠萎缩(器官质量减少和缩短)，并且最高剂量的化合物1855比等摩尔剂量的[Gly2]GLP-2更有效。值为平均值±SEM。*相对于[Gly2]GLP-2的p＜0.05。
图9显示化合物1857(5、15、45、135和405nmol/kg，皮下，每日两次，n＝6/剂量组)对采用细胞抑制药物5-氟尿嘧啶(5-FU)处理的小鼠中A)小肠-体重比(SI-BW)和B)小肠长度(SI长度)的影响的实施例。化合物1857在施用每日一次腹膜内注射的50mg/kg5-FU之前施用3天，然后与5-FU一起施用4天。作为参照，对一组动物给予[Gly2]GLP-2(405nmol/kg)。还显示了仅使用载体(PBS)或5-FU处理的对照动物的结果。化合物1857阻止了C57BL小鼠中5-FU诱导的小肠萎缩(器官质量减少和缩短)，并且最高剂量的化合物1857比等摩尔剂量的[Gly2]GLP-2更有效。值为平均值±SEM。*相对于[Gly2]GLP-2的p＜0.05。
图10显示化合物1846(16、80和400nmol/kg/天，皮下，n＝6/剂量组)在用细胞抑制药物5-氟尿嘧啶(5-FU)处理的雄性Spague-Dawley大鼠中的作用的实施例。化合物1846在施用每日一次腹膜内注射的75mg/kg 5-FU之前施用3天，然后与5-FU一起施用4天。将结果与仅使用载体(盐水)或5-FU处理对照动物中的应答进行比较。还显示了盐水和5-FU对照。化合物1846阻止了大鼠中5-FU诱导的小肠萎缩(小肠质量减少和肠缩短)。值为平均值±SEM。*相对于仅有5-FU的p＜0.05，。
图11该实施例展示化合物1846对由细胞抑制药物5-氟尿嘧啶(5-FU)处理诱发的腹泻的影响。每日一次用5-FU 75mg/kg处理大鼠4天(第1至4天)；(n＝40只大鼠)。在5-FU处理之前最后3天(第-3至-1天)和5-FU处理的4天(第0至3天)中，半数动物接受化合物1846(400nmol/kg，皮下，每日一次)的其他处理。每日两次(早晨和傍晚)观察大鼠以确定动物是否发生腹泻，并且根据以下尺度对腹泻的严重程度进行评分(0)无腹泻；(1)轻度-肛门周围粪便污染；(2)中度-后肢和尾巴粪便污染；和(3)重度-前肢和腹部粪便污染。第5天，约70％仅接受5-FU的Sprague Dawley大鼠发生腹泻(图11A)，而仅30％与化合物1846共处理的大鼠发生腹泻(图11B)。这些结果表明化合物1846有效地防止小肠损伤，从而在用5-FU进行细胞抑制处理期间防止了腹泻的发生。
图12该实施例展示化合物1846对上皮隐窝-绒毛高度(图12A)和空肠(即小肠中段)肌厚度(图12B)的影响。用化合物1846(0.62、3.41或6.2mg/kg，每日一次)静脉内处理Sprague Dawley大鼠5天(n＝6/剂量组)。然后处死动物，在幽门括约肌远端25cm处收集小肠活检(1cm)。固定所述活检、石蜡包埋、切片并用苏木精和伊红染色。在显微镜下检查染色的切片，测量隐窝深度、绒毛高度、隐窝-绒毛长度和肌厚度。根据图示，化合物1846剂量依赖性地提高空肠肠上皮中的隐窝-绒毛长度，但是对空肠肌厚度没有影响。这些结果提示化合物1846通过刺激小肠上皮生长而主要在小肠中发挥其增殖作用。值为平均值±SEM。*相对于载体对照(0mg/kg/天)的p＜0.05。
图13该实施例展示化合物1848对吲哚美辛诱导的小肠溃疡的影响。使用载体(盐水；第1组)或吲哚美辛(7mg/kg皮下，每日一次，进行2天；第2至7组)处理雄性Sprague Dawley大鼠。仅给予吲哚美辛(第2组)或与泼尼松龙组合(10mg/kg皮下，第3组)或与8、40或200nmol/kg化合物1848组合(皮下，每日一次，第4至6组)。最后，采用泼尼松龙(10mg/kg皮下)和化合物1848(200nmol/kg皮下，每日一次)的组合处理来处理一组大鼠(第7组)。吲哚美辛之前4天开始进行化合物1848处理并且在吲哚美辛处理的2天期间继续处理。第3天，处死大鼠，在尸检时轻轻地用10％福尔马林冲洗小肠并用福尔马林填充小肠5分钟，之后沿系膜小肠对向部边缘将肠剪开并悬挂在聚丙烯盘上。小心地用镊子除去任何剩余的肠内容物。室温下再固定24小时后，在Milli-Q水中清洗组织，并用制备为1％乙酸(Bie&Bernstsen)中0.5％溶液的Alcian Green3BX(Chroma)表面染色20分钟。除去过量的染色液和Milli-Q水后，将所述组织制备物转移到70％乙醇中并使用立体显微镜在低倍(×7)下进行分析。从幽门开始仔细检查小肠并利用标准尺(精度0.5mm)测量所有溃疡的性状(圆形和线形)和大小(圆形溃疡直径，线形溃疡长×宽)。溃疡定义为缺少上皮表面的部分。在正在愈合的溃疡中，即使较大面积中仍然缺少绒毛结构，也仅将仍然缺少上皮表面的部分认为是溃疡。以盲法进行所有分析。如图13所示，吲哚美辛强烈诱导小肠溃疡(总小肠溃疡＝333±21mm2)。泼尼松龙处理引起溃疡范围显著下降约29％。化合物1848处理以剂量依赖性方式防止吲哚美辛诱导的溃疡，在最高剂量下，总溃疡降低约50％(178±17mm2)。这种对化合物1846的最大应答高于泼尼松龙的作用，与高剂量化合物1848组合加入泼尼松龙未产生任何附加效应。这些结果表明，化合物1848有效防止吲哚美辛诱导的小肠溃疡。值为平均值±SEM。*与吲哚美辛(第2组)的p＜0.05。#与泼尼松龙(第3组)的p＜0.05。
图14该实施例展示化合物1848对由吲哚美辛诱导小肠炎症的大鼠中小肠TNF-α含量的影响。使用载体(盐水；第1组)或吲哚美辛(7mg/kg皮下，每日一次，进行2天；第2至7组)处理雄性Sprague Dawley大鼠。仅给予吲哚美辛(第2组)或与泼尼松龙组合(10mg/kg皮下，第3组)或与8、40或200nmol/kg化合物1848组合(皮下，每日一次，第4至6组)。最后，采用泼尼松龙(10mg/kg皮下)和化合物1848(200nmol/kg皮下，每日一次)的组合处理来处理一组大鼠(第7组)。吲哚美辛之前4天开始进行化合物1848处理并且在吲哚美辛处理的2天期间继续处理。第3天处死大鼠，在尸检时将小肠分成长度相等的三个节段，分别对应于1)十二指肠和近端空肠、2)中部空肠和远端空肠以及3)回肠。立即在液氮中快速冷冻样品并保存在-80℃至分析。根据下述方案进行小肠节段的匀浆和细胞蛋白的提取对组织节段称重，加入每克组织1.5ml体积用冰预冷(4℃)的提取缓冲液(10mM Tris-HCI(Sigma)和1mM EDTA(J.T.Baker)，(pH7.6)，含0.05％叠氮化钠(Fluka)、1％Tween-80(Fluka)、2mM苯甲基磺酰氟(PMSF，Fluka)以及蛋白酶抑制剂抑肽酶、亮抑蛋白酶肽和胃蛋白酶抑制剂A各1μg/ml(RocheDiagnostics))。用剪刀将组织剪成小块并以9500rpm 20秒匀浆3次(IKA UltraTurrax T25 homogenizer，Janke&Kunkel)，其间在冰上冷却30秒。在4℃下以20.000×g离心组织匀浆30分钟，收集上清液并保存在-20℃至分析TNF-α。根据生产商的说明书使用市售的ELISA试剂盒(Rat Tumor Necrosis Factor-α Ultrasensitive ELISAkit，Biosource International Inc.)分析小肠蛋白提取物的TNF-α。该测定的检出限为0.7pg/ml。使用市售的测定(DC protein assay，Bio-Rad Laboratories Ltd.)分析蛋白提取物中的总蛋白含量。TNF-α的小肠组织水平表达为与总蛋白的相对值。化合物1848显著降低促炎细胞因子TNF-α的小肠组织水平，并且这种效应在近端节段(小肠的前1/3)最为显著。在近端和中部节段(小肠第二个1/3)中，化合物1848比泼尼松龙更有效。有意思的是，化合物1848比泼尼松龙更有效地抑制小肠炎症，并且当与化合物1848组合施用时，泼尼松龙没有附加效应。这些结果提示化合物1848对影响小肠的疾病过程具有显著的抗炎潜能。值为平均值±SEM。*与吲哚美辛(第2组)的p＜0.05。
本发明的详细说明 定义 除非另外指出，为上述书面描述中使用的特定术语提供下述定义。
在说明书和权利要求书全篇中，使用天然氨基酸的常规单字母代码和三字母代码以及其它α-氨基酸例如肌氨酸(Sar)、正亮氨酸(Nle)和α-氨基异丁酸(Aib)的普遍公认的三字母代码。本发明的肽中所有氨基酸残基优选为L-构型，然而，也可以存在D-构型的氨基酸。
本发明的优选化合物具有至少一种GLP-2生物活性，尤其是引起肠生长。这可以如实施例中所述在体内测定中进行评估，其中在用GLP-2类似物处理或接触测试动物之后测定肠或其部分的质量。
与天然GLP-2和上述定义的GLP-2相比较，本发明的GLP-2类似物具有一个或多个氨基酸替换、缺失、倒位或添加。这一定义还包括同义术语GLP-2模拟物和/或GLP-2激动剂。此外，本发明的类似物还可具有一个或多个其氨基酸侧基、α-碳原子、末端氨基、或末端羧酸基的化学修饰。化学修饰包括但不限于添加化学部分、形成新键以及去除化学部分。氨基酸侧基修饰包括但不限于赖氨酸ε-氨基的酰化、精氨酸、组氨酸或赖氨酸的N-烷基化、谷氨酸或天冬氨酸羧酸基的烷基化以及谷氨酸或天冬氨酸的脱酰胺作用。末端氨基修饰包括但不限于去氨基(des-amino)、N-低级烷基、N-二低级烷基以及N-酰基修饰。末端羧基修饰包括但不限于酰胺、低级烷基酰胺、二烷基酰胺以及低级烷基酯修饰。本文优选的低级烷基为C1-C4烷基。此外，可通过肽化学普通技术人员公知的保护基保护一个或多个侧基或端基。氨基酸的α-碳可被单甲基化或二甲基化。
在其存在时，氧化稳定的Met-取代氨基酸指选自以下的氨基酸Met(O)(甲硫氨酸亚砜)、Met(O)2(甲硫氨酸砜)、Val、Ile、Asn、Glx(Glu或Gln)、Tyr、Phe、Trp，优选为Leu、Nle、Ala、Ser和Gly。
应当理解，本发明的肽还可以以盐或其它衍生物的形式提供。盐包括可药用盐例如酸加成盐和碱盐。酸加成盐的实例包括盐酸盐、柠檬酸盐和乙酸盐。碱盐的实例包括阳离子选自以下的盐碱金属例如钠和钾、碱土金属例如钙以及铵离子+N(R3)3(R4)(其中R3和R4独立地表示任意取代的C1-6烷基、任意取代的C2-6烯基、任意取代的芳基或任意取代的杂芳基)。可药用盐的其它实例描述于“Remington′sPharmaceutical Sciences”第17版Ed.Alfonso R.Gennaro(Ed.)，Mark Publishing Company，Easton，PA，U.S.A.，1985和更新的版本以及the Encyclopaedia of Pharmaceutical Technology中。
本发明GLP-2类似物的其它衍生物包括与金属离子如Mn2+和Zn2+的配位络合物、酯如体内可水解的酯、游离酸或碱、水合物、前药或脂质。可以使用本领域熟知的技术在化合物中存在的羟基或羧酸基之间以及适当的羧酸或醇反应配偶体之间形成酯。作为前药的化合物衍生物可在体内或体外转化成母体化合物之一。一般地，化合物的至少一种生物活性将在化合物前药形式中降低，并且可通过前药转化被活化，以释放该化合物或其代谢物。前药的实例包括使用保护基，所述保护基可原位除去以释放活性化合物，或者可在体内抑制药物的清除。
在其存在时，Z1和Z2各自独立地代表3至20个或4至20个氨基酸残基的肽序列，例如在4至15个氨基酸残基范围内、更优选在4至10个氨基酸残基范围内，尤其是在4至7个氨基酸残基范围内，例如4、5、6或7个氨基酸残基，比如6个氨基酸残基。肽序列Z中每个氨基酸残基可独立地选自Ala、Leu、Ser、Thr、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、His、Met、Orn。优选地，所述氨基酸残基选自Ser、Thr、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、His、Orn和Met以及落入WO01/04156中所定义的式I的氨基酸，例如Dbu(2，4-二氨基丁酸)或Dpr(2，3-二氨基丙酸)，更优选选自Glu、Lys和Met，尤其是Lys。上述氨基酸可为D-或L-构型，但优选上述氨基酸为L-构型。特别优选的序列Z是4个、5个或6个连续赖氨酸残基、特别是6个连续赖氨酸残基的序列。示例性序列Z示于WO01/04156。
在某些实施方案中不存在Z1。在这种情况下，可以存在或不存在Z2。
本发明包含下文实验章节中进一步描述的下述肽。
