。基于纳米颗粒的总重量，靶向配体合适的含 量为大约〇? 00001~Iwt%。
[0071] 为了证明这个概念，本发明人已制备了包含光敏剂、纳米颗粒和靶向配体的纳米 光药物。选择间-四羟基苯基二氢卟吩（m-THPC/F〇SCan)和二氢卟吩e6(Ce6)作为光敏药 物，选择纳米微粒的二氧化硅作为纳米颗粒，选择奥曲肽作为靶向配体。奥曲肽是合成的生 长抑素类似物。许多神经内分泌肿瘤和（活化的）免疫细胞都表达高密度的生长抑素受体 (sst)。本领域技术人员明白可以改变对光敏剂、纳米颗粒和靶向配体的选择。为证实该方 法的有效性，在实验室阶段，本发明人已将用如此方法制备的靶向纳米光药物应用于各种 水性介质和体外sst阳性（K562细胞，人类骨髓细胞系）以及野生型细胞中。以下实施例 中所述的，结合物的体外吸收和激发光谱、单线态氧量子产率数据和细胞增殖测定证实了 这些纳米光药物表现出所期望的疗效。重要的是注意到本发明人设想可以采用相似的方法 来靶向其它受体，并且对光敏剂和纳米颗粒的选择并不挑剔。
[0072] 本发明提供了一种新型的纳米光药物，该药物能够在体内靶向癌细胞、利用双模 荧光和磁共振成像来增强肿瘤对比度、以及在可见光照射下通过可控传输的活性氧簇来破 坏癌细胞。
[0073] 本发明的一个特征是将光敏剂以期望的准聚集方式与纳米颗粒结合，以及发现这 改变了光敏剂的物理化学性质，使得光敏剂适用于有效的靶向光动力学治疗。此结合可产 生准聚集状态的光敏剂。与自由非结合药物相比，该准聚集状态的光敏剂能更好地吸收穿 透组织波长的光，以及在光照射时，容许可控地释放活性氧簇，这个发现是出乎预料的。本 发明的治疗组合物可以与靶向配体和磁对比功能剂相结合，这样可以支持成像辅助光动力 学治疗的应用，这是本发明的一个特殊的优势。
[0074] 制各本发_纳米光药物的方法
[0075] 根据纳米颗粒的类型、以及光敏剂和纳米颗粒基质（用于制备纳米颗粒的材料） 的化学性质，本发明的纳米光药物可以采用许多不同方式来制备。
[0076] 至关重要的是，光敏剂以准聚集状态与纳米颗粒相结合。正如本文中所示，可以通 过在低温（例如20-80°C)下使前体材料从溶液中沉淀成为纳晶或者通过高温（热）处理 而获得合适的纳米颗粒。优选地，通过从溶液或者胶体中沉淀获得纳米颗粒。在合适的条件 下发生沉淀形成纳米颗粒的合适的前体材料包括但不限于：金属硫化物、金属磷酸盐和金 属氧化物、以及其组合，诸如硅酸盐和磷酸钙。一种特别优选的方法是本领域已知的用于制 备胶体二氧化硅颗粒的方法。颗粒可以是无定形结晶或者完全晶化。金属硫化物、金属磷 酸盐和/或金属氧化物颗粒可以单纯地使用或者覆盖或结合高分子材料形成陶瓷使用。本 发明的纳米颗粒掺杂有光敏剂、发光材料和磁性材料，优选地是在形成颗粒期间包含进去。
[0077] 优选地，光敏剂以共价键与纳米颗粒相结合。因此，制备二氧化硅纳米颗粒的话， 适当地（并且优选地）制备硅酸盐反应性的光敏剂。硅烷偶联剂非常适于用作光敏剂与硅 酸盐之间的交联剂。氨基丙基三乙氧基硅烷（APTS)非常适于用作与硅酸盐反应的化合物， 以产生具有胺官能团的硅酸盐。
[0078] 在纳米颗粒是硅酸盐的一个实施例中，制备本发明纳米光药物的方法中的一个步 骤是提供氨反应性光敏剂。为了达到此目的，通常在溶剂DMSO中，使光敏剂与摩尔数过量 的碳二亚胺（如EDC(EDAC))反应，优选在丁二酰亚胺（如磺基NHS)存在下，适当地活化含 羧基的光敏剂（每个Ce6分子具有三个羧基）。在此反应中，使光敏剂上的羧基活化，生成 氨反应性中间体，如氨反应性磺基-NHS酯类。合适地，活化反应容许进行约为1~10小时， 通常约为4小时，而产生氨反应性光敏剂。可选地，利用凝胶过滤法对该产物进行纯化。
[0079] 在这种实施例中制备的第二步骤合适地是使氨反应性光敏剂与氨基丙基三乙氧 基硅烷（APTS)反应而产生硅酸盐反应性光敏剂（官能化的光敏剂）。合适地，此偶联反应 在暗处、室温下进行3~4小时。由此步骤所形成的化合物的一个例子是Ce6-APTS。
