Nk细胞强化型血液制剂的制造方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及使NK细胞活化和增殖了的血液制剂的制造方法、和该血液制剂以及 NK细胞活性用组合物。
【背景技术】
[0002] 1981年以后，作为恶性新生物的癌成为日本人中死因的第1位，约占全部死亡原 因的3成。随着医学的进步，癌的治愈率、生存率得到明显改善，但目前仍然还是难治性疾 病。癌的治疗的标准方法为外科疗法、化学疗法和放射线疗法，近年来，免疫疗法作为新的 治疗法备受瞩目，到目前为止已经开发了各种方法（非专利文献1)。所谓免疫疗法，是指利 用体内的免疫力来进行癌、病毒感染症等的治疗的方法。可举出例如，细胞因子疗法、疫苗 疗法、BRM(生物应答调节剂：Biological Response Modifier)疗法、细胞免疫疗法等。
[0003] 所谓细胞因子疗法，是指通过将具有使T细胞、NK细胞等淋巴细胞增殖或活化的 作用的细胞因子直接给予生物体内，从而杀伤癌细胞、病毒感染细胞的治疗法。例如，有通 过给予白细胞介素2 (IL-2)、干扰素的治疗法等（非引用文献2)。然而，该治疗法在临床 结果上并未得到预期那样的效果，还存在产生器官功能不全、体液潴留（给予IL-2的情况 下）、感冒症状或精神障害（给予干扰素的情况下）等严重副作用的问题。
[0004] 所谓疫苗疗法，是指直接或间接地接种对癌细胞特异性抗原或肽，激活针对该抗 原的免疫系统的治疗法（非专利文献3)。该治疗法虽然报告了一些有效案例，但是存在对 不表达HLA I类的肿瘤等没有效果等问题。
[0005] 所谓BRM疗法，是指利用修饰患者对肿瘤细胞等的生物应答性的物质的治疗法 (非专利文献4)。作为BRM，已知PSK、苯丁抑制素、0K432等。该治疗方法已经在一部分的 癌等中确认了有效性，但本来多是作为通过与外科疗法、化学疗法这样的造成免疫力降低 的其他治疗法并用来取得效果的辅助疗法。此外，存在免疫力不一定增强、单独使用时的抗 癌效果等弱的问题。
[0006] 细胞免疫疗法是通过将从患者采取的免疫细胞在体外进行活化、增殖等的处理后 再次回输到该患者的体内，从而提高该患者的免疫力的治疗法，也称为"过继免疫疗法（广 义的过继免疫疗法）"（非专利文献5)。根据体外处理的免疫细胞的种类，细胞免疫疗法分 为激活淋巴细胞疗法、树突状细胞疗法。其中，关于树突状细胞疗法，由于临床试验才刚刚 开始，所以还未能得到足以判断有效性的结果。
[0007] 激活淋巴细胞疗法进一步分为在体外对T细胞进行活性?增殖处理的狭义的激活 淋巴细胞疗法（激活T淋巴细胞疗法、或狭义的过继免疫疗法）和对NK细胞进行活性?增 殖处理的激活NK细胞疗法。
[0008] 狭义的激活淋巴细胞疗法，例如有LAK(淋巴因子激活的杀伤细胞）疗法、TIL(月中 瘤组织浸润淋巴细胞）疗法、CTL (细胞毒性淋巴细胞）疗法等。
[0009] LAK疗法是培养从患者采取的淋巴细胞，使T细胞、NK细胞活化或增殖后回输到 体内的方法（非专利文献6)。该方法为了维持给予体内的LAK活性，需要向体内给予大量 的IL-2,因此，存在伴有与前述利用IL-2的细胞因子疗法同样的副作用、不能获得预期那 样的效果的问题。
[0010] TIL疗法是采取浸润到肿瘤组织等的淋巴细胞，与LAK疗法同样地体外培养后回 输到体内的方法（非专利文献7)。然而，该方法存在只能从手术摘出组织采取淋巴细胞、不 能获得预期那样的效果的问题。
[0011] CTL疗法是将淋巴细胞与手术采取的癌细胞等一起培养，通过刺激来对该癌细胞 等诱导特异性淋巴细胞的方法（非专利文献8)。也有有效案例的报告，但是存在必须通过 手术采取癌细胞，因而侵袭性极高，适应症例有限，另外在不能采取并培养癌细胞的情况下 治疗变得困难的问题，只对表达主要组织相容性抗原的癌有效等的问题。