参照GLP-2类似物 1559 H-[Gly2]hGLP-2-OH H-HGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD-OH 本发明GLP-2类似物的实例 1809[Gly2，Glu3，Thr5，Leu10，Ala11，16，24，28]hGLP-2-(Lys)6-NH2 HGEGTFSDELATILDALAARDFIAWLIATKITDK6-NH2 1810[Gly2，Glu3，Thr5，Leu10，Ala11，16，24，28，Ile21]hGLP-2(1-30)-(Lys)6-NH2 HGEGTFSDELATILDALAARIFIAWLIATK6-NH2 1811[Gly2，Pro6，Leu10，Ala11，16，24，28]hGLP-2-NH2 HGDGSPSDELATILDALAARDFIAWLIATKITD-NH2 1812[Gly2，Glu3，Leu10，Ala11，24]hGLP-2-NH2 HGEGSFSDELATILDNLAARDFIAWLIQTKITD-NH2 1813[Gly2，Leu10，Ala11，16，24，28]hGLP-2-NH2 H-HGDGSFSDELATILDALAARDFIAWLIATKITD-NH2 1814[Gly2，Leu10，Ala11，24，28]hGLP-2-NH2 H-HGDGSFSDELATILDNLAARDFIAWLIATKITD-NH2 1815[Gly2，Glu3，Leu10，Ala11，16，24，28]hGLP-2-NH2 H-HGEGSFSDELATILDALAARDFIAWLIATKITD-NH2 1818[Gly2，Ser8，Leu10，Ala11，24]hGLP-2(1-30)-K6-NH2 H-HGDGSFSSELATILDNLAARDFIAWLIQTK6-NH2 1819[Gly2，Leu10，Ser11，Ala24]hGLP-2(1-30)-K6-NH2 H-HGDGSFSDELSTILDNLAARDFIAWLIQTK6-NH2 1820[Gly2，Thr7，Ser8，Leu10，Ala11，24]hGLP-2(1-30)-K6-NH2 H-HGDGSFTSELATILDNLAARDFIAW LIQTK6-NH2 1821[Gly2，Leu10，Lys11，Ala24]hGLP-2(1-30)-K6-NH2 H-HGDGSFSD ELKTILDNLAARDFIAWLIQTK6-NH2 1822[Gly2，Thr7，Leu10，Lys11，Ala24]hGLP-2(1-30)-K6-NH2 H-HGDGSFTDELKTILDNLAARDFIAWLIQTK6-NH2 1823[GIy2，Thr7，Ser8，Leu10，Lys11，Ala24]hGLP-2(1-30)-K6-NH2 H-HGDGSFTSELKTILDNL-AARDFIAWLIQTK6-NH2 1824[Gly2，Thr7，Leu10，Ala11，24]hGLP-2(1-30)-K6-NH2 H-HGDGSFTDELATILDNLAARDFIAWLIQTK6-NH2 1825[Gly2，Ser8，Leu10，Ala11，24]hGLP-2(1-30)-NH2 H-HGDGSFSSELATILDNLAARDFIAWLIQTK-NH2 1826[Gly2，Leu10，Ala24]hGLP-2-K6-NH2 H-HGDGSFSDELNTILDNLAARDFIAWLIQTKITDK6-NH2 1827[Gly2，Thr7，Leu10，Ser11，Ala24]hGLP-2(1-30)-K6-NH2 H-HGDGSFTDELSTILDNLAARDFIAWLIQTK6-NH2 1828[Gly2，Thr7，Leu10，Ser8，11，Ala24]hGLP-2(1-30)-K6-NH2 H-HGDGSFTSELSTILDNLAARDFIAWLIQTK6-NH2 1829[Gly2，Leu10，Ser8，11，Ala24]hGLP-2(1-30)-K6-NH2 H-HGDGSFSSELSTILDNLAARDFIAWLIQTK6-NH2 1830[Gly2，Leu10，Ser11，Ala24]hGLP-2(1-30)-NH2 H-HGDGSFSDELSTILDNLAARDFIAWLIQTK-NH2 1831[Gly2，Thr7，Leu10，Ser11，Ala24]hGLP-2(1-30)-NH2 H-HGDGSFTDELSTILDNLAARDFIAWLIQTK-NH2 1832[Gly2，Thr7，Leu10，Ser8，11，Ala24]hGLP-2(1-30)-NH2 H-HGDGSFTSELSTILDNLAARDFIAWLIQTK-NH2 1833[Gly2，Leu10，Ser8，11，Ala24]hGLP-2(1-30)-NH2 H-HGDGSFSSELSTILDNLAARDFIAWLIQTK-NH2 1834[Gly2，Thr7，Ser8，Leu10，Ala11，24]hGLP-2(1-30)-NH2 H-HGDGSFTSELATILDNLAARDFIAWLIQTK-NH2 1835[Gly2，Leu10，Lys11，Ala24]hGLP-2(1-30)-NH2 H-HGDGSFSDELKTILDNLAARDFIAWLIQTK-NH2 1836[Gly2，Thr7，Leu10，Lys11，Ala24]hGLP-2(1-30)-NH2 H-HGDGSFTDELKTILDNLAARDFIAWLIQTK-NH2 1839[Leu10，Ala11，Ala24]hGLP-2(1-33)-K6-NH2 H-HGDGSFSDELATILDNLAARDFIAWLIQTKITDK8-NH2 1840[Leu10，Ala11，Ala24]hGLP-2(1-33)-NH2 H-HGDGSFSDELATILDNLAARDFIAWLIQTKITD-NH2 1841[Leu10，Ala11，Ala24]hGLP-2(1-30)-NH2 H-HGDGSFSDELATILDNLAARDFIAWLIQTK-NH2 1842[Thr7，Ser8，Leu10，Lys11，Ala24]hGLP-2(1-30)-NH2 H-HGDGSFTSELKTILDNLAARDFIAWLIQTK-NH2 1843[Thr7，Leu10，Ala11，Ala24]hGLP-2(1-30)-NH2 H-HGDGSFTDELATILDNLAARDFIAWLIQTK-NH2 1844[Gly2，Glu3，Thr5，Ser8，11，Leu10，Ala16，24，28]hGLP-2(1-33)-(Lys)6-NH2 H-HGEGTFSSELSTILDALAARDFIAWLIATKITDK6-NH2 1845[Gly2，Glu3，Thr5，Leu10，Ser11，Ala16，24，28]hGLP-2(1-33)-(Lys)6-NH2 H-HGEGTFSDELSTILDALAARDFIAWLIATKITDK6-NH2 1846[Gly2，Glu3，Ser8，11，Leu10，Ala16，24，28]hGLP-2(1-33)-(Lys)6-NH2 H-HGEGSFSSELSTILDALAARDFIAWLIATKITDK6NH2 1847[Gly2，Glu3，Leu10，Ser11，Ala16，24，28]hGLP-2(1-33)-(Lys)6-NH2 H-HGEGSFSDELSTILDALAARDFIAWLIATKITDK6-NH2 1848[Gly2，Glu3，Thr5，Ser8，Leu10，Ala11，16，24，28]hGLP-2(1-33)-(Lys)6-NH2 H-HGEGTFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITDK6-NH2 1849[Gly2，Glu3，Ser8，Leu10，Ala11，16，24，28]hGLP-2(1-33)-(Lys)6-NH2 H-HGEGSFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITDK6-NH2 1850[Gly2，Glu3，Leu10，Lys11，Ala16，24，28]hGLP-2(1-33)-(Lys)6-NH2 H-HGEGSFSDELKTILDALAARDFIAWLIATKITDK6-NH2 1851[Gly2，Glu3，Thr5，Leu10，Lys11，Ala16，24，28]hGLP-2(1-33)-(Lys)6-NH2 H-HGEGTFSDELKTILDALAARDFIAWLIATKITDK6-NH2 1852[Gly2，Glu3，Thr5，Ser8，Leu10，Lys11，Ala16，24，28]hGLP-2(1-33)-NH2 H-HGEGTFSSELKTILDALAARDFIAWLIATKITDK6-NH2 1853[Gly2，Glu3，Thr5，Ser8，11，Leu10，Ala16，24，28]hGLP-2(1-33)-NH2 H-HGEGTFSSELSTILDALAARDFIAWLIATKITD-NH2 1854[Gly2，Glu3，Thr5，Leu10，Ser11，Ala16，24，28]hGLP-2(1-33)-NH2 H-HGEGTFSDELSTILDALAARDFIAWLIATKITD-NH2 1855[Gly2，Glu3，Thr5，Ser8，Leu10，Ala11，16，24，28]hGLP-2(1-33)-NH2 H-HGEGSFSSELSTILDALAARDFIAWLIATKITD-NH2 1856[Gly2，Glu3，Ser8，11，Leu10，Ala16，24，28]hGLP-2(1-33)-NH2 H-HGEGSFSDELSTILDALAARDFIAWLIATKITD-NH2 1857[Gly2，Glu3，Leu10，Ser11，Ala16，24，28]hGLP-2(1-33)-NH2 H-HGEGTFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITD-NH2 1858[Gly2，Glu3，Ser8，Leu10，Ala11，16，24，28]hGLP-2(1-33)-NH2 H-HGEGSFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITD-NH2 1859[Gly2，Glu3，Leu10，Lys11，Ala16，24，28]hGLP-2(1-33)-NH2 H-HGEGSFSDELKTILDAL-AARDFIAWLIATKITD-NH2 1860[Gly2，Glu3，Thr5，Leu10，Lys11，Ala16，24，28]hGLP-2(1-33)-NH2 H-HGEGTFSDELKTILDALAARDFIAWLIATKITD-NH2 1861[Gly2，Glu3，Thr5，Ser8，Leu10，Lys11，Ala16，24，28]hGLP-2(1-33)-NH2 HGEGTFSSELKTILDALAARDFIAWLIATKITD 本发明特别优选的化合物包括化合物1834、1846、1847、1848、1849、1855、1857和1858。
1834 H-HGDGSFTSELATILDNLAARDFIAWLIQTK-NH2 1846 H-HGEGSFSSELSTILDALAARDFIAWLIATKITDK6NH2 1847 H-HGEGSFSDELSTILDALAARDFIAWLIATKITDK6-NH2 1848 H-HGEGTFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITDK6-NH2 1849 H-HGEGSFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITDK6-NH2 1855 H-HGEGSFSSELSTILDALAARDFIAWLIATKITD-NH2 1857 H-HGEGTFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITD-NH2 1858 H-HGEGSFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITD-NH2 稳定性研究 技术人员能设计适当方法(例如定量法)用于检测GLP-2类似物的降解产物，例如基于下面描述的方法。降解可以以氧化、水解和脱酰胺作用的形式发生，取决于任何给定的GLP-2类似物中氨基酸的特性和位置以及条件例如pH、溶液和温度。当在应激条件(即可能引起降解的条件)下孵育化合物并且随后分析化合物中剩余完整肽的含量时，可根据化学稳定性对化合物进行分级。此外，得到的对应激条件下所得主要降解产物的了解对于任何后来分析方法的开发都是很重要的。
检测GLP类似物的定量测定 技术人员还能够设计方法(例如定量法)用于检测复杂环境或溶液(例如血浆、尿、组织匀浆、细胞匀浆、唾液等)中的GLP-2类似物，以研究施用于哺乳动物之后GLP-2类似物的吸收、分布、代谢和排泄，或者作为体外细胞体系功能研究的一部分。
在一个实施方案中，定量测定可基于针对GLP类似物或其片段的抗体。从经免疫的动物中得到的抗体可用于定量分析。在一个实施例中，可利用固定在多孔板中的与所述分子中一部分具有亲和力的第一抗体制备直接夹层ELISA。然后对孔应用样品，GLP类似物被第一抗体捕获。然后所捕获的GLP类似物被与GLP类似物另一部分具有亲和力的第二抗体识别。可用酶(辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或β-半乳糖苷酶)或放射性同位素标记所述第二抗体。然后可通过加入比色底物或直接计数辐射或通过闪烁来检测所捕获的GLP类似物的量。或者，通过加入与第二抗体具有亲和力的标记抗体来间接检测所捕获的GLP类似物的量。可由含有已知量GLP类似物的外标曲线得到的应答来估计样品中的浓度。或者，所述抗体可用于制备直接竞争性免疫测定，其中将对GLP类似物具有特异性的抗体固定在多孔板上，并将样品与预定固定浓度的标记GLP类似物一起在孔中孵育。所述标记可以是酶、荧光团、放射性同位素或生物素，并使用以下方法检测，例如对所述酶具有特异性的底物(例如比色、荧光或化学发光)、闪烁或者与酶连接的抗生物素蛋白，随后进行上述检测。可通过适当的方法检测已结合的标记GLP类似物的量，并可由得自上述外标曲线的应答来得出样品中GLP类似物的浓度。
在另一个实施方案中，定量测定可基于液相层析-串联质谱法。在这样的设置中，根据与惰性气体(He或Ar)碰撞引起的母体化合物断裂来监测对待研究GLP类似物具有特异性的片段的应答。断裂之前通过反相层析分离样品组分，或直接将样品注入质谱仪中。适当时可对样品进行预处理(即加入蛋白酶抑制剂、蛋白质沉淀、固相萃取、免疫-亲和萃取等)。由上述外标曲线所得应答得出样品中存在的GLP类似物浓度，这可以是在使用与待研究的GLP类似物相似的内标校正应答之后。
产生特异性抗体 可在哺乳动物中诱导并从血清中纯化针对GLP类似物或其片段的特异性抗体。GLP类似物或片段可直接与佐剂一起用于免疫兔、小鼠或其它哺乳动物，或者GLP类似物或其片段可与载体分子(即匙孔槭血蓝蛋白、卵白蛋白、白蛋白等)化学连接，并与佐剂一起注射。可在延长的时间中以2至4周的间隔重复所述注射，以提高抗体的亲和力和选择性。可直接从血清获得多克隆抗体。为了得到单克隆抗体，应将分离自免疫动物(优选小鼠)的B细胞与肿瘤细胞融合，以形成产生抗体的杂交瘤。利用固定的GLP类似物或其肽随后用标记的抗-抗体检测来筛选和选择适当的克隆和抗体。或者，所述筛选和选择可基于固定抗体随后用标记的GLP类似物或其片段检测。在所有情况下，所述标记均可以是放射性同位素、酶、荧光团或生物素，并使用以下方法检测，例如对所述酶具有特异性的底物(例如比色、荧光或化学发光)、闪烁或者抗生物素蛋白与酶连接，随后进行上述检测。
