，将搜索区域限制在刚性对接中挑选出的结合位点（即 排名第6/4的两个复合体结构中二甲双胍的结合位点）附近4. 5A的区域，并考虑了配体的 柔性作了进一步的精细的对接，而受体仍为刚性。从表2比较可以明显看到，在考虑了配体 柔性后，受体蛋白与二甲双胍的结合稳定性进一步上升，尤其在TGF系统中更为明显。本发 明进一步对这两个复合体进行分子动力学的优化。
[0055] 表2二甲双胍柔性对接数据
[0057] 分子动力学模拟：在动力学模拟的过程，将通过二甲双胍位置的均方根位移偏差 (RMSD)来反映药物与蛋白的结合稳定性（药物相对于蛋白的运动）及蛋白质和配体自身构 象的变化，并在此基础上进一步分析药物与蛋白间形成相互作用力。
[0058]TGF-P1:二甲双胍（metformin)体系与TbRII:二甲双胍体系的RMSD变化图参见 图6A与图6B。由图6A可以明显看出在TGF-3 1:二甲双胍体系中，二甲双胍相对于TGF-3 1 的RMSD很小，与TGF-P1或二甲双胍分子本身的结构RMSD接近。这提示二甲双胍可以较稳 定的与蛋白结合在一起，这很大程度上是由于配体与结合位点的形状匹配程度较好。而由 图6B可看出在TbRII:二甲双胍体系中，二甲双胍相对于TGF-P1的RMSD明显大于TbRII 或二甲双胍分子本身的结构RMSD。这提示二甲双胍与TbRII的结合很不稳定。再请参见图 7所示二甲双胍（metformin)与TGF-P1相互作用，虚线代表氢键，实线代表疏水作用，二甲 双胍的两个甲基主要与结合口袋底部的K1E24、ILE33的疏水侧链发生相互作用，而极性的 N原子可以与ARG25侧链的NE-HE和NH2-HH21形成氢键。
[0059]MM/PBSA计算结合自由能
[0060]AGbind=AGvac^1+AGsol
[0061]其中：AGva_=AE_-TAS
[0062]AEmm=AEinte+AEcoul+AEvdw
[0063]AGscil-AGpb+AGsas
[0064]AGsas=入ASAS+ 3 入=2. 2kJ/ (mol.nm2) 3 =3. 84kJ/mol
[0065] 结合过程中自由能的变化分为配体和受体直接的相互作用能（AE_)，包含分子内 能（即分子自身的相互作用能AEinte),库伦相互作用（AEraul)，范德华（AEvdw);结合过程中 熵的变化（-TAS)，这两项并不需要考虑溶剂效应，可归纳为AGva_。而结合过程中的溶 剂效应包含非极性溶剂化自由能（AGsas),正比于溶剂可及面积的差值（S卩：ASAS);以及极 性部分的溶剂化自由能（AGpb )。
[0066]在计算过程中，分子内能的变化为零，AEinte=0。AEraul=_90. 76kJ/mol; AEvdw=-61. 66kJ/mol;ASAS=-2. 92nm2 ;AGSAS=-2. 58kJ/mol;-TAS=-63. 67。
[0067] 溶剂化能中的极性项由APBS1. 4软件计算：AGPB=22. 83kJ/mol
[0068] 最后得到结合自由能为AGbind=_68. 50kJ/mol。
[0069] 结论：本实施例通过分子对接和分子动力学模拟手段探讨了TGF-P和TPRII上 二甲双胍可能的结合位点。认为有较大的可能是二甲双胍通过结合TGF-P1抑制TGF-3 信号通路，其结合位点位于在TGF-P参与结合TPRII的关键氨基酸Arg25附近。具体相 互作用方式包括二甲双胍的两个甲基主要与结合口袋底部的K1E24、ILE33的侧链发生相 互疏水作用，和极性的N原子与ARG25侧链的NE-HE和NH2-HH21形成氢键作用。本实施例 同时采用MM/PBSA法估算二甲双胍与TGF-P1蛋白的结合自由能约为-68. 50kJ/mol。
[0070] 实施例5、蛋白质印迹法验证二甲双胍通过与TGF-3 1而非T3RII结合阻断 TGF-P下游Smad信号通路
