二甲双胍作为转化生长因子-β受体拮抗剂的新应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及二甲双胍的新应用，具体是其作为转化生长因子-0受体拮抗剂的新 应用。
【背景技术】
[0002] 转化生长因子-0(Transforminggrowthfactorbeta,TGF-0 )属于TGF-0 超家 族蛋白，是由两个结构相同或相近的、分子量的12. 5kDa亚单位借二硫键连接的双体。在哺 乳动物至少发现有TGF-PUTGF-P2、TGF-P3、TGF-P13 2 四个亚型。TGF-P1 与TGF-3 2 有71%氨基酸同源性，TGF-M与TGF-P3有77%同源性，TGF-P2与TGF-P3有80%同源 性。TGF-P与TGF-P超家族其化成员有30~40%同源性。人TGF-P1、TGF-P2和TGF- 3 3 的基因分别定位于染色体19q3、lq41和14q24,均含有7个外显子，核苷酸序列有高度同源 性，所编码的前体分子C端者有9个保守的Cys，提示TGF-P1、TGF-P2和TGF-P3基因 可能来自一个共同的祖先基因。人和小鼠TGF-Pl的同源性高达99%，表明在不同种属中 TGF-P都具有重要的生物学功能。研究表明，TGF-P参与多种细胞功能，包括细胞生长、细 胞迁移与侵袭、上皮-间质转化（Epithelial-mesenchymaltransition,EMT)、细胞外基质 (extracellularmatrix,ECM)重构及免疫调节等功能。TGF-0在肿瘤、纤维化和炎症等疾 病状态中高表达，并且这些高水平的TGF-P加重了疾病进展，因此TGF-P信号通路成为研 发相关药物的重要靶点。
[0003] TGF@ 1下游经典的激活通路是Smad信号通路。TGF@ 1与II型TGF-P受体结 合，II型TGF-P受体二聚化增加，招募I型TGF-P受体组成复合物，II型TGF-P受体具 有丝/苏氨酸激酶活性，可磷酸化并激活I型TGF-P受体，继而磷酸化下游的rec印tor activatedSmads,R-Smads(Smad2,Smad3)，憐酸化后的Smad2/3 与Co_Smad(Smad4)结合， 转位入核，作为转录因子启动基因表达（PMID: 22992590)。
[0004] 高水平的TGF-0参与肿瘤发生发展的机制主要包括以下两个方面：第一，促进上 皮-间质转化（EMT)。EMT可促进肿瘤细胞迁移（migration)并更具有侵袭性（invasive)。 EMT还促进细胞向肌成纤维细胞(myofibroblast)表型转化。肌成纤维细胞增加细胞外基 质产生,增加间质液体压力，从而使抗肿瘤药物难以达到肿瘤内。另外，EMT还使肿瘤细胞 向"干细胞样"特性转化，增加肿瘤生长能力以及其抗药性。第二，抑制免疫反应。肿瘤进 展过程中，高水平的TGF-P通过减弱CD8+T细胞，CD4+T细胞和树突状细胞的抗肿瘤效应， 抑制机体的免疫监督能力。TGF-P还可抑制自然杀伤细胞产生干扰素Y，而干扰素Y是 自然杀伤细胞杀死肿瘤细胞所必须的因子。TGF-P可促进巨噬细胞由Ml型向M2型转化。 Ml型主要参与攻击外来物如肿瘤细胞。而M2型的攻击能力明显下降，主要分泌大量炎症 因子，如白介素6、白介素1和TGF-P。这些因子加重局部疾病状态，促进肿瘤进展和炎症 (PMID:23000686)。
[0005]TGF-P的另一重要生物学功能为促纤维化。纤维化的主要表现为成纤维细胞的 堆积和细胞外基质如胶原的大量分泌。TGF-P是公认的促纤维化的因子，它促进胶原的 合成和成纤维细胞的沉积。同时，tgf-0Memt的效应还会进一步的加重纤维化，包括 肺脏、心脏、肾脏以及手术后的动脉再狭窄等（PMID:23000686)。因此TGF-P已作为不同 种纤维化疾病的共同治疗靶点。例如特发性肺纤维化(表现为原因不明的进行性肺功能 下降，5年生存率仅20%)、肾纤维化、硬皮病、马凡氏综合征以及眼角膜术后的角膜纤维化 的治疗等（PMID:23063463PMID:23000686)。由于心脏纤维化是导致心力衰竭的重要病 理过程，因此以TGF-P为靶点的抗纤维化治疗也被认为是预防心力衰竭的重要治疗靶点 (PMID:21883991)。只是目前还没有临床实验将TGF-P信号通路抑制剂应用于心脏纤维化 的治疗。
[0006] 针对TGF-P信号通路的不同成分可有多种药物设计策略，目前已经进入临 床实验的有以下几种：其中大分子抑制剂的有措抗配体的反义寡核苷酸（antisense oligonucleotides,AS0)和单克隆抗体；小分子抑制剂主要为一些小分子化合物，其作用革巴 点是TGF-PI型受体。
