副作用。
[0010] 另一方面，二甲双胍是一类广泛用于治疗糖尿病的一线口服降糖药，它主要通过 抑制肝脏葡萄糖产生发挥降糖作用。由于二甲双胍并不刺激胰岛素分泌，不会出现低血 糖的副作用，甚至对于高胰岛素血症还具有降低血浆胰岛素的作用，因而它被称作"胰岛 素增敏剂"。二甲双胍是目前唯一被证实具有心血管保护作用的降糖药。此外它还可以用 于治疗一些伴随有胰岛素抵抗的疾病，如多囊卵巢综合征（PMID14576245)、非酒精性肝病 (PMID11567710)。二甲双胍的副作用较少，主要为胃肠道反应和乳酸酸中毒。乳酸酸中毒 多见于药物过量和有禁忌症的患者(如肾功能受损等)。二甲双胍是一个小分子化合物，临 床用药为盐酸二甲双胍，分子量仅165. 62。它在生理pH值条件下为水溶性的正价阳离子， 脂溶性很低，因而难以透过细胞膜，需要转运子转运入胞内。二甲双胍在体内几乎不与任何 蛋白结合，不被代谢，以原型进入尿液排出体外。对于肾功能正常的患者，清除半衰期为5 小时（PMID: 21241070)。目前认为二甲双胍药理作用的分子机制主要是通过激活AMP激活 激酶（AMPactivated kinase,AMPK) 〇
[0011] 另有文献报道二甲双胍可以抑制病理刺激引起的心脏纤维化，其机制为抑制 TGF-P下游Smad3信号通路（PMID:20200042)。但是具体二甲双胍如何抑制TGF-P信号 通路并不清楚。
[0012] 经检索，未发现现有技术中有将二甲双胍或其盐用作TGF-P拮抗剂的报道。
【发明内容】
[0013] 本发明的一个目的在于提供一种新型安全的转化生长因子-P(Transforming growthfactorbeta,TGF-0 )措抗剂。
[0014] 本发明的另一目的在于提供二甲双胍（metformin)或其药学上可接受的盐作为 TGF-P受体拮抗剂的新应用。
[0015] 本发明的另一目的在于提供一种阻止TGF-P配体与受体结合的方法。
[0016] 本案发明人在研究中发现，二甲双胍或其药学上可接受的盐可作为TGF-P受体 拮抗剂，其能够与TGF-P结合，阻止配体与受体的结合，从而有效地切断下游信号通路。
[0017] 具体而言，本发明通过实验证实二甲双胍或其药学上可接受的盐对碘125标记 TGF-P1结合其受体具有抑制作用。进一步，利用单分子荧光成像技术分析二甲双胍或其 药学上可接受的盐对TGF-PIII型受体（TPRII)二聚化比例的影响，明确二甲双胍或其药 学上可接受的盐抑制TGF-P1引起的受体二聚化比例增加。更进一步的研究证实二甲双 胍或其药学上可接受的盐并不影响TGFP1与其受体的结合力，但抑制TGFP1与其受体的 结合概率。此外，通过分子对接与分子动态模拟分析了二甲双胍或其药学上可接受的盐与 TGFPl或其受体之间可能的结合位点。并最终通过蛋白质印迹法验证了二甲双胍或其药学 上可接受的盐通过与TGF-P1而非TPRII结合阻断TGF-P信号通路。
[0018] 从而，一方面，本发明提供了一种新型安全的转化生长因子-P(Transforming growthfactorbeta,TGF-0 )受体措抗剂，其包括有效量的二甲双胍或其药学上可接受的 盐。
[0019] 根据本发明的具体实施方案，二甲双胍或其药学上可接受的盐中，所述药学上可 接受的盐为盐酸盐，即，二甲双胍的药学上可接受的盐为盐酸二甲双胍。
[0020] 另一方面，本发明提供了二甲双胍或其药学上可接受的盐作为TGF-P受体拮抗 剂的新应用。
[0021] 另一方面，本发明提供了一种阻止TGF-P配体与受体结合的方法，该方法包括利 用二甲双胍或其药学上可接受的盐，使其与TGF-P配体结合，从而阻止TGF-P配体与受体 结合。
[0022] 二甲双胍兼具单克隆抗体和小分子抑制剂的优点：它与单克隆抗体一样在细胞外 发挥作用；分子量小，易于进入靶向组织；给药方便，可口服；半衰期短，易于控制剂量，如 出现不良反应可及时停药；稳定，不易失活；造价低廉，可大规模生产。另外，由于二甲双胍 已在临床应用几十年，从安全性的角度来说已有大量证据。因此，根据本发明的研究成果提 示，二甲双胍有望作为新的TGF-P拮抗剂应用于临床。
【附图说明】
[0023] 图1:二甲双胍对碘125标记TGF-P1结合其受体的抑制作用。将无二甲双胍组的 特异性结合放射强度设为1〇〇%。此为三次独立实验结果。