合成GLP类似物 优选通过固相或液相肽合成手段合成本发明的类似物。在该上下文中，参照WO98/11125和Fields，GB等，2002，“Principles and practice ofsolid-phase peptide synthesis”.InSynthetic Peptides(2nd Edition)以及本文的实施例。
因此，可用多种方式合成GLP类似物，例如包括以下步骤的方法(a)通过固相或液相肽合成手段合成肽并回收这样得到的合成肽；或(b)当所述肽由天然存在的氨基酸组成时，在宿主细胞中表达编码所述肽的核酸构建体，并从所述宿主细胞培养物中回收表达产物；或(c)当所述肽由天然存在的氨基酸组成时，实现编码所述肽的核酸构建体的无细胞体外表达，并回收所述表达产物；或(a)、(b)和(c)方法的组合以得到所述肽的片段，随后连接所述片段以得到所述肽，并回收所述肽。
因此，对于本发明的一些类似物，使用基因工程技术可能是有利的。这可能是当肽足够大(或作为融合构建体产生)和当肽仅包含可由活生物RNA翻译的天然存在氨基酸的情况。
就重组基因技术而言，编码本发明肽的核酸片段是重要的化学产物。因此，本发明的另一方面提供包含编码本发明GLP-2类似物的核酸序列的核酸分子，其中所述肽优选包含于天然存在氨基酸中。本发明的核酸片段为DNA或RNA片段。
本发明的核酸片段通常插入适当的载体中，以形成携带本发明核酸片段的克隆载体或表达载体；这种新载体也是本发明的一部分。涉及构建本发明这些载体的细节将在下文转化细胞和微生物的上下文中讨论。取决于应用的目的和类型，所述载体可以是质粒、噬菌体、粘粒、微染色体或病毒的形式，但仅在某些细胞中瞬时表达的裸DNA也是重要的载体。本发明优选的克隆载体和表达载体(质粒载体)能自主复制，从而能够为了用于随后克隆的高水平表达或高水平复制而实现高拷贝数。
本发明载体的一般概况包括在5’→3’方向有效连接的下述特征用于驱动本发明核酸片段表达的启动子，任选的编码允许分泌(分泌至胞外相或适当时分泌至周质体中)的前导肽或多种目的(如组合分泌、纯化标记和酶修饰以校正肽或将多肽片段整合到膜中)的前导肽的核酸序列、编码本发明肽的核酸片段以及任选的编码终止子的核酸序列。当用表达载体在生产株或细胞系中操作时，为了转化细胞的基因稳定，优选所述载体在引入宿主细胞时整合进宿主细胞基因组中。
使用本发明的载体转化宿主细胞以产生经修饰的本发明肽。这样的转化细胞也是本发明的一部分，可以是用于增殖本发明核酸片段和载体或用于重组产生本发明肽的培养的细胞或细胞系。
本发明优选的转化细胞是微生物例如细菌(如埃希菌(Escherichia)(如大肠杆菌)、芽孢杆菌(Bacillus)(如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、沙门氏菌(Salmonella)或分枝杆菌(Mycobacterium)(优选非致病性的，如牛分枝杆菌(M.bovis)BCG)的物种)、酵母(如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))和原生动物。或者，所述转化细胞来自多细胞生物，即可以是真菌细胞、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞。来自人的细胞也是有意义的，参照下文对细胞系和载体的讨论。为了克隆和/或最优化表达的目的，优选所述转化细胞能复制本发明核酸片段。本发明的实施方案优选使用表达所述核酸片段的细胞；它们可用于小规模或大规模制备本发明的肽。
通过转化细胞生产本发明的肽时，虽然远非必要，但将表达产物运出至培养基或携带到转化细胞表面是便利的。
已经鉴定了有效的生产细胞时，优选基于所述生产细胞建立携带本发明载体和表达编码所述肽的核酸片段的稳定细胞系。优选地，这种稳定细胞系分泌或携带本发明的肽，从而便于纯化。
一般而言，将含有复制子和控制序列的质粒载体(来源于与宿主细胞相容的物种)与宿主一起使用。所述载体通常带有复制位点以及能在转化细胞中提供表型选择的标记序列。例如，一般使用来源于大肠杆菌物种的质粒pBR322(但是存在许多其它可用的质粒)转化大肠杆菌(参阅如Bolivar等，1977)。pBR322质粒含有氨苄青霉素和四环素抗性基因，因而提供鉴定转化细胞的简单手段。pBR质粒或其它微生物质粒或噬菌体必须还包含启动子或经修饰以包含启动子，其可被原核微生物用于表达。
在原核重组DNA构建中最普遍使用的启动子包括β-内酰胺酶(青霉素酶)和乳糖启动子系统(Chang等，1978；ltakura等，1977；Goeddel等，1979)以及色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel等，1979；EP 0 036 776 A)。尽管这些是最常用的，但也已发现并使用了其它微生物启动子，其核苷酸序列的细节已公开，使得技术人员能将其与质粒载体功能性连接(Siebwenlist等，1980)。除了原核生物、真核微生物以外，还可使用例如酵母培养物，而且这时所述启动子也应能够启动表达。在真核微生物中，酿酒酵母或普通面包酵母是最常用的，尽管许多其它株也是普遍可得的。例如，对于酵母属中的表达，质粒YRp7是常用的(Stinchcomb等，1979；Kingsman等，1979；Tschemper等，1980)。该质粒已含有为不能生长在色氨酸中的酵母突变株(如ATCC No.44076或PEP4-1(Jones，1977))提供选择标记的trp1基因。然后，作为酵母宿主细胞基因组特征的trp1损伤的存在提供了用于通过在无色氨酸情况下培养检测转化的有效环境。
酵母载体中适当的启动序列包括3-磷酸甘油酸激酶(Hitzman等，1980)或其它糖酵解酶(Hess等，1968；Holland等，1978)的启动子，例如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡萄糖异构酶以及葡糖激酶的启动子。在构建适当的表达质粒时，还将与这些基因相关的终止序列还被连接到表达载体中待表达序列的3’，以提供mRNA多聚腺苷酸化和终止。
具有转录由生长条件控制的额外优点的其它启动子为乙醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮代谢相关的降解酶和上述甘油醛-3-磷酸脱氢酶以及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶。含有酵母兼容性启动子、复制起点和终止序列的任何质粒载体都是适用的。
除了微生物以外，来源于多细胞生物的细胞培养物也可用作宿主。原则上任何这样的细胞培养物都是可使用的，不管来自脊椎动物或无脊椎动物培养物。然而，脊椎动物细胞是最有意义的，近年来，脊椎动物在培养(组织培养)中的繁殖已经成为常规方案(TissueCulture，1973)。这种可用的宿主细胞系的实例为VERO和HeLa细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系以及W138、BHK、COS-7 293、草地贪夜蛾(spodoptera frugiperda，SF)细胞(完整的表达系统可购自i.a.Protein Sciences，1000 Research Parkway，Meriden，CT06450，U.S.A.和Invitrogen)、Invitrogen(PO Box 2312，9704 CHGroningen，The Netherlands)提供的黑腹果蝇(D.melanogaster)细胞系S2以及MDCK细胞系。
这些细胞的表达载体通常包括(如果需要)复制起点、位于待表达基因之前的启动子以及任何必需的核糖体结合位点、RNA剪接位点、多腺苷酸化位点以及转录终止子序列。
对于哺乳动物中的应用，表达载体的控制功能通常由病毒物质提供。例如，常用的启动子来源于多瘤病毒、腺病毒2，最常用的是猿猴病毒40(SV40)。SV40病毒的早期和晚期启动子是特别有用的，因为它们都容易以同时包括SV40病毒复制起点的片段的形式从病毒中得到(Fiers等，1978)。还可以使用更小或更大的SV40片段，只要其包括从Hind III位点至病毒复制起点中Bg II位点的约250bp序列。此外，还可能(并且通常希望)利用正常情况下与目的基因序列相关的启动子或控制序列，只要这样的控制序列与宿主细胞系统相容。
复制起点可通过构建载体提供以包含外源起点来提供，例如可来自SV40或其它病毒(例如多瘤病毒、腺病毒、VSV、BPV)，或者可以由宿主细胞染色体复制机制提供。如果所述载体整合进宿主细胞染色体中，后者通常是足够的。
为了在重组生产方法中得到满意的产量，通过将肽与可用作亲和标记(为了易于纯化)的融合配偶体和/或通过具有多个肽重复来将所述类似物制备为融合蛋白可能是有利的。这些方法需要存在适当的肽酶切割位点，但是技术人员会知道如何加工其背后的基因构建体。
重组制备后，可通过本领域普遍公知的方法纯化本发明的肽，包括多步层析(离子交换、大小排阻以及亲和层析技术)。
或者，可在无细胞体系中体外制备由天然存在的氨基酸组成的肽。这在肽可能对推定的宿主细胞有毒性的情况下特别有利。因此，本发明还考虑使用无细胞体外翻译/表达以制备本发明的肽。在这种情况下，参照来自例如Ambion Inc.，2130 Woodward，Austin，TX78744-1832，USA的市售体外翻译试剂盒、材料和技术文件。
最后，当然可以组合可用方法，从而制备如半合成类似物。在这样的设置中，使用至少2个分开的步骤或方法制备肽片段，随后连接所述片段以得到最终的肽产物。
药物组合物和施用 本发明的GLP-2类似物或者其盐或衍生物可配制成用于保存或施用的药物组合物，并且其在可药用载体中包含治疗有效量的本发明GLP-2肽或者其盐或衍生物。
本发明化合物的治疗有效量取决于给药途径、受治哺乳动物的类型以及所考虑的具体哺乳动物的身体特征。这些因素及其与确定该量之间的关系是医药领域中技术人员熟知的。可调整该量和施用方法以达到最佳效力，从而将肽递送到大肠，但是将取决于医药领域技术人员熟知的因素例如体重、饮食、同时用药(concurrent medication)和其它因素。
本发明中提供药物组合物，其中所述GLP-2类似物或其盐以有效治疗或预防胃和肠相关病症的量存在。
利用有机和无机碱可形成具有酸性部分的本发明化合物的可药用盐。与碱形成的适当盐包括金属盐比如碱金属或碱土金属盐，例如钠、钾或镁盐；铵盐和有机胺盐，比如与吗啉、硫代吗啉、哌啶、吡咯烷、单-、二-或三羟基低级烷基胺(例如单-、二-或三乙醇胺)形成的盐。还可以形成内盐。相似地，当本发明的化合物包含碱性部分时，可利用有机和无机酸形成盐。例如，可由下述酸形成盐醋酸、丙酸、乳酸、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸、延胡索酸、马来酸、丙二酸、苦杏仁酸、苹果酸、邻苯二甲酸、盐酸、氢溴酸、磷酸、硝酸、硫酸、甲基磺酸、萘磺酸、苯磺酸、甲苯磺酸和樟脑磺酸以及其它公知的可药用酸。还可利用氨基酸例如赖氨酸、甘氨酸或苯丙氨酸形成氨基酸加成盐。
对医药领域中技术人员显而易见地，本发明的肽或药物组合物的“治疗有效量”将根据年龄、体重和受治哺乳动物的物种、使用的具体化合物、具体的给药方式以及所需效果和治疗适应证进行变化。由于这些因素与确定该量的关系是医药领域熟知的，因此确定治疗有效的剂量水平、实现预防和/或治疗本文描述的肠和胃相关疾病的理想结果所需的量以及本文公开的其它医学适应证将在技术人员的能力范围内。
本文使用的“治疗有效量”是降低给定病症或病理的症状、优选使患有所述病症或病理的个体的生理反应正常化的量。可以使用本领域的常规方法确定症状的降低或生理反应的正常化，并且可根据给定的病症或病理而改变。在一个方面中，一种或多种GLP-2类似物或含有一种或多种GLP-2类似物的药物组合物的治疗有效量是这样的量其将可检测的生理参数恢复到与未患所述病症或病状的个体中所述参数基本相同的值(优选在所述值的+30％以内，更优选在+20％以内，并且还更优选在+10％以内)。
在本发明的一个实施方案中，开始以较低的剂量水平施用本发明的化合物或药物组合物，提高剂量水平直至实现预防/治疗相关医疗适应证例如肠和胃相关疾病的理想效果。这将定义为治疗有效量。对于单独的或作为药物组合物一部分的本发明的肽，这样的剂量可以在约0.01mg/kg体重至100mg/kg体重之间，比如在约0.01mg/kg体重至10mg/kg体重之间，例如在10至100μg/kg体重之间。
对于治疗用途，将选定的GLP-2类似物与可药用并且适于通过选定的给药途径递送肽的载体配制在一起。就本发明目的而言，外周肠胃外途径包括静脉内、肌内、皮下以及腹膜内给药途径。用于本发明的某些化合物还可能适于通过口服、直肠、鼻腔或下呼吸道途径给药。这些是所谓的非胃肠外(non-parenteral)途径。本发明的药物组合物包含本发明的GLP-2类似物或者其盐或衍生物以及可药用载体。适当的可药用载体是常规地与基于肽的药物一起使用的载体，比如稀释剂、赋形剂等。用于治疗用途的可药用载体是药学领域熟知的，并且描述于例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，MackPublishing Co.(A.R.Gennaro edit.1985)。例如，可以使用弱酸性或生理pH的无菌盐水和磷酸缓冲盐水。PH缓冲剂可以是磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)、碳酸氢铵、二乙醇胺、组氨酸(是优选的缓冲剂)、精氨酸、赖氨酸、或乙酸盐或其混合物。优选的缓冲范围是pH4至8、pH6.5至8，更优选pH7至7.5。所述药物组合物中可包含防腐剂，例如对甲酚、间甲酚和邻甲酚、对羟苯甲酸甲酯和对羟苯甲酸丙酯、酚、苯甲醇、苯甲酸钠、苯甲酸、苯甲酸苄酯、山梨酸、丙酸、对羟基苯甲酸酯。所述药物组合物中可包含防止氧化、脱酰胺、异构化、消旋化、环化、肽水解的稳定剂，例如抗坏血酸、甲硫氨酸、色氨酸、EDTA、天冬酰胺、赖氨酸、精氨酸、谷氨酰胺和甘氨酸。所述药物组合物中可包含防止聚集、纤维化和沉淀的稳定剂，比如十二烷基硫酸钠、聚乙二醇、羧甲基纤维素、环糊精。所述药物组合物中可包含增溶或防止聚集的有机改性剂，比如乙醇、乙酸或乙酸酯及其盐。所述药物组合物中可包含等渗剂比如盐例如氯化钠或最优选的碳水化合物例如葡萄糖、甘露醇、乳糖、海藻糖、蔗糖或其混合物。
