改进的疫苗组合物和使用方法
【专利说明】
[0001] 相关申请的交叉引用 本申请依据35 USC § 119(e)，要求2012年9月21日提交的美国临时申请系列号 61/703,814的权益，其公开的全部内容通过引用结合到本文中。
技术领域
[0002] 尽管在免疫学领域内的研究量和兴趣不断增加，目前仍缺乏足以有效对抗各种传 染性病原体或疾病如疟疾、HIV、丙型肝炎、流感和结核病的疫苗。例如，当前的流感疫苗诱 导对抗来自病毒的两种主要表面蛋白（血凝素和神经氨酸酶）的抗体。因此，当前的流感 疫苗仅有效地防止病毒株的感染，所述病毒株表达存在于疫苗中的这些蛋白的版本。然而， 由于突变和重新分类，这两种表面蛋白频繁地改变。因此，流感疫苗必须每年重新配制以含 有新形成的病毒株的血凝素和神经氨酸酶表面蛋白。
[0003] 此外，流感病毒感染，特别是大流行株如HlNl和H5N1，代表一个不断增长的全球 健康风险。该风险在老年人和在患有慢性疾病的人中明显更大，往往在这些患者群体中导 致更高的死亡率。接种疫苗已是控制疾病的一个成功的手段。然而，由于在大流行中疫苗 的潜在有限的可用性，由于当前的生产方法，以及也由于在老年人中的有限的效果，更有效 的生产方法以及更有效的流感疫苗正在探寻中。对抗传染性病原体的流感疫苗和其它疫苗 (其将有效对抗多个病原株，称为"通用疫苗"）正在积极探寻中。此外，当前的流感疫苗的 效果显著变化。特别是由于与流感大流行株有关的健康风险，与流感抗原适配的并且能使 当前抗原储备有效剂量节省的安全和有效的佐剂也正在积极探寻中。
[0004] 诸如疟疾、HIV、丙型肝炎和结核病的病原体是细胞内的，需要诱导强的细胞免疫 力（包括细胞毒性反应（CTL))以除去感染的细胞。这是公认的，即抗体应答的发展可通过 传统的佐剂如明巩和弗氏佐剂（Freund' s adjuvant)进行刺激。一些佐剂当用T-细胞表 位肽配制时能引起T-细胞应答，这也是公认的。然而，大多数现有的佐剂，当与全蛋白或 与病毒或细菌亚单位疫苗（以及活的和减毒的病毒疫苗）配制时，缺乏内化和加工抗原经 由MHC I类和II类两者呈递以诱导细胞和抗体二者混合的免疫应答的能力。现在应该理 解，许多疫苗将需要刺激体液和细胞两种免疫应答至足够有效。现在已知MHC I类限制的 CD8+T细胞的共同生成对于针对病毒和其它细胞内感染的疫苗是必要的。因此，开发基于 减毒的病原体和含有重组抗原的无生命载体的疫苗存在着障碍，因为对于这样的作用剂来 说，接近MHC I类和II类两者-限制的抗原加工途径是必要的。
[0005] 特别是，使包含外源性蛋白加工的"交叉-呈递"能够通过I类和II类加工途径 进行，以改进亚单位和活病原体疫苗对抗各种细菌和病毒病原体的保护效果的方法是非常 需要的。使"交叉-呈递"能够通过I类和II类加工途径进行，产生抗体应答和T-细胞应 答两者。
[0006] 发明背景和简述 如上所述，免疫已难以诱导抵抗在新出现的流感株中发现的蛋白，如在引起禽流感的 H5N1病毒中的那些蛋白。普遍认为困难出现部分是因为存在能识别一年生（annual)的病 毒株（但不是新的病毒株）的记忆细胞。然而，需要初次应答以防御新出现的病毒株，因为 它们在抗原性上更加不同于一年生的流感株。这样的初次应答通常需要加入佐剂。
[0007] 加入佐剂（例如，MF59、AS03或铝盐）至流感疫苗中增加抗体滴度和持久性。然 而，这些方法并不提供对该病毒的不同亚型的交叉-反应性。CD8+ T细胞识别该病毒的不 易变化的部分并可提供可由新疫苗诱导的更多交叉-反应性应答。
[0008] 流感疫苗开发以及对于其它病原体的疫苗的焦点，最近一直朝着生成能够提供更 多的交叉-反应性保护作用的记忆⑶8+ T细胞转移。如上所提及的，⑶8+ T细胞识别的 抗原发现于病毒的不易变化的部分。已尝试了几种方法。例如，由CD8+ T细胞识别的肽与 脂质部分（Pam-2-Cys)结合，后者激活DC上的TLR以启动保护性⑶8+ T细胞。这种疫苗 当经由鼻内递药给予时，生成迀移至肺的保护性⑶8+ T细胞。