[0080] 在下一个步骤中，使硅酸盐反应性光敏剂，例如Ce6-APTS,与用于利用溶胶-凝 胶法合成纳米结构二氧化硅粉末的正硅酸酯前体物，诸如正硅酸四乙酯（四乙氧基硅烷， TEOS)和正娃酸四甲醋（TetramethylOrthosilicate，TMOS)(四甲氧基硅烷）反应，而产 生结合光敏剂的正硅酸酯（例如Ce6-TEOS或者Ce6-TMOS)。适合地，此结合反应在99%乙 醇中进行2~3小时。结合光敏剂的正硅酸酯形成纳米颗粒器件的前体，其中埋入硅烷偶 联的准聚集光敏剂，而形成本发明的纳米光药物。通过在溶胶-凝胶反应中使用这些结合 光敏剂的正硅酸酯前体而获得本发明的纳米颗粒。
[0081] 溶胶-凝胶反应中的初始阶段涉及正硅酸酯前体的专一性水解，以及水解产物的 缩合而形成小（3~4个硅）颗粒，该小颗粒聚集而形成较大的胶体氧化硅颗粒，较大胶体 氧化硅颗粒可最终缩合而形成硅胶。然而，优选地这后一阶段不是本发明方法的一部分。该 颗粒具有大约90~IOOnm的最终尺寸，并且在缺酸的条件下通常不缩合形成凝胶。结合光 敏剂的正硅酸酯前体（例如结合Ce6-的TEOS和/或TMOS前体）的水解和缩合产生纳米 大小的氧化硅粉末，其中光敏剂共价键合在氧化硅基质上。
[0082] 通过向乙醇介质中加入少量的水和强碱，如NH4O4或其它胺源或者NaOH，可实现结 合&6的TEOS和/或TMOS前体在水溶液中的水解。接着，对此水溶液进行超声波处理，例 如以2分钟为间隔进行10分钟的超声波处理，超声波处理导致与氧化硅基质复合的准聚 集光敏剂的纳米颗粒沉淀。然后，可通过离心将如此沉淀出的纳米光药物颗粒从水性介质 (通常是乙醇/水/胺的混合物）中分离出来，并且可选地，用水清洗并再分散于PBS或水 中。
[0083] 尽管在上述实施例中，原则上APTS改性的硅酸盐前体可以与氨反应性光敏剂发 生反应，但优选的是使偶联APTS的光敏剂与硅酸盐前体反应，因为这导致光敏剂以更有利 的准聚集的状态并入生长中的纳米颗粒中。
[0084] 因此，优选地，给光敏剂提供与纳米颗粒前体共价连接的官能团，从而产生官能化 的光敏剂。本领域技术人员对于使分子（如光敏剂）与纳米颗粒前体结合的可能性是熟知 的。这些技术一般包括将氨基_、硅烷_、巯基_、羟基-和/或环氧基官能团引入光敏剂，以 及随后将光敏剂与纳米颗粒前体结合，可选地使用交联剂。当更一般地提及光敏剂的氨基 烷基硅烷化的这种实施例时，制备与根据本发明一个实施例的纳米颗粒前体共价结合的官 能化光敏剂的方法，也可描述成使用起连接剂作用的双官能单体，将光敏剂与纳米颗粒前 体物相连接。
[0085] 非常合适地，双官能单体可具有两种不同的化学官能团，以便一种官能团能够与 纳米颗粒前体反应，而另一种官能团能够与光敏剂的官能化基团反应。
[0086] 在如下条件下，将官能化的光敏剂与纳米颗粒前体混合在溶液或悬浮液中：（i) 容许光敏剂以共价键与纳米颗粒前体共价连接从而形成结合光敏剂的纳米颗粒前体，以及 (ii)能够经由所述纳米颗粒前体的分子间连接形成纳米颗粒前体复合物，所述纳米颗粒前 体复合物聚集并通过随后的缩合和聚集步骤而形成纳米颗粒。优选地，步骤（i)可在步骤 (ii)之前发生。这导致光敏剂以准聚集状态与纳米颗粒结合。
[0087] 另外，在制备结合光敏剂的纳米颗粒期间或之后，可用发光标记物和/或磁对比 标记物掺杂结合光敏剂的纳米颗粒。优选地以如下所述方式实施该结合步骤。
[0088] 发光量子点-掺杂的纳米光药物
[0089] 用发光材料掺杂纳米颗粒的方法通常是按如下方式实施。首先，以如上所述方法 制备结合光敏剂的纳米颗粒前体。在此前体的水解和缩合期间，通过将标记物添加至水解 和缩合溶液中，而将发光标记物掺杂入纳米基质中。然后，施加条件以通过所述纳米颗粒 前体的分子间缩合形成纳米颗粒前体复合物，且所述纳米颗粒前体复合物聚集以形成纳米 颗粒。在正硅酸酯前体的情况下，这些包括提供例如1~5%的NH4O4。适当量的发光标记 物是例如在沉淀溶液中的〇. 01UMZnS:Mn2+。10分钟的超声波处理导致与准聚集的&6和 ZnS:Mn2+量子点（仍然埋在纳米颗粒基质内）复合的二氧化硅纳米颗粒发生沉淀。通过离 心将沉淀出的掺杂纳米光药物从介质中分离出来，并且优选地清洗并储存在PBS中。就本 发明纳米光药物的给药而言，优选将该器件悬浮于PBS中。