所述药物组合物中可包含去污剂比如Tween 20、Tween 80、SDS、泊洛沙姆例如Pluronic F-68、Pluronic F-127。所述药物组合物中可包含染料甚至是芳香剂。在另一个实施方案中，包含GLP-2肽类似物的可药用酸加成盐。可以使用助悬剂。
所述药物组合物中可包含有机调节剂比如乙醇、叔丁醇、2-丙醇、乙醇、甘油、聚乙二醇，用于冷冻冻干的产物。所述药物组合物中可包含填充剂和等渗剂比如盐例如氯化钠或最优选的碳水化合物例如葡萄糖、甘露醇、乳糖、海藻糖、蔗糖或其混合物、氨基酸例如甘氨酸、谷氨酸或赋形剂半胱氨酸、卵磷脂或人血清白蛋白或其混合物用于冷冻。
本发明的药物组合物可以配制成以下形式并使用用于口腔给药的片剂、胶囊剂或酏剂；用于直肠给药的栓剂；用于注射给药的优选的无菌溶液或无菌粉剂或悬液等等。可调整给药剂量和方法以实现最佳效力，但是将取决于这样的因素比如体重、饮食、并行的药物处理和其它因素，这是医药领域中技术人员应当认识到的。
当进行胃肠外给药时，比如静脉内和皮下，例如以每日为基础，注射用药物组合物可制备成水溶液或悬液的常规形式；适用在临用前重建或在注射前悬于液体中的冻干固体形式，或作为乳剂。
用于重建冻干产品的稀释剂可以是上述列表中的适当缓冲剂、水、盐水、葡萄糖、甘露醇、乳糖、海藻糖、蔗糖、卵磷脂、白蛋白、谷氨酸钠、盐酸半胱氨酸；或添加洗涤剂比如Tween 20、Tween 80、SDS、泊洛沙姆例如Pluronic F-68或Pluronic F-127、聚乙二醇和或添加防腐剂比如对甲酚、间甲酚和邻甲酚、对羟苯甲酸甲酯和对羟苯甲酸丙酯、酚、苯甲醇、苯甲酸钠、苯甲酸、苯甲酸苄酯、山梨酸、丙酸、对羟基苯甲酸酯和或添加有机改性剂比如乙醇、乙酸、柠檬酸、乳酸或其盐的注射用水。
此外，如果需要，所述注射用药物组合物可包含少量非毒性辅助物质，比如湿润剂或pH缓冲剂。可使用增强吸收的制剂(例如脂质体、洗涤剂和有机酸)。
在本发明的一个实施方案中，将化合物配制成用于输注给药，例如在用作全胃肠外营养治疗的患者(例如新生儿，或患有恶病质或厌食症的患者)的液体营养补充剂时，或用于注射给药，例如皮下、腹膜内或静脉内，并且相应地以无菌和无热原形式的水溶液使用，并优选地缓冲至生理上可接受的pH，例如弱酸性或生理pH。用于肌内给药的制剂可基于植物油溶液或悬液，例如芸苔油、玉米油或大豆油。这些基于油的制剂可利用抗氧化剂进行稳定，例如BHA(丁化羟基苯甲醚)和BHT(丁化羟基甲苯)。
因此，本发明的肽化合物可在载体如蒸馏水或盐水、磷酸缓冲盐水、5％葡萄糖溶液或油中施用。如果需要，可通过掺入增溶剂例如洗涤剂和乳化剂提高GLP-2类似物的溶解度。
为了用作注射剂，可向水性载体或载体中补充明胶，所述明胶的量是在注射部位处或附近驻留GLP-2类似物使得GLP-2类似物向理想的作用部位缓慢释放的量。替代的凝胶剂比如透明质酸也可用作驻留剂(depot agents)。
在本发明的一个实施方案中，所述制剂包含 a.溶解在水中的L-组氨酸，终浓度为0.5mM至300mM，优选3至200mM，最优选20至100mM； b.甘露醇，最高为350mM，优选30至300mM，最优选100mM至230mM；和 c.乙酸，溶液中最高为200mM，优选0.05至100mM，最优选0.5至50mM。
添加适当量的治疗化合物以达到浓度为1至100mg/mL，优选5至50mg/mL，最优选10至30mg/mL。将pH调整为终pH为4至8，优选6.5至7.5，最优选6.7至7.3。将所得的溶液调整成目标重量，无菌过滤并以适当的等分试样分装到瓶中用于药用。按照液体产物或冻干产物进一步处理所述制剂。
在本发明的另一个实施方案中，所述制剂包含 a.溶解在水中的L-组氨酸，终浓度为0.5mM至300mM，优选3至200mM，最优选20至100mM； b.L-精氨酸，最高为200mM，优选0.5至100mM，最优选5至50mM； c.甘露醇，最高为350mM，优选30至300mM，最优选100至230mM；和 d.醋酸，溶液中最高为200mM，优选0.05至100mM，最优选0.5至50mM。
添加适当量的治疗化合物以达到浓度为1至100mg/mL，优选5至50mg/mL，最优选10至30mg/mL。将pH调整为终pH为4至8，优选6.5至7.5，最优选6.7至7.3。将所得的溶液调整成目标重量，无菌过滤并以适当的等分试样分装到瓶中用于药用。按照液体产物或冻干产物进一步处理所述制剂。
在本发明的又一个实施方案中，所述制剂包含 a.溶解在水中的L-组氨酸，终浓度最高为200mM，优选3至100mM，最优选5至50mM L-组氨酸； b.L-精氨酸，最高为200mM，优选0.5至100mM，最优选5至50mM； c.甘露醇，最高为350mM，优选30至300mM，最优选100至230mM；和 d.醋酸，溶液中最高为200mM，优选0.05至100mM，最优选0.5至50mM。
添加适当量的治疗化合物以达到浓度为1至100mg/mL，优选5至50mg/mL，最优选10至30mg/mL。将pH调整为终pH为4至8， 优选6.5至7.5，最优选6.7至7.3。将所得的溶液调整成目标重量，无菌过滤并以适当的等分试样分装到瓶中用于药用。按照液体产物或冻干产物进一步处理所述制剂。
在本发明的又一个实施方案中，所述制剂包含 a.溶解在水中的L-组氨酸，终浓度为0.5mM至300mM，优选3至200mM，最优选20至100mM； b.L-精氨酸，最高为200mM，优选0.5至100mM，最优选5至50mM； c.甘露醇，最高为350mM，优选30至300mM，最优选100至230mM；和 d.醋酸，使得溶液中最高为200mM，优选0.05至100mM，最优选0.5至50mM。
添加适当量的治疗化合物以达到浓度为1至100mg/mL，优选5至50mg/mL，最优选10至30mg/mL。将pH调整为终pH为4至8，优选6.5至7.5，最优选6.7至7.3。将所得的溶液调整成目标重量，无菌过滤并以适当的等分试样分装到瓶中用于药用。按照液体产物或冻干产物进一步处理所述制剂。
在本发明的又一个实施方案中，所述制剂包含 a.溶解在水中的L-组氨酸，终浓度最高为200mM，优选3至100mM，最优选5至50mM L-组氨酸； b.L-精氨酸，最高为200mM，优选0.5至100mM，最优选5至50mM； c.甘露醇，最高为350mM，优选30至300mM，最优选100至230mM；和 d.醋酸，使得溶液中最高为200mM，优选0.05至100mM，最优选0.5至50mM。
添加适当量的治疗化合物以达到浓度为1至100mg/mL，优选5至50mg/mL，最优选10至30mg/mL。将pH调整为终pH为4至8，优选6.5至7.5，最优选6.7至7.3。将所得的溶液调整成目标重量，无菌过滤并以适当的等分试样分装到瓶中用于药用。按照液体产物或冻干产物进一步处理所述制剂。
在本发明的又一个实施方案中，所述制剂包含 a.溶解在水中的N-乙酸盐，终浓度最高为200mM，优选3至100mM，最优选5至50mM L-组氨酸； b甘露醇，最高为350mM，优选30至300mM，最优选100至230mM；和 添加适当量的治疗化合物以达到浓度为1至100mg/mL，优选5至50mg/mL，最优选10至30mg/mL。将pH调整为终pH为4至8，优选6.5至7.5，最优选6.7至7.3。将所得的溶液调整成目标重量，无菌过滤并以适当的等分试样分装到瓶中用于药用。按照液体产物或冻干产物进一步处理所述制剂。
还可将本发明的GLP-2类似物配制成缓慢释放的植入装置，用于延长和持续施用GLP-2肽类似物。这样的持续释放制剂可以是位于身体表面的贴片形式。持续释放制剂的实例包括生物相容性聚合物的复合材料，比如聚(乳酸)、乳酸-羟基乙酸共聚物、甲基纤维素、透明质酸、唾液酸、硅酸盐、胶原、脂质体等。当希望提供本发明GLP-2类似物的高局部浓度时，所述持续释放制剂是特别有意义的。
可以以含有肠营养(intestinotrophic)量的肽的无菌-填充小瓶或安瓿形式、以单位剂量或多剂量的量应用GLP-2类似物。所述小瓶或安瓿可含有GLP-2类似物和理想的载体，作为可施用的制剂。或者，所述小瓶或安瓿可含有适于在适当载体(如无菌水或磷酸缓冲盐水)中重建的形式(如冷冻形式)的GLP-2肽。
作为注射制剂的替代方案，GLP-2类似物可配制成用于通过其它途径给药。可根据标准药物实践配制口服剂型比如片剂、胶囊剂等。根据本发明，施用GLP-2类似物以治疗将受益于小肠组织生长的个体。
可通过加入增强剂例如壳聚糖或洗涤剂例如Tween 20、Tween80、泊洛沙姆例如Pluronic F-68、Pluronic F-127、Brij 35、Brij 72、cremophor EL来配制鼻腔剂型。
本发明的肽化合物可单独使用，或者与具有抗炎效应的化合物组合使用。不限于理论地，设想这样的组合治疗可增强本发明肽类似物的有益治疗效果。
当然，最适于患者治疗的治疗剂量和方案将根据待治疗的疾病或病症以及患者的体重和其它参数而变化。不希望限于任何特定理论地，预计μg/kg范围内的剂量以及更短或更长的治疗时间或频率可产生治疗上有用的结果，比如尤其是小肠质量的统计学显著性增加。在一些情况下，治疗方案可包括施用维持剂量，所述剂量适于预防初始治疗停止后出现的组织退化。可根据本发明得到的结果指导最适于人类应用的剂量大小和给药方案，并可在正确设计的临床试验中进行证实。
可通过常规手段确定有效剂量和治疗方案，从实验动物中的低剂量开始，然后提高剂量同时监测效果，并系统性地变化给药方案。在对给定的对象确定最佳剂量时，临床医生可考虑许多因素。这样的考虑因素是技术人员公知的。
在一个实施方案中，本发明GLP-2肽的人类剂量可以从约10μg/kg体重/天至约10mg/kg/天，优选约50μg/kg/天至约5mg/kg/天，并且最优选约100μg/kg/天至约1mg/kg/天。
医疗条件 通过施用有效量的本文所述的GLP-2类似物或其盐，本发明的肽可用作预防或治疗患有胃肠(包括食管上消化道)病症的个体的药剂。所述胃和肠相关病症包括任何病因的溃疡(例如消化性溃疡、药物诱发的溃疡、与感染或其它病原体有关的溃疡)、消化病症、吸收不良综合征、短肠综合征、盲管综合征、炎性肠病、腹型斯泼卢腹泻(例如由麸质诱发的肠病或乳糜泻病引起)、热带型斯泼卢腹泻、低丙种球蛋白血症型斯泼卢腹泻、肠炎、溃疡性结肠炎、小肠损伤和化学疗法诱发的腹泻/粘膜炎(CID)。
如上文一般所述，将受益于小肠质量提高以及随后发生和/或维持正常小肠粘膜结构和功能的个体是采用本发明GLP-2类似物治疗的候选者。可用GLP-2类似物治疗的具体病症包括多种形式的斯泼卢腹泻，包括腹型斯泼卢腹泻，其由热α-麦醇溶蛋白的毒性反应引起，并且可能是麸质诱发的肠病或乳糜泻病的结果，以小肠绒毛的显著丧失为特征；热带型斯泼卢腹泻，由感染引起，以绒毛的部分扁平为特征；丙种球蛋白血症型斯泼卢腹泻，通常在患有普通变异型免疫球蛋白缺乏症或低丙种球蛋白血症的患者中观察到，以绒毛高度显著降低为特征。GLP-2类似物治疗的治疗效力可通过检查绒毛形态的肠活检、营养吸收的生物化学评估、患者的体重增加、或这些病症相关症状的改善来监测。
除上述以外，可用本发明GLP-2类似物治疗或可用GLP-2类似物预防的其它病症还包括上述放射性肠炎、传染性肠炎或感染后肠炎以及由于癌症化学治疗剂或毒剂引起的小肠损伤。
GLP-2类似物还可用于治疗营养不良，例如恶病质和厌食症。
本发明的具体实施方案涉及使用本发明的肽预防和/或治疗肠损伤和功能障碍。这样的损伤和功能障碍是癌症化学疗法治疗熟知的副作用。化学疗法的施用经常伴随着涉及胃肠系统的不需要的副作用，比如粘膜炎、腹泻、细菌易位、吸收不良、腹部痛性痉挛、胃肠出血和呕吐。这些副作用是肠上皮结构和功能损伤的临床结果，经常使得必须降低化学疗法的剂量和频率。施用本发明的GLP-2肽激动剂可增强肠隐窝的营养效应并且迅速提供新细胞以取代化学疗法后损伤的肠上皮。施用本发明肽实现的最终目标是降低进行化学疗法治疗患者中相关胃肠损伤的发病率，同时产生癌症治疗的最佳化学疗法方案。根据本发明，可向正在进行或准备进行放射疗法的患者提供伴随的预防性或治疗性治疗。
由于增殖迅速，小肠粘膜干细胞对化学疗法的细胞毒效应特别敏感(Keefe等，Gut 2000；47632-7)。临床上，化学疗法引起的小肠粘膜损伤通常称为胃肠粘膜炎，特征为小肠吸收和屏障受损。例如，已经显示广泛应用的化学治疗剂5-FU、伊立替康和氨甲蝶呤提高凋亡，引起啮齿动物小肠绒毛萎缩和隐窝发育不全(Keefe等，Gut 47632-7，2000；Gibson等，J Gastroenterol Hepatol.Sep；18(9)1095-1100，2003；Tamaki等，J lnt Med Res.31(1)6-16，2003)。在人中，已经显示化学治疗剂在施用后24小时提高肠隐窝中的凋亡，并且其后在化学治疗后3天降低绒毛面积、隐窝长度、每个隐窝的有丝分裂数和肠细胞高度(Keefe等，Gut 2000；47632-7)。因此，小肠内的结构变化直接导致肠功能障碍，并在一些情况下导致腹泻。
癌症化学疗法后的胃肠粘膜炎是一旦出现就基本上不能治疗的日益严重的问题，尽管能逐渐缓和。利用常用的细胞抑制癌症药物5-FU和伊立替康进行的研究证明，使用这些药物的有效化学疗法主要影响小肠的结构完整性和功能，而结肠的敏感性较低，并且主要应答为粘液形成的提高(Gibson等，J Gastroenterol Hepatol.Sep；18(9)1095-1100，2003；Tamaki等，J Int Med Res.31(1)6-16，2003)。