[0009] ⑶8+ T细胞特异性检测侵入胞浆的作用物，如病毒，且对⑶8+ T细胞的抗原呈递 的要求不同于对CD4辅助T-细胞的那些。抗原通过MHC中编码的分子被传送到细胞表面。 内化的抗原由MHC II类携带到细胞表面，这促进了 CD4+ T-细胞的激活。相反，内源性抗 原通过MHC I类到达细胞表面，这激活⑶8+ T-细胞。为激活细胞毒性T-细胞（⑶8+)，由 DC内化的抗原必须在再次出现在细胞表面上之前与MHC I类途径交叉，一种称为交叉-呈 递的过程，对于这个过程，DC的特定子集被特化。能够激活抗原交叉-呈递的佐剂系统正 在积极探寻中并在开发新一代疫苗中是必要的。
[0010] 存在几种其它感染，例如肝炎、HIV和疟疾，抗体对它们提供不充分的保护作用。在 这些情况下，由抗体介导的体液免疫，和细胞-介导的免疫（其取决于细胞毒性T细胞或通 过细胞因子激活免疫细胞的T细胞）二者可能对有效的保护是需要的。
[0011] 树突状细胞（DC)是启动T细胞应答的主要抗原-呈递细胞，因而是佐剂应用的主 要靶标。在存在感染时，信号通过对微生物成分的模式-识别受体（PRR)被直接送到DCjP 通过其它识别微生物成分的先天免疫细胞释放的炎性细胞因子间接送到DC。这些信号诱导 DC的成熟并使它们迀移到次级淋巴器官，在那里它们能够与幼稚（naive) T细胞相互作用 并激活幼稚（naive) T细胞。DC的成熟涉及微生物蛋白的增加的处理和它们对T细胞在主 要组织相容性复合体（MHC)分子上的呈递。
[0012] 已证实一些佐剂激活诱导T辅助细胞（ThI)应答的信号，其特征在于在效应子位 点激活抗微生物作用的产生IFNy的T辅助细胞。佐剂如皂角苷驱动ThI应答并被认为通 过诱导DC中的IL-12起作用。然而，铝盐不直接通过TLR诱导信号传导并且不刺激DC生 产IL-12。相反，已发现铝-基佐剂驱动T H2应答。
[0013] 佐剂通过各种机制起作用，进行交叉-呈递的能力最终取决于佐剂的机制。佐剂 借此获得作用的一些机制包括抗原局部地保留在注射部位以产生一种缓慢-释放贮库效 应，因此能使抗原持续释放至抗原呈递细胞。佐剂也可作为化学引诱剂以吸引免疫系统的 细胞至抗原贮库，随后刺激这样的细胞以引起免疫应答。迄今为止最常用的佐剂是Alum (氢氧化铝和磷酸铝）。大多数佐剂（包括Alum)仅仅在提高抗体对抗原的应答中是有效 的。佐剂如MPL能激活抗体应答，并且当用T-细胞表位肽配制时，也证实会引起CTL应答。
[0014] 如上所述，虽然一些佐剂如阳离子脂质和MPL当与肽配制时能引起T-细胞应答， 使用肽片段而不是全抗原是一个严重的限制，因为不同的肽片段会被不同个体的T细胞识 另IJ。结果，非常大的数量的不同片段将必须被鉴定并包括在这样的疫苗中。此外，已知肽引 起保护性抗体应答的能力是弱的并且在几种肽中是不存在的。
[0015] -种有前景的方法是诱导CTL至内部蛋白质（如NP)，其在不同的病毒中为高度保 守的。血凝素（HA) T细胞表位也显示比抗体表位较少的变化。然而，现有的灭活疫苗像流 感病毒疫苗（Fluzone)主要由HA蛋白组成并且还不产生显著的⑶8 T细胞应答。
