多巴，剂型为片剂（200mg规格），含左旋多巴200mg和苄丝肼 50mg〇
[0050] 应理解，在上述的所有实施例以及要求保护的左旋多巴制剂中，所述的左旋多巴 和苄丝肼仅为该制剂的药效成分，即两者的重量百分比仅仅为在药效成分的比例。
[0051] 试验例1活性成分左旋多巴对全脑缺血再灌注损伤大鼠的神经行为学影响
[0052] 1研究内容和方法
[0053]健康成年雄性SD大鼠176只，随机分为假手术组（n= 20)，模型组（n= 52)，小 剂量左旋多巴干预组（n= 52)，大剂量左旋多巴干预组（n= 52)。模型组及药物干预组按 照时间点的不同分为造模后1周组、2周组及4周组。
[0054] 采用改良PulSinelli四血管闭塞法（4-V0)制作全脑缺血再灌注大鼠模型。药物 干预组大鼠于再灌注即刻、ld、2d、3d、4d、5d、6d腹腔内注射左旋多巴25mg/kg(小剂量干预 组）或50mg/kg(大剂量干预组），假手术及模型对照组在相同时间点给予生理盐水25mg/ kg腹腔注射。
[0055] 分别观察各组大鼠改良神经反射（NSS)评分。其中于再灌注后Iw时选取32只大 鼠（每组6只），2w时选取24只大鼠（模型组及两个药物组各8只）进行Morris水迷宫 实验。
[0056] 2研究结果
[0057] (1)改良NSS评分
[0058] 四组大鼠于再灌注后6h、24h、72h、lw时的分值差异具有统计学意义（p〈0.05)， 其中模型组评分高于假手术组及药物组（p〈〇. 05)，但不同剂量药物组之间无差异性 (p>0.05)。随时间延长，各组评分均呈下降趋势。再灌注后2w，3w，4w时，4组评分无统计学 差异（p>0. 05)，结果见表1。
[0059] 表1左旋多巴实验组各组大鼠再灌注一周内改良NSS评分
[0060]
[0061] *与假手术组相比，p〈0. 05 ;#与模型组相比，p〈0. 05。
[0062] (?Morris水迷宫实验
[0063] 请参考图1和图2,结果说明，各组大鼠每日逃避潜伏期之间的差异有统计学意 义（p〈0. 05)，其中，假手术组潜伏期较其他三组短（p〈0. 05)，药物干预组明显低于模型组 (p〈0. 05)，但不同剂量药物组的潜伏期无统计学差异（p>0. 05)。随着训练次数的增加，各组 大鼠的潜伏期均逐渐缩短（P〈〇. 05)。在探索实验中，模型组与两药物组在第二象限滞留时 间百分比明显低于假手术组（p〈〇. 05)，而药物组比模型组较长（p〈0. 05)，但两不同剂量药 物组之间无显著性差异（P〈〇. 05)。
[0064] 试验例2离体细胞培养实验部分
[0065](一）研究内容和方法
[0066] 1神经细胞培养
[0067]HT22细胞是一种小鼠海马神经元细胞系，是小鼠T4细胞系的一种亚克隆。在脑组 织中，海马神经元对缺氧更为敏感，因此，本试验例选用HT22细胞作为研究对象。HT22细胞 培养所用培养基为含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基。HT22细胞常规培养于37°C、平衡 湿度、含5%二氧化碳的标准二氧化碳培养箱中培养。
[0068] 2糖氧剥夺/复氧（OGD/R)HT22细胞模型的建立
[0069] 体外实验模型是运用糖氧剥夺再复糖复氧的方式模拟在体的缺血再灌注损伤。细 胞铺板于96孔板，第二天换无糖无血清培养基，然后放置于37°C、平衡湿度、含5%二氧化 碳和95 %氮气的培养箱中培养。
[0070] 缺氧实验：
[0071] ①糖氧剥夺组，将培养的细胞按上述步骤分别缺氧3h、8h、12h、18h;
[0072] ②对照组，将培养的细胞用有糖有血清的培养基于含5%二氧化碳的标准二氧化 碳培养箱中正常培养。
[0073] 复氧实验：
[0074] ①复氧组，先将细胞按上述方法缺氧18h后，将培养的细胞换有糖有血清的培养 基于含5%二氧化碳的标准二氧化碳培养箱中正常培养IOh和20h;
[0075] ②对照组，正常培养。
[0076] 3给药方案