[0007] 反义寡核苷酸（AS0):AS0是一段人工合成的单链核苷酸序列，与靶基因或mRNA某 一区段互补。ASO进入细胞后，通过碱基互补原则结合于靶基因/mRNA上，通过不同机制影 响靶基因的表达。在靶标实验中证明有效的反义寡核苷酸可以被进一步开发成为反义寡核 苷酸药物。目前开发的针对TGF-P信号通路的ASO主要是针对配体靶基因，如TGF-3 1、 TGF-P2。针对TGF-P2 的AS0,如AntisensePharma公司开发的Trabedersen(AP12009)， 用于治疗胶质细胞瘤与胰腺癌，现已进入III期临床实验。同一公司开发的针对TGF-M的 AS0,用于治疗非小细胞肺癌，目前尚在临床前阶段（PMID:20001556)。此外，基于反义核苷 酸技术，NovaRx公司开发了异体肿瘤细胞疫苗（Belagenpumatucel-L，Lucanix)，该异体疫 苗制备自四种肺癌细胞株，用含TGF-P2的反义基因质粒进行转染，使TGF-P2产生减少， 从而帮助机体重建对肿瘤细胞的免疫力，目前已进入III期临床实验（PMID: 16966690)。然 而，ASO作为TGF-P抑制剂的实际应用存在以下问题：①效率低：由于ASO需进入细胞内 与靶基因结合才能发挥作用。但是未经修饰的ASO由于其自身电荷特性使得它很难穿过细 胞膜进入细胞内。即便人们设计了多种方案例如化学修饰、加入载体等以促进ASO进入细 胞，但ASO被细胞摄取的效率仍很低。②不稳定：ASO通常为20nt左右的单链核苷酸，未经 修饰的ASO很容易被生物体液中的核酸酶降解。即便化学修饰可以增强其抵抗核酸酶的能 力，但其稳定性仍远不如化合物。③给药不方便，难以到达靶器官：作为大分子抑制剂，ASO 的药代动力学特性使得它难以到达靶器官发挥治疗效应。虽然可以局部用药，但对于一些 内部器官肿瘤，如神经胶质瘤，局部应用通常为有创的，副作用严重，患者无法因此受益。④ 造价高：AS0要真正用于临床，需要经过各种化学修饰并加上载体，以促进ASO抵抗核酸酶 的能力和被细胞摄取的效率。因此造价相对较高。
[0008] 单克隆抗体：单克隆抗体技术（monoclonalantibodytechnique)是将产生抗体 的单个B淋巴细胞同肿瘤细胞杂交，获得既能产生抗体又能无限增殖的杂种细胞并以此生 产抗体的技术。单克隆抗体是一种非常有效的抑制TGF-P信号通路的治疗策略。它可特 异性地与配体结合，阻止配体与受体的结合，从而有效地切断下游信号通路。与ASO不同的 是，单克隆抗体在细胞外发挥作用。这一特性一方面使得它比ASO能更有效地发挥作用，另 一方面使得单克隆抗体可以只阻断过多的配体作用，而不会像ASO那样有可能使TGF- @表 达过低，无法发挥其正常生理功能（PMID:23000686)。目前进入临床实验的针对TGF-3信 号通路的单克隆抗体基本都是人源化抗体，例如CambridgeAntibodyTechnology开发的抗TGF-P1 配体的Metelimumab(CAT-152)，抗TGF-P2 配体的Lerdelimumab(CAT-192)和针 对TGF-P1、TGF-P2、TGF-P3 三种配体的Fresolimumab(GC-1008)。EliLilly公司开发 的抗TGF-P1配体的LY2382770。然而，单克隆抗体的应用存在以下局限性：①组织穿透性 差：单克隆抗体给药途径仅限于静脉给药。然而，单克隆抗体分子量大，难以穿透肿瘤组织， 到达靶组织。有研究发现，在动物模型中，给予抗肿瘤特异性抗原的单克隆抗体治疗，只有 不到20%的抗体到达肿瘤内，其余大多数都在血液中（PMID: 17154393)。②不易储存：大多 数单克隆抗体是大分子糖蛋白，分子量大，结构复杂，不利储存。储存条件不当，很容易导致 抗体失活。③造价高：单克隆抗体研发费用高(平均每个单抗药物的研发费用为10~18亿 美元)、生产过程技术含量和质量标准高、用药量大、培养液及发酵设备昂贵使得抗体药物 价格居高不下。
[0009] 小分子抑制剂：目前开发的小分子抑制剂主要是在受体水平阻断TGF-P超家族 信号通路。这些小分子抑制剂通常为ATP类似物，可以竞争性地结合在TGF-PI型受体激 酶的ATP结合口袋，抑制TGF-PI型受体的激酶活性，从而抑制下游Smad磷酸化，发挥其拮 抗TGF-P信号通路的作用。这些小分子化合物的优点在于：造价低廉，可大规模生产；稳 定，不易失活；给药方便，可口服。但这些小分子抑制剂也存在以下缺点：特异性不够高，由 于这些小分子抑制剂针对的是受体的激酶活性，有可能抑制其它激酶的活性，产生非预期 的