本发明的新GLP-2类似物可用于预防和/或治疗化学治疗剂的胃肠损伤和副作用。这种可能很重要的治疗应用可适用于目前使用的化学治疗剂，例如但不限于5-FU、六甲蜜胺、博来霉素、白消安、卡培他滨、卡铂、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、Crisantaspase、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、放线菌素D、柔红霉素、多西紫杉醇、多柔比星、表柔比星、依托泊苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、伊立替康、脂质体多柔比星、亚叶酸、洛莫司汀、美法仑、巯嘌呤、美司钠、氨甲蝶呤、丝裂霉素、米托蒽醌、奥沙利铂、紫杉醇、Pemetrexed、喷司他丁、丙卡巴肼、雷替曲塞、链脲菌素、替加氟-尿嘧啶、替莫唑胺、塞替派、硫鸟嘌呤/硫代鸟嘌呤、托泊替康、曲奥舒凡、长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、博来霉素、白消安、卡培他滨、卡铂、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、Crisantaspase、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、放线菌素D、柔红霉素、多西紫杉醇、多柔比星、表柔比星、依托泊苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、伊立替康、脂质体多柔比星、亚叶酸、洛莫司汀、美法仑、巯嘌呤、氨甲蝶呤、丝裂霉素、米托蒽醌、奥沙利铂、紫杉醇、Pemetrexed、喷司他丁、丙卡巴肼、雷替曲塞、链脲菌素、替加氟-尿嘧啶、替莫唑胺、塞替派、硫鸟嘌呤/硫代鸟嘌呤、托泊替康、曲奥舒凡、长春碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨。
设想可通过施用有效量的GLP-2类似物或其盐将本发明的肽用于治疗新生儿的方法中。通过利用本发明的肽激动剂可克服由于缺少肠发育造成的喂养新生儿的相关并发症。
在本发明的另外一个实施方案中，描述了通过向有此需要的患者施用有效量的GLP-2类似物或其盐来治疗DPP-IV(二肽基肽酶-IV)介导的病症的方法。这样的疾病包括DPP-IV酶过表达的病症。
在一个实施方案中，可将药物组合物配制成引起上述GLP-2类似物或其盐或衍生物的缓慢释放。
设想可通过施用有效量的GLP-2类似物或其盐将本发明的肽用于治疗新生儿的方法中。通过利用本发明的肽激动剂可克服由于缺少肠发育造成的喂养新生儿的相关并发症。
在本发明的另外一个实施方案中，描述了通过向有此需要的患者施用有效量的GLP-2类似物或其盐来治疗DPP-IV(二肽基肽酶-IV)介导的病症的方法。这样的疾病包括DPP-IV酶过表达的病症。
实施例 提供下述实施例用于说明本发明的优选方面，而不意在限制本发明的范围。
一般肽合成 仪器和合成策略 在装有用于过滤的聚丙烯滤器的聚乙烯容器中分批合成肽，使用9-芴甲氧羰基(Fmoc)作为N-α-氨基保护基和适当的通用侧链功能性保护基。
溶剂 将溶剂DMF(N，N-二甲基甲酰胺，Riedel de-Haen，Germany)通过填充强阳离子交换树脂(Lewatit S 100 MB/H strong acid，BayerAG Leverkusen，Germany)的柱进行纯化，并在使用前加入3，4-二氢-3-羟基-4-氧代-1，2，3-苯并三嗪(Dhbt-OH)分析其中的游离胺，如果存在游离胺，则产生黄色(Dhbt-O-阴离子)。不经纯化直接使用溶剂DCM(二氯甲烷，分析级，Riedel de-Haen，Germany)。不经纯化直接使用乙腈(HPLC-级，Lab-Scan，Dublin Ireland)。
氨基酸 以适当的侧链保护形式从Advanced ChemTech(ACT)购得Fmoc保护的氨基酸。
偶联试剂 偶联试剂二异丙基碳二亚胺(DIC)购自Riedel de-Haen，Germany。
固体支持物 在TentaGel S树脂0.22-0.31mmol/g上合成肽，在优选C端酰胺化肽的情况下使用TentaGel S-Ram、TentaGel SRAM-Lys(Boc)Fmoc(Rapp polymere，Germany)，而当优选C端游离羧酸时使用TentaGel S PHB，TentaGel S PHB Lys(Boc)Fmoc。
催化剂和其它试剂 二异丙基乙胺(DIEA)购自Aldrich，Germany，哌啶和吡啶来自Riedel-de Haen，Frankfurt，Germany。ethandithiol购自Riedel-de Haen，Frankfurt，Germany。3，4-二氢-3-羟基-4-氧代-1，2，3-苯并三嗪(Dhbt-OH)、1-羟基苯并三唑(HOBt)(HOAt)得自Fluka，Switzerland。乙酸酐得自Fluka。
偶联方案 在DMF中通过DIC法由适当的N-a-保护的氨基酸和HObt或HOAt将氨基酸偶联为原位合成的HObt或HOAt酯。在80℃进行茚三酮测试检查酰化作用，以防止测试期间Fmoc去保护(Larsen，B.D.and Holm，A.，Int.J.Peptide Protein Res.43，1994，1-9)。
N-α-氨基保护基(Fmoc)的去保护 按以下进行Fmoc基的去保护利用DMF中的20％哌啶进行处理(1×5和1×10分钟)，随后用DMF冲洗(5×15ml，每次5分钟)直到向排出的DMF中加入Dhbt-OH后不能检测到黄色为止。HOBt-酯的偶联 将3份N-α-氨基保护的氨基酸与3份HObt和3份DIC一起溶解在DMF中，然后加入树脂中。
用酸从树脂中切割肽 利用95％三氟乙酸(TFA，Riedel-de Haen，Frankfurt，Germany)-水(体积/体积)或95％TFA和5％乙二硫醇(体积/体积)在室温下处理2小时从树脂中切割肽。用95％TFA-水洗涤过滤的树脂，减压蒸发滤液和洗液。用醚冲洗残留物并在醋酸-水中冻干。通过高效液相层析(HPLC)分析粗冷冻产物并通过质谱(MS)进行鉴定。
在TentaGel树脂(PEG-PS)上进行分批肽合成 将TentaGel树脂(1g，0.23-0.24mmol/g)置于装有用于过滤的聚丙烯滤器的聚乙烯容器中。所述树脂在DMF(15ml)中膨胀，并用DMF中的20％哌啶处理，以除去接头TentaGel S RAM上或树脂TentaGel S RAM-Lys(Boc)Fmoc的第一个氨基酸上的初始Fmoc基团。排干树脂并用DMF洗涤直到向排出的DMF中加入Dhbt-OH后不能检测到黄色为止。如上述将根据序列的氨基酸偶联为预制的Fmoc-保护的HObt酯(3份)。除非另外指出，继续偶联2小时。排干树脂并用DMF(5×15ml，每次5分钟)洗涤以除去过量的试剂。通过上述茚三酮测试检查所有的酰化作用。完成合成后，用DMF(3×15ml，每次5分钟)、DCM(3×15ml，每次1分钟)以及最后用二乙醚(3×15ml，每次1分钟)洗涤肽-树脂，并真空干燥。如上所述从树脂中切割肽并如下所述分析和纯化粗肽产物。
HPLC条件 用HP1100四元泵、HP1100自动进样器、HP1100柱恒温器和HP1100多波长检测器组成的Hewlett Packard HP 1100 HPLC系统进行梯度HPLC分析。使用Hewlett Packard Chemstation for LC软件(A.06.01版)进行仪器控制和数据采集。使用以下的柱和HPLC缓冲系统 柱VYDAC 238TP5415，C-18，5mm，300150×4.6mm。
缓冲液AMQV中0.1％的TFA；B0.085％TFA、10％MQV、90％MeCN。
梯度0-1.5分钟.0％B 1.5-25分钟50％B 25-30分钟100％B 30-35分钟100％B 35-40分钟0％B 流速1ml/分钟，箱温度40℃，UV检测I＝215nm。
粗肽的HPLC纯化 通过PerSeptive Biosystems VISION工作站纯化粗肽产物，VISION 3.0软件用于仪器控制和数据采集。使用下述柱和HPLC缓冲系统 柱Kromasil KR 100，10mm C-8，250×50.8mm。
缓冲体系缓冲液AMQV中0.1％的TFA；B0.085％TFA、10％MQV、90％MeCN。
梯度0-37分钟.0-40％B 流速35ml/分钟，UV检测I＝215nm和280nm。
质谱 将肽溶解在超梯度甲醇(Labscan，Dublin，Ireland)、milli-Q水(Millipore，Bedford，MA)和甲酸(Merck，Damstadt，Germany)(50∶50∶0.1 v/v/v)中得到1至10mg/ml的浓度。利用准确度为+/-0.1m/z的LCT质谱仪(Micromass，Manchester，UK)通过ESI-TOF-MS以正极性方式分析肽溶液(20ml)。
一般合成方案 在所有合成中，将干燥的TentaGel-S-Ram树脂(1g，0.22-0.31mmol/g)置于装有用于过滤的聚丙烯滤器的聚乙烯容器中。所述树脂在DMF(15ml)中膨胀，并用含有20％哌啶的DMF处理以保证树脂上非质子化氨基的存在。排干树脂并用DMF洗涤，直到向排出的DMF中加入Dhbt-OH后不能检测到黄色为止。如上述将根据序列的氨基酸偶联为预制的Fmoc-保护的HObt酯(3份)。除非另外指出，继续偶联2小时。排干树脂并用DMF(5×15ml，每次5分钟)洗涤以除去过量的试剂。在80℃进行茚三酮测试检查所有的酰化作用。完成合成后，用DMF(3×15ml，每次5分钟)、DCM(3×15ml，每次1分钟)以及最后用二乙醚(3×15ml，每次1分钟)洗涤肽-树脂，并真空干燥。如上所述从树脂中切割肽并冻干。利用上述制备性HPLC纯化后，收集肽产物并通过ES-MS确定肽的身份。该方案用于合成下文进一步示例的所有肽。
合成的化合物 利用上述技术，使用上述方法合成化合物1809至1861以及参照化合物1559(H-[Gly2]hGLP-2-OH)(表1)。
表1合成的化合物 *)产量；产量/g树脂 实施例1.化合物1846的合成 TentaGel S RAM-Lys(Boc)Fmoc上的H-His-Gly-Glu-Gly-Ser-Phe-Ser-Ser-Glu-Leu-Ser-Thr-Ile-Leu-Asp-Ala-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Ile-Ala-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-NH2。
将干燥的TentaGel S RAM-Lys(Boc)Fmoc(0.24mmol/g，1g)置于装有用于过滤的聚丙烯滤器的聚乙烯容器中，并如“ TentaGel树脂上分批式肽合成”所述进行处理直到完成N端组氨酸的偶联。所有偶联均持续过夜。如上所述检查酰化作用。完成合成和N端Fmoc基团去保护后，如上所述从树脂中切割肽。如上所述利用制备性HPLC纯化后，收集了28.8mg纯度高于90％的肽产物，并通过MS确定肽的身份(实测M4315.38，计算M4315.41)。
实施例2.化合物1848的合成 TentaGel S RAM-Lys(Boc)Fmoc上的H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Ser-Ser-Glu-Leu-Ala-Thr-Ile-Leu-Asp-Ala-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Ile-Ala-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-NH2。
将干燥的TentaGel S RAM-Lys(Boc)Fmoc(0.24mmol/g，1g)置于装有用于过滤的聚丙烯滤器的聚乙烯容器中，并如“TentaGel树脂上分批式肽合成”所述进行处理直到完成N端组氨酸的偶联。所有偶联均持续过夜。如上所述检查酰化作用。完成合成和N端Fmoc基团去保护后，如上所述从树脂中切割肽。如上所述利用制备性HPLC纯化后，收集了230mg纯度高于90％的肽产物，并通过MS确定肽的身份(实测M4313.63，计算M4313.43)。
实施例3.化合物1855的合成 TentaGel S RAM-Asp(OtBu)Fmoc上的H-His-Gly-Glu-Gly-Ser-Phe-Ser-Ser-Glu-Leu-Ser-Thr-Ile-Leu-Asp-Ala-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Ile-Ala-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-NH2。
将干燥的TentaGel S RAM-Asp(OtBu)Fmoc(0.2mmol/g，1g)置于装有用于过滤的聚丙烯滤器的聚乙烯容器中，并如“TentaGel树脂上分批式肽合成”所述进行处理直到完成N端组氨酸的偶联。所有偶联均持续过夜。如上所述检查酰化作用。完成合成和N端Fmoc基团去保护后，如上所述从树脂中切割肽。如上所述利用制备性HPLC纯化后，收集了27.3mg纯度高于90％的肽产物，并通过MS确定肽的身份(实测M3547，计算M3546.84)。
实施例4.化合物1857的合成 TentaGel S RAM-Asp(OtBu)Fmoc上的H-His-Gly-Glu-GIy-Thr-Phe-Ser-Ser-Glu-Leu-Ala-Thr-Ile-Leu-Asp-Ala-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Ile-Ala-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-NH2。
将干燥的TentaGel S RAM-Asp(OtBu)Fmoc(0.2mmol/g，1g)置于装有用于过滤的聚丙烯滤器的聚乙烯容器中，并如“TentaGel树脂上分批式肽合成”所述进行处理直到完成N端组氨酸的偶联。所有偶联均持续过夜。如上所述检查酰化作用。完成合成和N端Fmoc基团去保护后，如上所述从树脂中切割肽。如上所述利用制备性HPLC纯化后，收集了39.3mg纯度高于90％的肽产物，并通过MS确定肽的身份(实测M3544.88，计算M3544.86)。
实施例5.化合物1846A(乙酸盐)的合成 由三氟乙酸反离子交换为化合物1846的乙酸盐。
由于用于纯化粗合成肽产物的HPLC缓冲液中存在三氟乙酸(0.1％体积/体积)，因此以三氟乙酸盐分离经纯化的化合物1846合成肽产物。
为了与乙酸交换反离子三氟乙酸，使肽溶液通过在乙酸上填充强碱离子交换树脂的柱(Dowe×1×8)。将365mg化合物1溶解在40ml水中。使所述溶液通过在乙酸上含有40ml强碱离子交换树脂的柱(Dowe×1×8；容量1.33meq/ml树脂)。然后用4×30ml水洗涤树脂，收集洗脱液并冻干得到312mg乙酸盐，根据HPLC分析的纯度为97％。