[0077] 进行4组实验，包括对照组、糖氧剥夺/复氧模型组、多巴胺盐酸盐药物组。由于 离体实验不涉及药物透过血脑屏障的问题，因此，将药品直接溶于培养基中即可达到给药 目的。左旋多巴可通过血脑屏障，但是不溶于水，很难加入培养基中，因此离体实验用多巴 胺盐酸盐代替，达到多巴胺给药的目的。药物设置25ymol/L、50ymol/L和100ymol/L三 种浓度。并分别在以下4个时间点将药物加入细胞培养基质中，细胞复氧结束后进行检测：
[0078] 在糖氧剥夺（OGD)期前2h(缺氧前2h给药）；
[0079] 在糖氧剥夺期过程中（缺氧给药）；
[0080] 复氧期（复氧给药）；
[0081] 整个实验过程都加入药物（全程给药）。
[0082] 4图像采集分析
[0083] 细胞图像采用尼康ECLIPSETi系列倒置显微镜成像系统于XlO倍物镜下采集，应 用AdobePhotoshopCS2和imageJ软件进行图片分析。
[0084] 5.LDH细胞活力检测
[0085] 细胞活力检测使用LDH检测手段，细胞模型完成后或药物处理完成后，每孔加 入150yILDH释放剂，细胞培养箱孵育2h。取120y1上清加入60yILDH检测工作液，然 后在酶标仪上进行490nm和650nm双波长测定吸光度。结果用光密度值表示（optical density(OD))〇
[0086] 6AnnexinVPE/7-AAD流式细胞检测方法
[0087] 细胞模型完成后，使用AnnexinVPE/7-AAD试剂盒 (BDBiosciencesPharmingen,SanJose，CA)，对照管、补长设置管和样本管进行同时染色， 取单细胞悬液细胞用IXBingdingBuffer将细胞调整至IXIOfVml浓度，取100微升转至 5毫升流式专用试管，分别加入5微升AV-PE。混匀细胞，避光孵育15min后，加入5微升 7-AAD溶液和 400 微升IxBingdingBufferIh之内上机（BDAriaII)检测。
[0088](二）结果
[0089]IHT22细胞糖氧剥夺/复氧（0GD/R)细胞模型结果
[0090] 为了确定最佳糖氧剥夺时间和复氧时间，在糖氧剥夺期和糖氧剥夺/复氧期损伤 细胞的活力与对照组细胞的活力进行比较，采用的实验方法为LDH实验。
[0091] 当只缺氧18h不复氧时，细胞活力明显下降（0D0? 983±0. 129,p< 0? 05与对照 比）（图3,A)。当缺氧时长为18h时，挑选的2个复氧时长（IOh和20h)均能造成细胞的 明显损伤（图3，B)，其中0GD18h/R10h的损伤差异极显著（0D0.689±0.082，p< 0.01与 对照比）。本实验将选择0GD18h/R20h(0DI. 230±0. 096,p< 0. 05与对照比）作为模型 建立的条件，因为该时间点有利于药物调节作用的发挥。
[0092] 在图3中，示出了HT22细胞糖氧剥夺/复氧模型下的细胞活性情况，其中，细胞活 性情况由LDH细胞活性实验确定。具体的，A:复氧时长为Oh时，不同缺氧时长下HT22细 胞活性情况；B:缺氧时长为18h时，不同复氧时长下HT22细胞活性情况；*p< 0. 05,**p < 0. 01与各自的对照相比。
[0093] 2多巴胺盐酸盐对HT22细胞糖氧剥夺再复氧损伤的作用
[0094] 2. 1复氧给药对HT22细胞形态学影响
[0095]HT22细胞在光学显微镜下观察，胞体呈锥形或圆形，突起长，相互连接成网络状。 神经元经糖氧剥夺再复氧处理38h后，大多数细胞维持正常细胞形态，部分神经元突起长 度缩短，受损严重者甚至消失（图4中C和D)。在缺氧前2h、缺氧、复氧和全程分别加入 25m〇l/l、50m〇l/l、100m〇l/l多巴胺盐酸盐，可观察到复氧给药组中的细胞生长密集并且保 持了正常的细胞形态（图4中K，L和M)，而由于糖氧剥夺/复氧所造成的皱缩圆形细胞几 乎消失。
[0096] 缺氧前2h给药的细胞大多数保持了正常细胞形态（图4中E，F和G)。缺氧给药 组和全程给药组中细胞几乎没有正常形态的细胞，大多数细胞皱缩成圆形，并且结成团状， 细胞损伤严重（图4中H，I，J，N，0和P)。不同浓度给药时，细胞形态无明显差异。
[0097] 其中，图4为多巴