[0071] 小鼠胚胎成纤维细胞系3T3细胞种于6孔板，分为两组。一组细胞给予不同浓 度的二甲双胍预处理2小时后再给予TGF-P15ng/mL刺激细胞30分钟。另一组细胞的 处理则是：将不同浓度的二甲双胍与TGF-P1在试管中预混于细胞培养液中，然后放入细 胞培养箱2小时，再将混合培养液加入另一组细胞中刺激30分钟。收样时，冷PBS洗细 胞二次，加入 80ul细胞裂解液（20mmol/LTris-HClPH7. 4, 150mmol/LNaCl, 2. 5mmol/L EDTA, 50mmol/LNaF, 0.lmmol/LNa4P207,lmmol/LNa3V04,l%TritonX-100, 10%glycerol, 0 .1%SDS,l%deoxycholicacid,lmmol/LPMSF,andlmg/mlaprotinin)裂解细胞 10 分钟，用细 胞刮刮下并移入Ep管中，超声处理后于4°C，12,OOOg离心15min。收上清，蛋白定量后加入 5XSDS凝胶加样缓冲液，100°C煮沸5min后冻存。将细胞裂解液进行蛋白质印迹法实验检 测TGF-P信号通路下游磷酸化Smad3,具体步骤包括：10%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳90V2小 时，硝酸纤维素膜转膜200mA2小时；电泳转移结束后，将膜放入5%牛奶（inTBST)室温封闭 1 小时；一抗(磷酸化Smad31:1000in5%BSATBST,cellsignaling)4 度孵育过夜；TBST洗膜 后，二抗（1:2000in5%牛奶TBST)室温1小时，TBST洗膜后显影；将膜置于2mL反应液（ImL A液，ImLB液，MilliporeCorporation)室温孵育2min，缓慢轻摇，将膜上液滴滴尽后封入 保鲜膜，压入X光片曝光(曝光时间视信号强弱而定)。
[0072] 结果如图8所示，第一组处理方式，二甲双胍需至少IOOiiM才可明显抑制TGF-31 引起的磷酸化Smad3增加；第二组处理方式，二甲双胍仅IpM便可显著抑制TGF-P1引起的 磷酸化Smad3增加。第一组处理方式是让二甲双胍与细胞上的T3RII充分接触，第二组处 理方式是让二甲双胍与TGF-P1在体外充分接触。结果提示二甲双胍通过与TGF-P1而非 T3RII结合阻断TGF-P信号通路。
[0073] 综上所述，二甲双胍可作为TGF-P受体拮抗剂，与TGF-P结合，阻止TGF-P1与 其受体的结合，从而有效地切断下游信号通路。
[0074] 实施例6、二甲双胍减轻高血压疾病模型小鼠的心脏纤维化实验
[0075] 10周龄雄性C57BL6小鼠，采用血管紧张素II(3mg/kg*dayX7天）皮下埋 泵方法制备高血压疾病模型。埋泵前3天开始每天皮下注射盐酸二甲双胍（200mg/ kg体重）至埋泵后1周。采用组织切片的方法评价心脏纤维化情况。结果如图9 所示，与对照组相比，血管紧张素II明显促进心脏纤维化(纤维化面积百分比： I. 99±0. 846vs. 12. 60±1. 97%，P〈0. 05)，盐酸二甲双胍对心脏纤维化无明显影响（纤维化 面积百分比：1. 99±0. 846vs. 2. 31±0. 51%)，二甲双胍抑制血管紧张素II引起的心脏纤维 化(纤维化面积百分比：12. 60±1. 97%vs. 7. 26±1. 30%，P〈0. 05)，因此应用二甲双胍可以减 轻高血压疾病模型小鼠的心脏纤维化。
[0076] 在其它与TGF-P相关的疾病模型中，也可应用二甲双胍治疗抑制TGF-P的作用。
【主权项】
1. 二甲双胍或其药学上可接受的盐作为转化生长因子-0受体拮抗剂的应用。2. 根据权利要求1所述的应用，其中，所述药学上可接受的盐为盐酸盐。3. -种转化生长因子-3受体拮抗剂，其包括有效量的二甲双胍或其药学上可接受的 盐。4. 根据权利要求3所述的拮抗剂，其中，所述药学上可接受的盐为盐酸盐。5. -种阻止TGF-P配体与受体结合的方法，该方法包括利用二甲双胍或其药学上可 接受的盐，使其与TGF-P配体结合，从而阻止TGF-P配体与受体结合。6. 根据权利要求5所述的方法，其中，所述药学上可接受的盐为盐酸盐。
【专利摘要】本发明提供了二甲双胍作为转化生长因子-β受体拮抗剂的新应用。具体而言，本发明提供了二甲双胍或其药学上可接受的盐作为转化生长因子-β受体拮抗剂的应用；还提供了一种包括有效量的二甲双胍或其药学上可接受的盐的转化生长因子-β受体拮抗剂；还提供了一种阻止TGF-β配体与受体结合的方法，该方法包括利用二甲双胍或其药学上可接受的盐，使其与TGF-β配体结合，从而阻止TGF-β配体与受体结合。
【IPC分类】A61P9/12, A61P9/00, A61K31/155, A61P43/00
【公开号】CN105078949
【申请号】CN201410213330
【发明人】张幼怡, 肖晗, 李敬源, 方晓红, 徐钟河, 吕志珍, 张明亮
【申请人】北京大学第三医院, 中国科学院高能物理研究所, 中国科学院化学研究所
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2014年5月20日