[0012] 另一方面，激活NK细胞疗法为将增殖和活化了的NK细胞移入体内的方法。NK细 胞是不需要被抗原致敏，能够杀伤癌细胞、病毒感染细胞的淋巴细胞集团（非专利文献9~ 11)。在动物实验中，已知它能够抑制癌的浸润?转移（非专利文献12)，此外，长期大规模 队列研究中也有外周血中的NK细胞活性高的人相比于低的人癌的发生率显著降低这样的 报告（非专利文献13)。因此，如果在体外大量地增殖并活化患者的NK细胞，然后重新移入 该患者体内，则能够治疗癌、病毒感染症等。然而，NK细胞通常在健常人的淋巴细胞中也只 存在几~十几％左右，对于癌患者其数量进一步降低。此外，即使NK细胞数相同，与健康人 相比，癌患者的血中的NK细胞的癌细胞毒活性也多降低。因此，需要通过培养进行增殖和 活化。以往生物体外的NK细胞增殖一直是困难的，但是通过近年来很多的研究，已有报告 NK细胞增殖培养的成功案例（非专利文献14~17)。然而，那些方法为了强化NK细胞，利 用培养的癌细胞、基因导入细胞，在临床应用时的安全性?实用性方面存在未解决的问题。 此外，关于NK细胞增殖效率?细胞活性，也处于未达到充分满足的水平的状况。
[0013] 如上，以往的免疫疗法的任何一种方法都存在不能得到充分的治疗效果、伴有严 重的副作用、或者其他应该改善的问题。
[0014] 因此，本申请的发明人等为了解决上述课题，进行了深入研究，结果成功地开发了 通过将从生物体采取的血液中的NK细胞与增殖NK细胞的刺激因子一起在特定温度下处理 特定时间，从而使其有效地强化的NK细胞强化型血液制剂的制造方法，并取得了关于该制 造方法和NK细胞强化型血液制剂的专利（专利文献1)。该方法得到的NK细胞强化型血 液制剂被实际使用于临床阶段，得到了大量非常良好的临床结果（非专利文献18~20)。 然而，该制造方法存在制造工序有些复杂、为充分激活NK细胞而必须较长时间（10~30小 时）地将培养基保持在特定的温度下、温度管理上需要工夫、制剂完成之前需要时间的问 题。
[0015] 现有技术文献
[0016] 专利文献
[0017] 专利文献1:日本特许第4275680号
[0018] 非专利文献
[0019] 非专利文献 I :Milani V，et al.，2009，J trans ResjGOhl-lS-tOC^O] 非专利文献 2 :Rosenberg SA, et al.，1985, J Exp Med.，161: llGg-SS-tOC^I] 非专利文献 3 :Bendandi，M.et al.，1999, Nature Med, 5:1171-1177.
[0022]非专利文献 4 :Fisher M，et al.，2002, Anticancer Res.，22:1737-54.
[0023]非专利文献 5 :Takayama Y et al.，2000, Lancet, 356:802-807.
[0024]非专利文献 6 :Mule JJ, et al. , 1985, J Immunol. , 非专利文献 7 :Dudley ME, et al. , 2003, J Immunother. , 26:332-42.
[0026]非专利文献 8 :Araki K et al. , 2000, Int J Oncol. , 17(6) :1107-18.
[0027]非专利文献 9 : Stagg J and Smyth M J.，2007, Drug News Perspect, 20(3):155-163.
[0028]非专利文献 10 :Terme M et al.，2008Nat. Immunol, 9 (5) : 486-493.