实施例6.化合物1848C(盐酸盐)的合成 由三氟乙酸(Tfa)反离子交换为化合物1846的氯化物(Cl-)。
将100mg化合物溶解在50ml 0.1M盐酸中并冻干所得的溶液。将剩余物溶解在50ml水中并再次冻干得到80mg盐酸盐，根据HPLC的纯度为93％。
实施例7-化学稳定性测试 将GLP-2类似物溶解在纯净水中并随后稀释在含有HCl、NaOH、H2O2或NH4HCO3的溶液中。在40℃孵育所述溶液以产生水解、脱酰胺和氧化产物。通过RP-HPLC分析样品并测定剩余的完整化合物的百分率作为相对稳定性的度量。通过LC-MS试验性地确定主要的降解产物。表3中列举了所用的肽。
表2.测试并比较化学稳定性的GLP-2类似物 化合物ZP1559、Gly2-GLP-2用作被测试的其它GLP-2类似物的参照。在GLP-2类似物中，以粗体显示序列中不同于参照化合物ZP1559的位置。表3中列举了所述序列。
根据其序列以及含有和不含有C端-K6延伸以配对形式列举化合物。
表3.Gly2-GLP-2和GLP-2类似物的序列 表4列举了实验中所用的化学品。
表4.用于分析方案的化学品和试剂 首先去除水中的矿物质使得电阻＞18MΩcm，然后将其通过Milli-Q系统(Millipore，Bedford，USA)。最后使Milli-Q纯化水(MQW)通过0.22-μm无菌滤器(Millipak 40 Gamma Gold，Millipore)。
将测试的GLP-2类似物和参照Gly2-GLP-2、ZP1559溶解在水中，随后稀释到含有HCl、NaOH、H2O2或NH4HCO3的溶液中。在40℃孵育所述溶液以分别产生水解、脱酰胺和氧化产物。通过RP-HPLC分析化合物中原始主峰的纯度并通过LC-MS由主峰和主要降解产物的质量确定特征。
胁迫溶液的制备 0.2M HCl 4mL MQW和1mL 1M HCl。
0.02M NaOH4mL MQW和1mL 0.1M NaOH。
0.2M NH4HCO3，pH80.79g NH4HCO3溶解在50mL MQW中。
1％H2O25.8mL MQW和0.2mL 30％H2O2。
样品落液； 首先将GLP-2类似物溶解在MQW中，浓度为4mg/mL，然后以1∶1比例(例如125μL加125μL)进一步稀释在所述胁迫溶液中。对于分别为0.1M HCl、0.01M NaOH、0.1M NH4HCO3和0.5％H2O2的胁迫条件，GLP-2类似物的终浓度为2mg/mL。
在通过RP-HPLC和LC-MS分析之前，在40℃下在黑暗中孵育所述溶液，然后稀释在洗脱液A中，浓度为0.5mg/mL(加入750μL)。
表5.胁迫测试的条件 RP-HPLC 在Agilent Technologies，Inc.的ChemStation(A.08.03[847]版)软件的Agilent Series 1100 HPLC系统上进行RP-HPLC分析。利用Agilent Technologies Revision B01.03软件将原始数据和峰整合结果存放到ChemStore C/S服务器上。
表6.RP-HPLC法 LC-MS 在由在线脱气设备、四元梯度泵、自动进样器、柱恒温器、UV检测器组成的Agilent Technologies 1100 HPLC仪器上进行分析性LC-MS分析。所述HPLC仪器与受控于来自MicroMass，UK的Masslynx 3.5软件的Micromass LCT(ESI-TOF)质谱仪相连。
表7.LC-MS法 表8.根据SOP22-3003的MS设置 表9中显示在胁迫条件下孵育后通过RP-HPLC测量的化合物纯度结果。现对于T＝0测量的纯度，该纯度是在胁迫溶液中孵育后剩余完整化合物的度量。这些结果不考虑通过该分析性RP-HPLC法未观察到的可能隐藏的降解产物。
通过LC-MS法试验性地确定胁迫试验样品中的主要降解产物。通过该LC-MS法未观察到母体化合物的任何异构体以及次要的降解产物。表11至15列举试验性的鉴定。
根据其序列以及含有和不含有C端-K6延伸以配对形式列举GLP-2类似物。
表9.在胁迫条件下孵育后观察到的测试化合物纯度 未列举在NaOH中孵育的化合物的结果，因为未能观察到稳定性的差异。通过LC-MS分析，降解产物和主峰都具有相同的质量；这些化合物可能随时间发生外消旋化。表9中的结果显示，被测试的GLP-2类似物一般比Gly2-GLP-2参照、ZP1559具有更好的化学稳定性。
酸水解中，除了ZP1820和ZP1834以外，测试的GLP-2类似物比Gly2-GLP-2参照、ZP1559更稳定。这主要是由于3位的氨基酸Asp。Glu而不是Asp可能将氨基酸3和4Asp-Gly之间的切割最小化。被测试的其它ZP GLP-2类似物确实具有大致相同的稳定性，并且不含有C端-K6的化合物、ZP1855、ZP1857和ZP1858的稳定性稍高。这种差异由33位氨基酸Asp来进行解释。在不含有C端-K6的化合物中，该氨基酸是C-末端，氨基酸32和33Tyr-Asp之间的切割比氨基酸33和33Asp-Lys之间的切割更慢。稳定性的差异是由于Asp而不是C端-K6。
在加速氧化(H2O2，还见表10和13)条件下，测试的GLP-2类似物比Gly2-GLP-2参照、ZP1559稳定得多。这可能是由于ZP1559中10位Met的氧化。ZP1855是一个例外，其显示无法解释的低稳定性。这可能是ZP1855批次特有的，需要进一步研究来解释。
促进脱酰胺(NH4HCO3)条件下的稳定性，测试的GLP-2类似物比Gly2-GLP-2参照、ZP1559更稳定。这可能是由于ZP1559中11位、16位和24位Asn这几个脱氨基位点在测试的GLP-2类似物序列中是不存在的。
通过LC-MS试验性地确定主要降解产物 表10.ZP GLP-2类似物和参照ZP1559中的主要切割位点 ZP1559HGD↓GS FSDEM N↓TILD NLAAR DFINW LIQTK ITD-OH ZP1820HGD↓GS FTSEL ATILDNLAAR DFIAW LIQTK K6-NH2 ZP1834HGD↓GS FTSEL ATILDNLAAR DFIAW LIQTK -NH2 ZP1846HGEGSFSSEL STILDALAAR DFIAW LIATK ITD↓K6-NH2 ZP1855HGEGSFSSEL STILDALAAR DFIAW LIATK IT↓D-NH2 ZP1848HGEGTFSSEL ATILDALAAR DFIAW LIATK ITD↓K6-NH2 ZP1857HGEGTFSSEL ATILDALAAR DFIAW LIATK IT↓D-NH2 ZP1849HGEGSFSSEL ATILDALAAR DFIAW LIATK ITD↓K6-NH2 ZP1858HGEGSFSSEL ATILDALAAR DFIAW LIATK IT↓D-NH2 用HCl胁迫的溶液 表11.在40℃和0.1MHCl中孵育12天的GLP-2类似物 na＝不可得，未计算或提示理论MW *质量差异是主峰或所提示化合物的测量MW与理论MW的差异 表12的结果显示被测试的GLP-2类似物和Gly2-GLP-2参照、ZP1559的测量分子量，对应于理论分子量。
ZP1559、ZP1820和ZP1834中最丰富的降解产物是氨基酸3和4；Asp和Gly之间的切割。对于具有C端-K6的化合物ZP1846、ZP1848和ZP1849，检测到了对应于在33至39位失去C端-K6(LyS6)的降解产物。对于不具有C端-K6的化合物ZP1855和ZP1857，检测到了对应于在33位失去C端Asp的降解产物。
检测到的次要降解产物是氨基酸15和16(Asp和Asn或Asp和Ala)、氨基酸4和5(Gly和Ser)、氨基酸21和22(Asp和Phe)之间的切割。
用H2O2胁迫的溶液 表12.在40℃和0.5％H2O2中孵育3天的GLP-2类似物 na＝不可得，未计算或提示理论MW *质量差异是主峰的测量MW与理论MW的差异 表13的结果显示测试的GLP-2类似物和Gly2-GLP-2参照、ZP1559的测量分子量对应于于理论分子量。对于ZP1559，观察到MW+16Da的主要降解产物，这可能是10位Met的氧化产物。对于ZP1820和ZP1834，观察到MW+18Da的主要降解产物。这可能归因于脱酰胺前体时的失水。此外，观察到MW-2Da的次要产物，可能在两个位点脱酰胺。在所有化合物中观察到MW+16Da的次要降解产物，可能是Trp的氧化。对于不具有C端-K6的化合物ZP1855、ZP1857和ZP1858，检测到MW-137Da和-65Da的次要降解产物，分别相应于在1位失去His和未鉴定的降解产物。
用NaOH胁迫的溶液 表13.在40℃和0.01MNaOH中孵育3天的GLP-2类似物 na＝不可得，未计算或提示理论MW *质量差异是主峰的测量MW与理论MW的差异 LC-MS分析显示每个化合物的所有峰都具有相同的分子量。这意味着最丰富的降解产物可能是序列中一个或多个氨基酸从L-到D-形的外消旋。主峰可隐藏一个或几个外消旋产物，因此未能确定残留的完整肽纯度。没有检测到来自切割的主要降解产物。
用NH4HCO3胁迫的溶液 表14.在40℃和pH8的0.1M NH4HCO3中孵育6天的GLP-2类似物 na＝不可得，未计算或提示理论MW *质量差异是主峰的测量MW与理论MW的差异 表14的结果显示测试的GLP-2类似物和Gly2-GLP-2参照、ZP1559的测量分子量，对应于理论分子量。对于ZP1559，观察到MW+1Da的次要降解产物，这可能是脱酰胺产物。对于ZP1820、ZP1834和ZP1846，观察到与主化合物MW相同的次要降解产物。它们可能是外消旋产物或脱酰胺作用。然而，本发明仪器的MS分辨率不足以确认或否决这一点。此外，这些化合物可能存在于其它化合物中，但是由于它们可能隐藏在主峰之下而未被检测到。
在水解、氧化和脱酰胺的胁迫条件下，所有测试的本发明GLP-2类似物具有比参照化合物Gly2-GLP-2、1559更好的化学稳定性。由于酸水解，化合物1820和1834的稳定性低于其余的6个候选化合物。当氨基酸A3是Glu而不是Asp时可见最高的化学稳定性。
除了不具有-K6的候选物具有稍好的稳定性以外，未观察到剩余的6个候选物的化学稳定性的显著差异，这主要归因于Asp之后的易变位点以及具有C端-K6的候选化合物中-K6的失去。
实施例8.在C57BL小鼠中筛选化合物的肠生长效应 在雄性C57BL小鼠中检测本发明化合物刺激肠生长的能力。在连续10天中每日两次对每组(n＝6)小鼠皮下给予30nmol/kg每种化合物。为了对比的目的，在相同的剂量方案中对其它组的动物给予等摩尔剂量的[Gly2]GLP-2或载体(磷酸缓冲盐水，pH7.4)。化合物最后一次给药后24小时处死小鼠，清空小肠(从幽门到盲肠)和结肠(肠远端至盲肠)并称重。为了校正体重(BW)的轻微差异，小肠(SI)和结肠的器官质量表达为相对于BW的值。已经报导非选择性参照化合物[Gly2]GLP-2在食道、胃、小肠和结肠中刺激胃肠生长并且评价了化合物引起的生长模式的差异，以下述公式计算化合物X的小肠-结肠敏感性指标 (SI/结肠)x/(SI/结肠)[Gly2]GLP-2％ 小肠-结肠敏感性指标大于或等于1.05的化合物认为对小肠具有相对选择性(表15)。
小肠-结肠敏感性指标小于或等于0.95的化合物认为对结肠具有相对选择性(表15)。
表15.选择性GLP-2类似物化合物列表 结果 基于所述肽剂量依赖性地提高SI质量，相对于等摩尔剂量非选择性参照化合物[Gly2] GLP-2的效应测定本发明化合物的肠生长效应。
该研究的结果证明，与[Gly2]GLP-2相比，在野生型GLP-2序列的8、16、24和/或28位具有氨基酸替换的GLP-2变体提高了C57BL小鼠中的生物活性。
实施例9.选定的化合物对C57BL小鼠肠生长的剂量-应答效应 选择1820、1855、1846、1858、1849、1848和1857为先导化合物，因为这些化合物相对于[Gly2]GLP-2(实施例8)都能提高小肠质量，并且在胁迫条件(实施例7)下相对于[Gly2]GLP-2提高化学稳定性。在雄性C57BL小鼠中检测了1820、1855、ZP1846、1858、1849、1848和1857对小肠质量的剂量-应答效应。在连续3天中每日两次对每组(n＝6)小鼠皮下给予5、15、45、135或405nmol/kg每种化合物。为了对比的目的，在相同的剂量方案中对其它组的动物给予等摩尔剂量的[Gly2]GLP-2或载体(磷酸缓冲盐水，pH7.4)。化合物最后一次给药后24小时处死小鼠，清空小肠(从幽门到盲肠)并称重以检测对小肠质量的影响。
结果 图1至5显示相对于参照化合物[Gly2]GLP-2的效应的1820、1855、1846、1858、1849、1848和1857对小肠质量的效应。在每个测试剂量下，将[Gly2]GLP-2对小肠质量的效应标准化为100％。基于所述肽能相对于等摩尔剂量的[Gly2]GLP-2的效应而剂量依赖性地提高SI质量来测定本发明的化合物1820、1855、1846、1858、1849、1848和1857对小肠生长的影响。基于这些发现，我们可推断与用[Gly2]GLP-2处理的小鼠相比，含有8个替换(GLP-21809的G2、E3、T5、L10、A11、A16、A24、A28)的GLP-2类似物能显著提高小肠重量。
具体地，与结肠相比，将Asp3替换为Glu、将Asn16替换为Ala和将Gln28替换为Ala以选择性方式使小肠重量提高(1839或1840与1809相比较)。因此，相对于结肠质量，三个氨基酸Asp3、Asn16以及Gln28的替换引起小肠重量的选择性提高。
此外，Asp8替换为丝氨酸导致选择性的额外提高，因此导致小肠重量的额外提高而不显著性影响结肠的重量(1818、1820、1844、1846、1848、 1849、1852、1853、1855、1858)。
图1至4显示实验结果，其中相对于参照化合物[Gly2]GLP-2地显示示例性化合物1846、1855、1848、1857、1849在SI-BW结肠-BW比的剂量应答上的效应。在每个测试剂量下，将[Gly2]GLP-2对在小肠质量上的效应标准化为100％。所有示例性化合物均共有8、16和/或28位的修饰，并且显示引起小场相对于结肠生长的选择性提高。