[0024] 图2A~图2D:单分子荧光成像技术分析二甲双胍对TGF-PIII型受体（TPRII) 二聚化比例的影响。其中，图2A:细胞膜表面TPRII-GFP的典型单分子图像，圈内的即为 单个分子的TPRII-GFP信号，用于荧光强度分析，再进行荧光漂白得到漂白曲线，标尺为 5iim。图2B:二甲双胍对TGF-M(5ng/mL)作用下T3RII二聚化比例的影响。图2C: - 步漂白曲线代表图，提示该荧光信号代表单个TPRII-GFP分子即单体形式。图2D:二步漂 白曲线代表图，提示该荧光信号代表两个TPRII-GFP分子即二聚体形式。
[0025] 图3:用TGF-P1修饰的AFM针尖在活细胞上进行单分子测力的示意图。
[0026] 图4A~图4D:原子力显微镜分析TGF-P1与TGF-PII型受体（TPRII)之间结合 力及结合概率。图4A与图4B分别为无二甲双胍（metformin)和ImM二甲双胍下，TGF-旦I与TGF-P受体结合力的统计分布。图4C:比较有无二甲双胍情况下，TGF-P1与TGF- @受 体结合力的大小。图4D:比较有无二甲双胍情况下，TGF-P1与TGF-P受体结合概率的变 化。TGF-P1中和抗体可以阻止TGF-P1与其受体结合，此处作为阳性对照。
[0027] 图5A为二甲双胍(灰色小分子)在TGF-3 1ARG25和His34处的结合视图。图5B为 二甲双胍与TPRII在ILE53和PHE30处形成的结合构象。蛋白质表面以深色代表TGF- 3 1 和TbRII的结合界面。
[0028] 图6A与图6B分别为TGF-P1:二甲双胍（metformin)体系与TGF-PII型受体 (TbRII):二甲双胍体系的均方根位移偏差（RMSD)变化图。
[0029] 图7:二甲双胍（metformin)与TGF-@1相互作用图。虚线代表氢键，实线代表疏 水作用。
[0030] 图8:蛋白质印迹法验证二甲双胍通过与TGF-Pl而非TGF-P受体结合阻断 TGF-P信号通路。
[0031] 图9:二甲双胍抑制血管紧张素II引起的心脏纤维化实验结果。
【具体实施方式】
[0032] 下面结合具体实施例进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照所属领域的 常规操作进行，或按照制造厂商所建议的条件进行。
[0033] 以下各实施例中，所用原始试剂和材料均可商购获得。各实施例中所用二甲双胍 为其盐酸盐的形式，即，盐酸二甲双胍。
[0034] 实施例1、碘125标记TGF- @ 1结合实验
[0035] 小鼠胚胎成纤维细胞系3T3细胞种于24孔板，当接近长满状态时，加入50pM碘 125标记TGF-PI(PerkinElmer)以及不同浓度的二甲双胍（metformin)。4度孵育4小时 后，冰上用结合缓冲液（50mMH印es, 128mMNaCl, 5mMKC1, 5mMMgSO4,和I. 2mMCaCl2)冲洗 5次。再用含l%TritonX-100的结合缓冲液裂解细胞，收集各孔裂解液，利用Y计数器(上 海核所日环光电仪器有限公司）测放射性强度。非特异结合孔加入IOnM非标记TGF-3 1 (Peprotech)。三次独立实验。
[0036] 结果参见图1。将无二甲双胍组的特异性结合放射强度设为100%。三次独 立实验测得二甲双胍对碘 125标记TGF-P1结合其受体的半数抑制浓度IC50的对数值 为-4. 16±0. 53。
[0037] 本实施例的结果表明，二甲双胍能够抑制TGF-P1与其受体结合。
[0038] 实施例2、单分子荧光成像技术分析TGF-PIII型受体（TPRII)二聚化比例
[0039]TGF-P1与II型TGF-P受体结合后，II型TGF-P受体二聚化增加，进而招募I 型TGF-P受体组成复合物，II型TGF-P受体具有丝/苏氨酸激酶活性，可磷酸化并激活 I型TGF-P受体，继而磷酸化下游的Smad通路。II型TGF-P受体的二聚化，是激活下游 Smad通路的始动步骤。本实施例是研究二甲双胍对II型TGF-P受体二聚化的影响。
[0040] 本实施例中，在HEK293细胞中转染胞内端连接有单个绿色荧光蛋白（green fluorescenceprotein，GFP)分子的TGF- 0II型受体（T0RII-GFP)质粒(编码全长TPRII 的DNA片段通过基因重组被连接到pEGFP-Nl(Clontech)的HindIII和BamHI两个酶切位 点之间，形成表达质粒TPRII-GFP)。TPRII-GFP质粒在细胞内