[0016] 据报道由CTL和ThI细胞二者杀死感染的细胞在消除因细胞内病原体所致的感染 方面是有效的。然而，在某些情况下（如由乙型肝炎病毒所致的肝部感染），产生IFNy的 CD8+ T细胞提供更有效的保护作用，因为所述病毒可被清除并伴有最少量的宿主细胞死 亡。类似地，产生IFNy的⑶8+ T细胞在用RTS，S疟疾疫苗接种的个体中显示与保护作 用有关。这种疫苗含有融合于乙型肝炎病毒表面蛋白的寄生虫的蛋白。据报道，需要针对 在寄生虫的生命周期的不同阶段表达的多抗原的体液和细胞-介导的免疫二者以防止疟 疾感染。用于最成功的疟疾疫苗中的佐剂系统是AS02, 一种在颗粒系统中配制的含有皂角 苷佐剂组分和TLR激动剂MPL二者的组合佐剂制剂。特别地，需要皂角苷和MPL佐剂二者 一起以诱导交叉呈递并因此在免疫的个体中提供适度水平的保护作用。然而，相反地，使用 具有氢氧化铝和MPL (AS04)或在水包油乳液（AS03)中的相同抗原的疫苗诱导高水平的抗 体，但未能防止感染。
[0017] 虽然活的减毒病毒和细菌疫苗可激活免疫系统的所有武器，但到目前为止佐剂还 未达到这个目标。通过结合佐剂，如铝盐与MPL，或通过使用用DNA然后病毒或细菌载体的 初始-加强（prime-boost)策略，体液和细胞-介导的两种应答可有效地激活。然而，这样 的多佐剂系统是复杂的并具有配制和安全性的潜在难题。
[0018] 因此，存在对新的疫苗组合物的需求，所述疫苗组合物有效地诱导对病原体（例 如流感病毒）的不同亚型的广泛的交叉-保护免疫。此外，治疗和预防疾病，如由细菌、病 毒和真菌引起的那些疾病的新的和有效的方法也是非常需要的。因此，本公开提供疫苗组 合物和使用组合物的方法，所述组合物呈现所需特性并提供交叉-呈递一种或多种抗原的 相关优点，并且其中体液和/或细胞免疫应答实现。
[0019] 本公开提供包含至少一种佐剂和至少一种抗原的疫苗组合物，其中佐剂是阳离子 脂质。本公开还提供治疗哺乳动物的疾病的方法，预防哺乳动物的疾病的方法，和进行抗原 交叉呈递以在哺乳动物中利用疫苗组合物诱导体液免疫应答和细胞免疫应答的方法。各种 抗原的交叉呈递可通过用具有佐剂特性的阳离子脂质，配制特异性抗原来完成。
[0020] 根据本公开的疫苗组合物和方法提供与现有领域的其它组合物和方法比较的几 个优点。首先，疫苗组合物可诱导对不同亚型的流感的广泛交叉-保护免疫，以及开发可针 对多个流感株提供保护作用的通用流感疫苗。
[0021] 其次，疫苗组合物显示体液和细胞-介导的两种应答的很大增加并可提供开发新 一代简单疫苗的简单佐剂平台，该疫苗不需要佐剂组合或病毒载体。这种在开发抗-病毒 和抗-细菌疫苗中引起"交叉-呈递"的途径可提供一种新的和成本有效的方法，以开发提 供改进的保护作用和治愈各种疾病的疫苗。
[0022] 第三，流感疫苗组合物可提供一种开发通用流感疫苗的新方法，其由于提高的对 HA蛋白的细胞CD8+ T-细胞应答和在其中CD8 T-细胞表位已知是保守的株中产生的"交 叉-反应性"，而无需使用多个T-细胞表位肽。
[0023] 构思了以下编号的实施方案，且这些实施方案是非限制性的： 1. 一种包含至少一种佐剂和至少一种抗原的疫苗组合物，其中佐剂是阳离子脂质。
[0024] 2.条款1的疫苗组合物，其中所述阳离子脂质是非甾体阳离子脂质。
[0025] 3.条款1或条款2的疫苗组合物，其中所述阳离子脂质选自D0TAP、D0TMA、D0EPC 及其组合。
[0026] 4.条款1-3的任一项的疫苗组合物，其中所述阳离子脂质是D0TAP。
[0027] 5.条款1-3的任一项的疫苗组合物，其中所述阳离子脂质是D0TMA。
[0028] 6.条款1-3的任一项的疫苗组合物，其中所述阳离子脂质是D0EPC。
[0029] 7.条款1-6的任一项的疫苗组合物，其中所述佐剂是阳离子脂质的对映体。
[0030] 8.条款7的疫苗组合物，其中所述对映体是纯的。
[0031] 9.条款7或条款8的疫苗组合物，其中所述对映体是R-DOTAP或S-D0TAP。
[0032] 10.条款7或条款8的疫苗组合物，其中所述对映体是R-D0TAP。
[0033] 11.条款7或条款8的疫苗组合物，其中所述对映体是S-D0TAP。