实施例10-1846、1848、1855和1857对施用5-FU小鼠中小肠萎缩的剂量-应答效应 小肠干细胞迅速的增殖率使得它们成为抗癌治疗中所使用治疗剂的细胞毒效应的敏感性靶标。因此，化学治疗剂5-氟尿嘧啶(5-FU)的临床应用经常与癌症患者中的小肠损伤(萎缩和腹泻)有关。之前我们已经显示，在连续4天中每日一次腹膜内(i.p)施用50mg/kg 5-FU诱发了C57BL小鼠中小肠的显著萎缩。在小鼠中研究了先导化合物1846、1848、1855和1857在5-FU诱发的小肠萎缩上的效应。之前我们已经显示，在连续4天中每日一次腹膜内(i.p)施用50mg/kg 5-FU诱发了C57BL小鼠中小肠的显著萎缩。5-FU之前施用1846、1848、1855或1857(每日两次，连续三天)并与5-FU一起施用四天。在之前显示有效刺激健康小鼠小肠生长的五个不同剂量(5、15、45、135和405nmol/kg)(实施例9)下施用每种先导化合物。为了对比目的，用405nmol/kg[Gly2]GLP-2处理一组动物。为了测定5-FU对小肠的影响，一组动物仅给予5-FU并维持不处理(5-FU对照)，另外一组动物仅给予载体(PBS对照)。
结果 相对于PBS对照，5-FU引起C57BL小鼠SI-BW和SI长度的显著降低。图6至9显示1846、1848、1855或1857对施用5-FU的小鼠SI-BW和SI长度的剂量-应答效应。还显示了405nmol/kg[Gly2]GLP-2的效应。1846、1848、1855或1857剂量依赖性地预防5-FU诱发的SI萎缩，并将SI-BW维持在与PBS对照相似的水平。等摩尔剂量的ZP1848、ZP1855和ZP1857对SI-BW显著地比405nmol/kg[Gly2]GLP-2更有效。1848和1857对SI-长度显著地比405nmol/kg[Gly2]GLP-2更有效。
实施例11.1846对施用5-FU的SD大鼠中小肠萎缩和腹泻的剂量应答效应 在SD大鼠中研究了临床候选化合物1846在5-FU诱导的小肠萎缩和腹泻上的效应。之前我们已经显示，腹膜内(i.p)施用75mg/kg5-FU(每日一次，四天)引起SD大鼠的显著小肠萎缩和腹泻。5-FU之前施用1846(16、80和400nmol/kg/天；n＝20只大鼠/剂量组)(每日两次，三天)并与5-FU一起施用四天。研究中包括5-FU对照和PBS对照。1846最后一次给药后24小时处死一个亚组的动物，以测定1846在小肠萎缩上的效应。为了测定1846在腹泻上的效应，在给药期间和额外6天中每日两次(早晨和傍晚)观察所有动物。每次观察期间，给每只动物打分(0，无腹泻，1(轻度)，肛门周围粪便污染，2(中度)，后肢和尾巴上有粪便污染，以及3(重度)，前肢和腹部上有粪便污染)，所述分数显示动物是否有腹泻以及腹泻的严重程度。
结果 相对于PBS对照，5-FU引起SD大鼠SI-BW和SI-长度的显著降低并引起腹泻。图10和11显示1846在5-FU诱导的小肠萎缩和腹泻上的剂量-应答效应。1846剂量依赖性地防止5-FU诱导的SI萎缩并将SI-BW和SI-长度维持在与对照相似的水平。在施用的最高剂量(400nmol/kg)下，1846降低施用5-FU大鼠的腹泻发生率和严重程度。
实施例12.1846对SD大鼠小肠的隐窝-绒毛长度和肌厚度的剂量应答效应 研究了临床候选化合物1846在SD大鼠小肠的隐窝-绒毛长度和肌厚度上的效应。静脉内推注施用1846(0.62、3.41或6.2mg/kg/天，n＝6只大鼠/剂量组)，每日一次，连续五天。施用最后剂量后24小时处死大鼠，并从空肠(胃十二指肠连接处远端30cm)和回肠(回盲连接处近端30cm)剪下1cm活检用于组织学处理。
结果 图12显示1846对空肠和回肠隐窝-绒毛长度和肌厚度的剂量-应答效应。1846剂量依赖性地提高空肠平均隐窝-绒毛长度以及回肠的回肠肌厚度。
实施例13.1848对吲哚美辛诱导的克罗恩病模型小肠类症标记物的作用 克罗恩病是引起小肠短暂性间断性炎症的慢性疾病。研究了GLP-2类似物1848在吲哚美辛诱导的克罗恩病模型中小肠炎症上的效应。之前我们显示施用吲哚美辛(皮下，每日一次，两天)诱发以溃疡为特征的小肠炎症以及促炎细胞因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)的增加。为了测定ZP1848对溃疡的作用，在吲哚美辛首次给药之前给予1848(8、40和200nmol/kg，皮下，每日两次(9:00和16:00))，并且与吲哚美辛一起再施用两天。皮质类固醇泼尼松龙(10mg/kg，口服)用作阳性对照，因为皮质类固醇普遍用于治疗克罗恩病中的活跃炎症。此外，对一组动物给予1848(200nmol/kg)和泼尼松龙以测定组合治疗的效果。1848最后一次给药后24小时处死动物，轻轻地将小肠冲洗干净并固定。为了测定溃疡程度，沿系膜小肠对向部边缘剪开肠，悬挂在聚丙烯盘中并用Alcian Green 3BX进行表面染色。从幽门开始仔细检查小肠并使用标准尺(精密度0.5mm)测量所有溃疡的形状(圆形和线形)和大小(圆形溃疡直径，线形溃疡长×宽)。溃疡定义为缺少上皮表面的面积。最后，通过所有单个溃疡的面积总和来计算每只动物的总损伤面积。
为了测定1848对小肠中TNF-α浓度的影响，如上所述给予1848和吲哚美辛。然而在处死时将小肠分成相同长度的三段(近端、中部和远端)。使用市售的ELISA试剂盒检测每个单独段的TNF-α浓度。
结果 与对照组相比，吲哚美辛强烈诱导小肠溃疡(估计的溃疡程度为333±21mm2比10mm2)。图13显示1846对估计的溃疡程度(mm2)的影响。1848(8nmol/kg、40nmol/kg和200nmol/kg)处理显著降低溃疡程度(分别为230+12mm2、216±17mm2和178+17mm2，与吲哚美辛的p＜0.001)。在所用的最高剂量(200nmol/kg)下，ZP1848比阳性对照泼尼松龙更有效(p＜0.05)。
与对照动物(34±7pg/mg蛋白质，与吲哚美辛的p＜0.05)相比，吲哚美辛使得远端节段中TNF-α的组织水平提高约2.9倍(97±14pg/mg蛋白质)。图14显示1846对小肠TNF-α浓度的影响。1848(8、40或200nmol/kg)处理显著降低TNF-α的组织水平(分别为45±14pg/mg蛋白质、44±9pg/mg蛋白质和45±7pg/mg蛋白质)，3种剂量之间没有显著差异。
与对照动物(34±6pg/mg蛋白质，与吲哚美辛的p＜0.05)相比，吲哚美辛使得中部节段的TNF-α的组织水平提高约3.2倍(108±9pg/mg蛋白质)。1848(40或200nmol/kg)分别显著降低TNF-α的组织水平(与吲哚美辛的p＜0.05)。
与对照动物(45±3pg/mg蛋白质，与吲哚美辛的p＜0.05)相比，吲哚美辛使得远端节段的TNF-α组织水平提高约1.7倍(75±5pg/mg蛋白质)。1848对远端节段的TNF-α水平具有抑制效应，但是与其它节段相比，该效应较不显著。在全部三个节段中仅使用泼尼松龙均不显著影响TNF-α的组织水平，但是泼尼松龙的施用提高了1848(200nmol/kg)对TNF-α水平的抑制效应(仅在远端节段中)。
实施例14 在组氨酸、甘露醇和乙酸盐制剂中配制10mg/mL ZP1846 1.在1L烧杯中装入800mL(WFI) 2.在烧杯中称出13.964g L-组氨酸并加入所述1L烧杯中 3.在烧杯中称出32.200g甘露醇并加入所述1L烧杯中 4.直接将629μL 100％乙酸加入所述1L烧杯中，或称出12.58g 5％(重量/体积)乙酸溶液并加入所述烧杯中 6.补充至约950mL 7.测量pH，必要时用10％乙酸或0.25M组氨酸调整至pH6.9至7.0 8.称出11.312g药物物质(肽含量88.4％)并加入所述烧杯中 9.补充至1.015kg(＝约1000mL)并测量pH、摩尔渗透压浓度和密度 10.通过串联连接的两个无菌滤器使所述制剂过滤除菌 11.在LAF工作台中以0.5mL的等分试样将所述制剂分装到2mL已批准药用的瓶中 12.不完全密封地装上冻干的塞子，然后装入已灭菌并预冷却至4℃的冷冻干燥器中 13.冷冻干燥周期进行40.5小时，由冷冻、退火、初级干燥和次级干燥阶段组成。在冷冻干燥器的室中在氮中塞住所述瓶。
14.对所述瓶进行分选，应用密封物(overseal)和弯折封口(crimp)。
实施例15 在组氨酸、精氨酸、甘露醇和海藻糖中配制10mg/mL ZP1846 1.将800mL(WFI)水装入1L烧杯中 2.在烧杯中称出6.206g L-组氨酸并加入所述1L烧杯中 3.在烧杯中称出3.484g L-精氨酸并加入所述1L烧杯中 4.在烧杯中称出33.46g甘露醇并加入所述1L烧杯中 5.在烧杯中称出11.16g海藻糖并加入所述1L烧杯中 6.补充至约950mL 7.测量pH，必要时用10％乙酸或0.25M组氨酸调节至pH6.9至7.0 8.称出11.312g药物物质(肽含量88.4％)并加入所述烧杯中 9.补充至1.015kg(＝约1000mL)并测量pH、摩尔渗透压浓度和密度 10.通过串联连接的两个无菌滤器将所述制剂过滤除菌 11.在LAF工作台中以0.5mL的等分试样将所述制剂分装到2mL已批准药用的瓶中 12.不完全密封地装上冻干的塞子，然后装入已灭菌并预冷却至4℃的冷冻干燥器中 13.冷冻干燥周期进行40.5小时，由冷冻、退火、初级干燥和次级干燥阶段组成。在冷冻干燥器的室中在氮中塞住所述瓶。
14.对所述瓶进行分选，应用密封物(overseal)和弯折封口(crimp)。
尽管已经结合上述示例性实施方案描述了本发明，但是在给出这一公开内容后，许多等价的改良和变化对于本领域技术人员是显而易见的。因此，认为所提出的本发明示例性实施方案是用于说明而非限制。可对所述实施方案进行多种变化而不背离本发明的精神和范围。将本文引用的所有文献均明确地以参考方式并入本文。
权利要求
1.通式I代表的胰高血糖素样肽2(GLP-2)类似物或者其可药用盐或衍生物
R1-Z1-His-X2-X3-Gly-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-Ala-X19-X20-
X21-Phe-Ile-X24-Trp-Leu-Ile-X28-Thr-Lys-X31-X32-X33-Z2-R2
其中
R1为氢、C1-4烷基(例如甲基)、乙酰基、甲酰基、苯甲酰基或三氟乙酰基
X2为Gly、Ala或Sar
X3为Glu或Asp
X5为Ser或Thr
X6为Phe或Pro
X7为Ser或Thr
X8为Asp或Ser
X9为Glu或Asp
X10为Met、Leu、Nle或氧化稳定的Met取代氨基酸
X11为Asn、Ala、Lys或Ser
X12为Thr或Lys
X13为Ile、Glu或Gln
X14为Leu、Met或Nle
X15为Asp或GIu
X16为Asn或Ala
X17为Leu或Glu
X18为Ala或Aib
X19为AIa或Thr
X20为Arg或Lys
X21为Asp或Ile
X24为Asn、Ala或Glu
X28为Gln、Ala或Asn
X31为Pro、Ile或缺失
X32为Thr或缺失
X33为Asp、Asn或缺失
R2为NH2或OH；
Z1和Z2独立地为不存在或选自Ala、Leu、Ser、Thr、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、His、Met和Orn的3至20个氨基酸单位的肽序列；并且其中所述GLP-2类似物包含选自以下的一种或多种替换X8为Ser和/或X16为Ala和/或X24为Ala和/或X28为Ala。
2.通式II代表的权利要求1所述GLP-2类似物或者其可药用盐或衍生物
R1-Z1-His-Gly-X3-Gly-X5-Phe-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-Ala-X19-Arg-
Asp-Phe-Ile-X24-Trp-Leu-Ile-X28-Thr-Lys-X31-X32-X33-Z2-R2
其中
R1为氢、C1-4烷基(例如甲基)、乙酰基、甲酰基、苯甲酰基或三氟乙酰基
X3为Glu或Asp
X5为Ser或Thr
X7为Ser或Thr
X8为Asp或Ser
X9为Glu或Asp
X10为Met、Leu、Nle或氧化稳定的Met取代氨基酸
X11为Asn、Ala、Lys或Ser
X12为Thr或Lys
X13为Ile、Glu或Gln
X14为Leu、Met或Nle
X15为Asp或Glu
X16为Asn或Ala
X17为Leu或Glu
X19为Ala或Thr
X24为Asn或Ala
X28为Gln、Ala或Asn
X31为Pro、Ile或缺失
X32为Thr或缺失
X33为Asp或缺失
R2为NH2或OH；
Z1和Z2独立地为不存在或选自Ala、Leu、Ser、Thr、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、His、Met和Orn的3至20个氨基酸单位的肽序列；并且其中所述GLP-2类似物包含选自以下的一种或多种替换X8为Ser和/或X16为Ala和/或X24为Ala和/或X28为Ala。
3.通式III代表的权利要求1或权利要求2所述GLP-2类似物或者其可药用盐或衍生物
R1-Z1-His-Gly-X3-Gly-X5-Phe-X7-X8-Glu-X10-X11-Thr-Ile-Leu-Asp-X16-Leu-Ala-Ala-Arg-
Asp-Phe-Ile-X24-Trp-Leu-Ile-X28-Thr-Lys-X31-X32-X33-Z2-R2
其中
R1为氢、C1-4烷基(例如甲基)、乙酰基、甲酰基、苯甲酰基或三氟乙酰基
X3为Glu或Asp
X5为Ser或Thr
X7为Ser或Thr
X8为Asp或Ser
X10为Met、Leu、Nle或氧化稳定的Met取代氨基酸
X11为Asn、Ala、Lys或Ser
X24为Asn或Ala
X28为Gln或Ala
X31为Pro或缺失
X32为Thr或缺失
X33为Asp或缺失
R2为NH2或OH；
Z1和Z2独立地为不存在或选自Ala、Leu、Ser、Thr、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、His、Met和Orn的3至20个氨基酸单位的肽序列；并且其中所述GLP-2类似物包含选自以下的一种或多种替换X8为Ser和/或X16为Ala和/或X24为Ala和/或X28为Ala。