[0029]非专利文献 11 :Vivier E et al.，2008, Nat. Immunol, 9(5) :503-510.
[0030]非专利文献 12 :Dewan MZ et al.，2007, Breast Cancer Res Treat, 104:267-275.
[0031]非专利文献 13 :Imai K et al.，2000, Lancet, 356:1795-1799.
[0032]非专利文献 14 :Harada H et al.，2002, JPN J Cancer Res, 93:313-9.
[0033]非专利文献 15 :Carlens S et al.，2001Hum Immunol, 62:1092-8.
[0034]非专利文献 16 :Berg M et al.，2009, Cytotherapy, 11 (3) : 341-55.
[0035]非专利文献 17 :Fujisaki H et al.，2009, Cancer Res, 9:4010-7.
[0036]非专利文献 I8 :Brillard E et al.，2〇〇7, Exp Hemato, 35:416_425.
[0037]非专利文献 19 :Cooke A and Brode S.，2008, Critical Rev immununol. , 28(2):109-126.
[0038]非专利文献 20 :Hsu KC et al.，2005, Blood, 105:4878-4884.
【发明内容】
[0039] 发明所要解决的课题
[0040] 本发明的课题在于，开发对供体和患者侵袭性低、制造工序简便、并能够迅速且大 量地强化从生物体采取的血液中的NK细胞的新的NK细胞强化型血液制剂的制造方法，安 全且比较便宜地提供由该方法得到的NK细胞强化型血液制剂。
[0041] 用于解决课题的方法
[0042] 本发明人等为了解决上述课题，对NK细胞强化型血液制剂的制造方法反复进行 了进一步深入研究，结果成功地开发了不需要作为前述日本特许第4275680号的NK细胞强 化型血液制剂的制造方法的必需工序的、在特定温度下保持特定时间的工序，而强化NK细 胞增殖活性的新的NK细胞强化型血液制剂的制造方法。
[0043] 本发明是基于上述开发结果而完成的，提供以下发明。
[0044] (1) 一种NK细胞强化型血液制剂的制造方法，包括下述工序：
[0045] 刺激工序，通过包含抗⑶16抗体、0K432、抗⑶137抗体和细胞因子的NK细胞增殖 刺激因子来刺激从生物体采取的血液中所含的NK细胞，和
[0046] 培养工序，在刺激工序之后，在生理细胞温度下培养该血液。
[0047] (2)根据⑴所述的制造方法，细胞因子是IL-2。
[0048] (3)根据⑴或⑵所述的制造方法，NK细胞增殖刺激因子进一步包含抗⑶3抗 体、和/或双膦酸衍生物或其盐或它们的水合物。
[0049] (4)根据（1)~（3)中任一项所述的制造方法，生理细胞温度为36. 5~37. 5°C。
[0050] (5)根据⑴~⑷中任一项所述的制造方法，培养工序中的培养期为7天~30 天。
[0051] (6)根据⑴~（5)中任一项所述的制造方法，抗⑶16抗体被固相化于支持体。
[0052] (7) -种NK细胞强化型血液制剂，是通过⑴~（6)中任一项所述的制造方法得 到的。
[0053] (8) -种NK细胞强化用组合物，包含抗⑶16抗体、0K432、抗⑶137抗体和细胞因 子。
[0054] (9)根据⑶所述的组合物，细胞因子是几-2。
[0055] (10)根据（8)或（9)所述的组合物，进一步包含抗⑶3抗体、和/或双膦酸衍生物 或其盐或它们的水合物。
[0056] (11) 一种NK细胞强化型血液制造用试剂盒，包含⑶~（10)中任一项所述的NK 细胞强化用组合物。
[0057] 发明的效果
[0058] 根据本发明的NK细胞强化型血液制剂的制造方法，能够比以往方法更加迅速且 简便地调制血液中的NK细胞，能够进一步提高NK细胞的增殖率。此外，根据本制造方法， 由于能够从从外周血制造，因而具