[0034] 12.条款7或条款8的疫苗组合物，其中所述对映体是R-DOTM或S-D0TMA。
[0035] 13.条款7或条款8的疫苗组合物，其中所述对映体是R-D0TMA。
[0036] 14.条款7或条款8的疫苗组合物，其中所述对映体是S-D0TMA。
[0037] 15.条款7或条款8的疫苗组合物，其中所述对映体是R-DOEPC或S-D0EPC。
[0038] 16.条款7或条款8的疫苗组合物，其中所述对映体是R-D0EPC。
[0039] 17.条款7或条款8的疫苗组合物，其中所述对映体是S-D0EPC。
[0040]18.条款1-17的任一项的疫苗组合物，其中一种或多种抗原是蛋白-基抗原。
[0041] 19.条款1-17的任一项的疫苗组合物，其中一种或多种抗原是肽-基抗原。
[0042] 20.条款1-19的任一项的疫苗组合物，其中一种或多种抗原选自病毒抗原、真菌 抗原、细菌抗原和致病性抗原。
[0043] 21.条款1-19的任一项的疫苗组合物，其中一种或多种抗原是病毒抗原。
[0044] 22.条款1-19的任一项的疫苗组合物，其中一种或多种抗原是真菌抗原。
[0045]23.条款1-19的任一项的疫苗组合物，其中一种或多种抗原是细菌抗原。
[0046] 24.条款1-19的任一项的疫苗组合物，其中一种或多种抗原是致病性抗原。
[0047] 25.条款1-24的任一项的疫苗组合物，其中至少一种抗原是来自病原体保守区 的抗原。
[0048] 26.条款24的疫苗组合物，其中所述致病性抗原是合成的或重组抗原。
[0049] 27.条款1-20的任一项的疫苗组合物，其中至少一种抗原选自RAHYNIVTF (seq. id. no：D^gqaepdrahynivtf (seq. id. no：2) ^ kssgqaepdrahynivtf (seq. ID. NO: 3)、YMLDLQPETT (SEQ. ID. NO: 4)、KSSYMLDLQPETT (SEQ. ID. NO: 5)、 KSSMHGDTPTLHEYMLDLQPETT (SEQ. ID. NO: 6)、KSSLLMGTLGIVCPICSQKP (SEQ. ID. NO: 7)^KVPRNQDffL (SEQ. ID. NO: 8)^SYVDFFVffL (SEQ. ID. NO: 9)^KYICNSSCM (SEQ. ID. NO: 10)和 KSSKVPRNQDWL (SEQ. ID. NO: 11)。
[0050] 28?条款1-20的任一项的疫苗组合物，其中至少一种抗原选自gplOO(KVPRNQDWL [SEQ. ID. No. 8])、TRP2 (SYVDFFVWL [SEQ. ID. No. 9])和 p53 (KYICNSSCM [SEQ. ID. No. 10])，及其组合。
[0051] 29?条款1-20的任一项的疫苗组合物，其中所述抗原是gplOO(KVPRNQDWL [SEQ. ID. No. 8])和 TRP2 (SYVDFFVWL [SEQ. ID. No. 9])。
[0052] 30?条款1-20的任一项的疫苗组合物，其中所述抗原是RAHYNIVTF (SEQ. ID. NO: 1)〇
[0053] 31?条款1-20的任一项的疫苗组合物，其中所述 ID. NO: 2)。
[0054] 32.条款1-20的任一项的疫苗组合物，其中所述抗原是KSSGQAETORAHYNIVTF (SEQ. ID.NO:3)〇
[0055] 33?条款1-20的任一项的疫苗组合物，其中所述抗原是YMLDLQPETT (SEQ. ID. NO: 4)。
[0056] 34?条款1-20的任一项的疫苗组合物，其中所述抗原是1?3￥1〇)1^?￡1'1'(3￡0.1 D. NO: 5)〇
[0057] 35.条款1-20的任一项的疫苗组合物，其中所述抗原是 KSSMHG