4.权利要求1至3中任一项的GLP-2类似物，其中所述GLP-2类似物与野生型GLP-2(1-33)具有至少60％的氨基酸序列同一性，并且在体内具有引起小肠质量增加的生物活性。
5.前述权利要求中任一项的GLP-2类似物，其中所述GLP-2类似物包含X8、X16、X24和/或X28中一个以上位置的替换和/或一个或多个所述替换与X3、X5、X7、X10和/或X11中一个或多个位置上的替换组合。
6.权利要求5的GLP-2类似物，其中所述X10位上的替换为Leu、Nle或氧化稳定的Met取代氨基酸，例如Met(O)或Met(O)2。
7.权利要求5的GLP-2类似物，其中所述X11位上的替换为Ala、Ser或Lys。
8.权利要求4的GLP-2类似物，其中所述GLP-2类似物包含一种或多种以下替换
Ser8，Ala16
Ser8，Ala24
Ser8，Ala28
Ala16，Ala24
Ala16，Ala28
Ala24，Ala28
Ser8，Ala16，Ala24
Ser8，Ala16，Ala28
Ser8，Ala24，Ala28
Ala16，Ala24，Ala28
Ser8，Ala16，Ala24，Ala28。
9.权利要求5的GLP-2类似物，其中所述GLP-2类似物包含一种或多种下述替换
Glu3，Leu10，Ala11，24
Glu3，Thr5，Leu10，Ser11，Ala16，24，28
Glu3，Thr5，Leu10，Lys11，Ala16，24，28
Glu3，Thr5，Ser8，Leu10，Lys11，Ala16，24，28
Glu3，Thr5，Ser8，11，Leu10，Ala16，24，28
Glu3，Thr5，Ser8，11，Leu10，Ala16，24，28
Glu3，Ser8，11，Leu10，Ala16，24，28
Glu3，Leu10，Ser11，Ala16，24，28
Glu3，Leu10，Lys11，Ala16，24，28
Glu3，Thr5，Leu10，Ala11，16，24，28
Glu3，Thr5，Leu10，Ala11，16，24，28，Ile21
Glu3，Thr5，Ser8，Leu10，Ala11，16，24，28
Glu3，Ser8，Leu10，Ala11，16，24，28
Glu3，Leu10，Ala11，16，24，28
Thr7，Leu10，Ala11，24
Thr7，Leu10，Lys11，Ala24
Thr7，Leu10，Ser11，Ala24
Thr7，Leu10，Ser8，11，Ala24
Thr7，Ser8，Leu10，Ala11，24
Thr7，Ser8，Leu10，Lys11，Ala24
Ser8，Leu10，Ala11，24
Leu10，Ala24
Leu10，Ala11，Ala24
Leu10，Ala11，24，28
Leu10，Ala11，16，24，28
Leu10，Lys11，Ala24
Leu10，Ser11，Ala24
Leu10，Ser8，11，Ala24；或X31-X33中一个或多个位置上的缺失。
10.前述权利要求中任一项的GLP-2类似物或者其可药用盐或衍生物，所述GLP-2类似物如本文表1所公开。
11.权利要求10的GLP-2类似物，所述GLP-2类似物为
1834 H-HGDGSFTSELATILDNLAARDFIAWLIQTK-NH2
1846 H-HGEGSFSSELSTILDALAARDFIAWLIATKITDK6NH2
1847 H-HGEGSFSDELSTILDALAARDFIAWLIATKITDK6-NH2
1848 H-HGEGTFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITDK6-NH2
1849 H-HGEGSFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITDK6-NH2
1855 H-HGEGSFSSELSTILDALAARDFIAWLIATKITD-NH2
1857 H-HGEGTFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITD-NH2
1858 H-HGEGSFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITD-NH2。
12.权利要求1至9中任一项的GLP-2类似物，其中所述GLP-2类似物包含X3、X7、X16、X24、X28、X31、X32和/或X33中一个以上位置上的替换。
13.权利要求12的GLP-2类似物或者其可药用盐或衍生物，其中所述GLP-2类似物包含一种或多种选自以下的替换X3为Glu、X7为Ser、X16为Ala、X24为Ala、X28为Ala、X31为Ile、X32为Thr和X33为Asp，并任选地缺失了X31、X32和X33位置上的氨基酸残基。
14.权利要求12或权利要求13的GLP-2类似物或者其可药用盐或衍生物，所述GLP-2类似物为
1827 H-HGDGSFTDELSTILDNLAARDFIAWLIQTKKKKKKK-NH2
1844 H-HGEGTFSSELSTILDALAARDFIAWLIATKITDKKKKKK-NH2
1845 H-HGEGTFSDELSTILDALAARDFIAWLIATKITDKKKKKK-NH2
1846 H-HGEGSFSSELSTILDALAARDFIAWLIATKITDKKKKKK-NH2
1848 H-HGEGTFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITDKKKKKK-NH2
1849 H-HGEGSFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITDKKKKKK-NH2
1850 H-HGEGSFSDELKTILDALAARDFIAWLIATKITDKKKKKK-NH2
1851 H-HGEGSFSDELKTILDALAARDFIAWLIATKITDKKKKKK-NH2
1852 H-HGEGTFSSELKTILDALAARDFIAWLIATKITDKKKKKK-NH2
1855 H-HGEGSFSSELSTILDALAARDFIAWLIATKITD-NH2
1857 H-HGEGTFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITD-NH2
1858 H-HGEGSFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITD-NH2
1859 H-HGEGSFSDELKTILDALAARDFIAWLIATKITD-NH2。
15.权利要求1至9中任一项的GLP-2类似物，其中所述GLP-2类似物包含X3、X8和/或X24中一个以上位置上的替换。
16.权利要求15的GLP-2类似物或者其可药用盐或衍生物，其中所述GLP-2类似物包含一种或多种选自以下的替换X3为Asp、X8为Asp和X24为Ala，并任选地缺失了X31、X32和X33位置上的氨基酸残基。
17.权利要求15或权利要求16的GLP-2类似物或者其可药用盐或衍生物，所述GLP-2类似物为
1830 H-HGDGSFSDELSTILDNLAARDFIAWLIQTK-NH2
1831 H-HGDGSFTDELSTILDNLAARDFIAWLIQTK-NH2
1835 H-HGDGSFSDELKTILDNLAARDFIAWLIQTK-NH2
1836 H-HGDGSFTDELKTILDNLAARD FIAWLIQTK-NH2
1839 H-HGDGSFSDELATILDNLAARDFIAWLIQTKITDKKKKKK-NH2
1840 H-HGDGSFSDELATILDNLAARDFIAWLIQTKITD-NH2
1841 H-HGDGSFSDELATILDNLAARDFIAWLIQTK-NH2
1843 H-HGDGSFTDELATILDNLAARDFIAWLIQTK-NH2。
18.权利要求1至9中任一项的GLP-2类似物，其具有X3、X33、X10、X11、X16和/或X24中一个或多个位置上的替换。
19.前述权利要求任一项的GLP-2类似物，用于治疗。
20.药物组合物，其包含与载体混合的前述权利要求中任一项的GLP-2类似物或者其盐或衍生物。
21.权利要求20的药物组合物，其中所述GLP-2类似物为可药用酸加成盐。
22.权利要求20或权利要求21的药物组合物，其被配制成适于注射或输注的液体，或被配制成使所述GLP-2类似物缓慢释放。
23.权利要求1至18中任一项的GLP-2类似物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗和/或预防胃和肠相关病症。
24.权利要求23的用途，其中所述胃和肠相关病症为溃疡、消化病症、吸收不良综合征、短肠综合征(short gut syndrome)、盲管综合征、炎性肠病、腹型斯泼卢腹泻(例如由麸质诱发的肠病或乳糜泻病引起)、热带型斯泼卢腹泻、低丙种球蛋白血症型斯泼卢腹泻、肠炎、局限性肠炎(克罗恩病)、溃疡性结肠炎、小肠损伤或短肠综合征(short bowel syndrome)。
25.权利要求23的用途，其中所述胃和肠相关病症为放射性肠炎、传染性肠炎或感染后肠炎，或者由于毒剂或者其它化学治疗剂引起的小肠损伤。
26.权利要求1至18中任一项的GLP-2类似物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗和/或预防化学疗法或放射治疗的副作用。
27.权利要求26的用途，其中所述化学疗法的副作用是腹泻、腹部痛性痉挛、呕吐或化学疗法治疗引起的肠上皮结构和功能损伤。
28.权利要求1至18中任一项的GLP-2类似物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗新生儿、骨质疏松或DPP-IV(二肽基肽酶-IV)介导的病症。
29.权利要求1至18中任一项的GLP-2类似物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗和/或预防与营养不良相关的病症。
30.权利要求29的用途，其中所述与营养不良相关的病症为恶病质或厌食症。
31.核酸分子，其包含编码权利要求1至18中任一项的GLP-2类似物的核酸序列。
32.表达载体，其包含与指导其表达的控制序列组合的权利要求31所述核酸序列。
33.已转化权利要求32所述表达载体的宿主细胞。
34.生产权利要求1至18中任一项的GLP-2类似物的方法，所述方法包括在适于表达GLP-2类似物的条件下培养权利要求22的宿主细胞以及纯化这样生产的GLP-2类似物。
35.根据权利要求31的核酸分子、根据权利要求32的表达载体或根据权利要求33的宿主细胞，用于治疗。
36.根据权利要求31的核酸分子、根据权利要求32的表达载体或根据权利要求33的宿主细胞在制备药物中的用途，所述药物用于治疗和/或预防胃和肠相关病症，或者用于治疗和/或预防化学疗法或放射治疗的副作用，或者用于治疗新生儿、骨质疏松或DPP-IV(二肽基肽酶-IV)介导的病症。
37.治疗有此需要的患者中胃和肠相关病症的方法，所述方法通过施用有效量的权利要求1至17中任一项的GLP-2类似物、根据权利要求31的核酸分子、根据权利要求32的表达载体或根据权利要求33的宿主细胞来实现。
38.权利要求37的方法，其中所述胃和肠相关病症为溃疡、消化病症、吸收不良综合征、短肠综合征(short gut syndrome)、盲管综合征、炎性肠病、腹型斯泼卢腹泻(例如由麸质诱发的肠病或乳糜泻病引起)、热带型斯泼卢腹泻、低丙种球蛋白血症型斯泼卢腹泻、小肠炎、局限性肠炎(克罗恩病)、溃疡性结肠炎、小肠损伤或短肠综合征(short bowel syndrome)。
39.权利要求37的方法，其中所述胃和肠相关病症为放射性肠炎、传染性肠炎或感染后肠炎，或者由于毒剂或者其它化学治疗剂引起的小肠损伤。
40.在有此需要的患者中治疗或预防化学疗法或放射疗法副作用的方法，所述方法包括施用有效量的权利要求1至18中任一项的GLP-2类似物、根据权利要求31的核酸分子、根据权利要求32的表达载体或根据权利要求33的宿主细胞。
41.权利要求40的方法，其中所述化学疗法副作用为腹泻、腹部痛性痉挛、呕吐或由化学疗法治疗引起的肠上皮结构或功能损伤。
42.在需要其治疗的患者中治疗新生儿病症、肥胖、骨质疏松或DPP-IV(二肽基肽酶-IV)介导的病症的方法，所述方法包括施用有效量的权利要求1至18中任一项的GLP-2类似物、根据权利要求31的核酸分子、根据权利要求32的表达载体或根据权利要求33的宿主细胞。
43.治疗药盒，其包含癌症化学疗法药物以及根据权利要求1至18中任一项的GLP-2类似物、根据权利要求31的核酸分子、根据权利要求32的表达载体或根据权利要求33的宿主细胞，其中每一种均任选地与可药用载体组合。
44.药物组合物，其包含与可药用载体组合的癌症化学疗法药物以及根据权利要求1至18中任一项的GLP-2类似物、根据权利要求31的核酸分子、根据权利要求32的表达载体或根据权利要求33的宿主细胞。
全文摘要
本文公开了GLP-2类似物，与[hGly2]GLP-2相比，所述GLP-2类似物包含一个或多个替换并且提高了体内生物活性和/或提高了化学稳定性，例如通过体外稳定性测定评估的化学稳定性。更具体地，本文公开的优选GLP-2类似物包含野生型GLP-2序列8、16、24和/或28位中一个或多个位置上的替换和/或31至33位氨基酸中一个或多个缺失和/或N端或C端稳定肽序列的添加，其中所述替换任选地与2位(如说明书中所述)和3、5、7、10以及11位中的一个或多个位置上的其他替换组合。所述类似物尤其可用于预防或治疗胃和肠相关病症以及用于减轻化学疗法的副作用。
文档编号C07K14/605GK101171262SQ200680015213
公开日2008年4月30日 申请日期2006年5月4日 优先权日2005年5月4日
发明者比亚内·杜·拉森, 伊薇特·米亚塔·彼得森, 基尔斯滕·埃贝霍伊 申请人:西兰制药公司