[0090] 掺杂磁对比剂的纳米光药物
[0091] 用磁对比剂掺杂纳米颗粒的方法与上述发光标记物的方法基本相同。首先，以 如上所述方法制备结合光敏剂的纳米颗粒前体。将磁对比剂的前体例如〇. 001~10% GcT(GdNO3)或 0? 001 ~10% (Mn2+)]^(：12或 0? 001 ~10%Fe3+(FeCl3)加入至形成纳米颗 粒的水解和缩合溶液中。例如，在适当的条件下，使用硝酸钆导致与准聚集光敏剂结合并掺 杂有Gd3+(仍然埋在纳米颗粒基质非晶相内）的纳米颗粒的沉淀。通过离心将沉淀出的纳 米颗粒从介质中分离出，并且优选地在使用前对纳米颗粒进行清洗。
[0092] 本发_的应用
[0093] 靶向治疗是药物的中心目的，对靶向治疗部位周围正常组织的损伤最小化是非常 重要的。实际上，光动力学治疗可以应用于体内的任何部位。虽然，光照后，光动力学治疗 会引起系统免疫反应，但活性氧簇的作用半径远远小于单个细胞的半径。实际上，光敏剂结 合物没有暗毒性，因此局部选择性（在光照范围内）提供显著的机会。没有细胞或组织对 高浓度活性氧簇有抵抗力或者是已经表现出形成抵抗力。本发明可以克服现有技术靶向 光动力学治疗的许多显著缺点。现有技术中的缺点是：光敏剂结合物具有有限的生物药效 率、非特异性摄取、以及每个靶向配体产生活性氧簇的能力有限。如本文中所述，利用sst2 表达细胞来证明本发明方法的原理。本发明可以用来靶向其他受体并且可以用于其他光敏 剂。癌症的分子靶体是分布广泛的并且对不同肿瘤类型具有特异性。有明显的理由应对乳 腺、前列腺、肺、大脑肿瘤以及消化道癌症的靶向光动力学治疗受体进行研宄。也可以对其 他非恶性疾病进行靶向。例如，类风湿关节炎患者的患病关节中的免疫细胞活化后会表达 高密度的生长抑素（Somatostatin，SS)受体（sst)。靶向光动力学治疗可以是治疗此疾病 (类风湿关节炎）的理想候选方法。
[0094] 现在，将通过以下非限制性实施例来更详细地说明本发明。
[0095]实施例
[0096] 以下各实施例描述了制备纳米光药物（NPM)的方法，将两个独立的具有代表性的 光敏剂（即二氢卟吩e6 (Ce6)或mTHPC)以适当的准聚集状态共价地埋入纳米尺寸（50~ 150nm)的二氧化硅或壳聚糖的载体器件内，最终结构具有期望的在Q-带（红色-近红外） 区域（在该光谱范围内，光的组织穿透性较好）的光吸收性质。在各实施例中描述了 ：用适 用于光成像的第二成分荧光量子点以及适用于磁共振对比成像的第三成分顺磁离子掺杂 这些纳米光药物从而形成掺杂的纳米光药物和/或与活性癌症靶向肽配体结合从而形成 (掺杂的）纳米光药物结合物、新型光漂白特征、到癌细胞的传输、以及使用所述纳米光药 物的光动力学治疗。
[0097] 用于制备纳米光药物的试剂包括：正硅酸四乙酯（TEOS，Sigma98% )或正硅 酸四甲酯（TMOS)、氨基丙基三乙氧基硅烷（APTS，Sigma98% )、氨水（25%溶液，Sigma Aldrich)，1-乙基-3-[3-二甲氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐（EDAC或EDC)、N-羟基磺基丁 二酰亚胺（磺基-NHS)、N，N' -二丁二酰亚胺基碳酸酯（DSC，Sigma，98 % )、乙醇（99 %， Sigma)、2-(N-吗啉基）乙磺酸（MES)缓冲液（Sigma)、磷酸盐缓冲的盐水（PBS)、二氢卟吩 e6、间-四羟基苯基二氢卟吩（mTHPC)、ZnS:Mn量子点（QD)、硝酸札（Gd3+) (99%，Sigma)、和 二甲基亚砜（DMSO,Sig