答，从而产 生治疗效果的物质。已知0K432作为免疫佐剂，能够与单核细胞等的细胞表面TLR结合，活 化单核细胞，激活免疫反应（Ryoma Y，et al.，2004, Anticancer Res. ,24:3295-301.)。
[0089] 所谓"细胞因子"，是负责细胞间的信号转导的多种蛋白质类激素，在免疫系统中， 如前所述具有强化T细胞、NK细胞等淋巴细胞的作用。例如，可举出白介素（Interleukin)、 干扰素（Interferon ;INF)、TNF、MCP等。适合作为本发明的NK细胞增殖刺激因子的细胞 因子可举出例如，白介素2 (以下表示为"IL-2"。以下对于其他的白介素也同样地表示）、 IL-12、IL-15、IL-18、TNF-a、IL-10等。其中，本发明中特别优选的细胞因子为IL-2。
[0090] 本发明的NK细胞增殖刺激因子，除了上述必需的因子以外，根据需要，还可以包 含抗CD3抗体、或者双膦酸衍生物或其盐或它们的水合物（以下称为"双膦酸衍生物等"）、 和/或除0K432以外的BRM等。
[0091] 所谓"抗CD3抗体"，是针对CD3的抗体。本发明的NK细胞增殖刺激因子中使用的 抗CD3抗体，只要是特异性地识别并结合CD3的抗体，就不特别限定。可以是单克隆抗体、 多克隆抗体的任一种。优选为单克隆抗体。可举出例如，莫罗单抗（Muromonab)CD3(商品 名：才；P y夕口一> (Orthoclone)OKT3 (注册商标）、亇>七>7 7- Y社）。
[0092] 所谓"双膦酸衍生物"，是指下述通式1表示的化合物。
[0093]
[0094] 上述式中，R1表示氢原子（H)或低级烷基，RjPR 3分别独立地表示氢原子、卤素、 羟基、氨基、巯基、被取代或未被取代的芳基、被取代或未被取代的烷基、低级烷基氨基、芳 烷基、环烷基或杂环基，或私和R 3形成包含它们的环状结构的一部分，形成该环状结构的取 代基在R2和R3中分别独立地来源于卤素、低级烷基、羟基、巯基、氨基、烷氧基、芳基、芳硫 基、芳氧基、烧硫基、环烷基或杂环基。
[0095] 作为双膦酸衍生物的具体例子，可举出唑来膦酸、帕米膦酸、阿仑膦酸、利塞膦酸、 伊班膦酸、英卡膦酸、依替膦酸。
[0096] 本发明中，可以添加一种以上的双膦酸衍生物等作为NK细胞增殖刺激因子。本发 明中，特别优选的双膦酸衍生物为唑来膦酸或具有NK细胞的强化活性的唑来膦酸衍生物 或其盐或它们的水合物。
[0097] 唑来膦酸（商品名：y夕（注册商标）、y八;!/亍4只77-Y社）为具有 骨吸收抑制活性的双膦酸，其作为针对恶性肿瘤引起的高钙血症或多发性骨髓瘤引起的 骨病变和实体癌骨转移引起的骨病变的治疗药为人所知。此外，由于其化学结构中包含 含氮的双膦酸（N_BPs:Nitrogen containing-BisphosPhonate)，因此在细胞内抑制焦 磷酸法呢酯（Farnesyl PyrophosPhate，FPP)的合成，其结果是，作为前体的焦磷酸异戊 稀（IsoPentenyl Pyrophosphate，IPP)蓄积。有报告通过这种方式，能够激活其生物 体的免疫反应（van Beek E，et al.，1999，Biochem Biophys Res Commun, 264:108-11; Gober HJ，et al.，2003, J Exp Med, 197:163-8.)，使 y S T 细胞的增殖活性亢进 (Sato K, et al. , 2005, Int. J. Cancer, 116:94-99 ；Kondo M, et al. , 2008, Cytothera py, 10(8) :842-856.) 〇
[0098] 所谓"其盐"，是指前述双膦酸衍生物、优选为唑来膦酸的碱性加成盐。作为碱性加 成盐，可举出例如，钠盐或钾盐这样的碱金属盐，钙盐或镁盐这样的碱土类金属盐，三甲胺 盐、三乙胺盐、二环己胺盐、乙醇胺盐、二乙醇胺盐、三乙醇胺盐或普鲁卡因盐这样的脂肪族 胺盐，N，N-二苄基乙二胺这样的芳烷基胺盐，吡啶盐、甲基吡啶盐、喹啉盐或异喹啉盐这样 的杂环芳香族胺盐，精氨酸盐或赖氨酸盐这样的碱性氨基酸盐，铵盐或四甲基铵盐、四乙基 铵盐、苄基三甲基铵盐、苄基三乙基铵盐、苄基三丁基铵盐、甲基三辛基铵盐或四丁基铵盐 这样的季铵盐。
[0099] "除0K432以外的BRM"中，可举出例如，从担子菌类提取的蛋白质多糖复合 物，更具体地，可列举从香燕中提取的香燕多糖（Lentinan)、从云芝中提取的云芝多糖 (Krestin (注册商标））。
[0100] (4)刺激方法
[0101] 所谓"刺激"，是指通过使上述NK细胞增殖刺激因子接触NK细胞，从而强化该NK 细胞。
[0102] 作为具体的刺激方法，首先用培养基调制从生物体采取的血液、例如PBMCs使得 例如细胞密度为IX IO6~3 X 10 6个/mL。这里所用的培养基可以使用向细胞培养用的适 当培养基中以体积比（V/V)5~10%左右添加已灭活处理的人血清或血浆而得的的培养 基。在以前述过继免疫疗法中的给予为前提的情况下，期望前述培养基使用向OpTmizer这 样的过继免疫疗法用的无血清培养基中添加自体血浆而得的培养基。如前所述，自体血浆 从血液采取工序后得到的血液来调制即可。例如，可以将采取的外周全血在室温（l〇°C~ 30°C :以下相同）下以3000rpm离心10分钟左右得到的上清作为自体血浆。此外，可以根 据需要向培养基中添加链霉素、青霉素、卡那霉素、庆大霉素等抗生素。
[0103] 接着，向预先调制的包含PBMCs的培养液中添加NK细胞增殖刺激因子。
[0104] 通过抗⑶16抗体来刺激的情况下，可以向培养基中直接添加抗体或者以将该 抗体固相化于支持体的状态添加，使得例如终浓度为〇. 01 y g/mL~100 y g/mL，优选为 0.1 yg/mL~lOyg/mL，更优选为I yg/mL。优选为以固相化于支持体的状态添加。这是因 为通过将抗CD16抗体固相化，其与NK细胞在一定方向上的接触频率变高，能够比游离状态 时更高效地给予NK细胞增殖刺激。这里所说的"支持体"，是指固定抗体的支架。支持体的 材质只要是能够以稳定的状态固定抗体的材质，就不特别限定。例如，可以利用塑料等合成 树脂、玻璃、金属等。对支持体的形状不特别限定，优选与培养液的接触表面积大到使得固 相化于该支持体的抗体与NK细胞的接触频率更高的形状，可举出例如，球状珠、具有淋巴 细胞大的孔的多孔质立方体等。
[0105] 将抗CD16抗体固相化于支持体的方法，如果支持体的材质为像塑料等这样与抗 体亲和性高的物质，则只要使抗体溶液与支持体接触（包含浸渍、涂布、流通、喷雾等），并 保持规定的温度和时间，就能够固定。抗CD16抗体溶液可以如下获得：例如，用无菌蒸馏水 或细胞培养用培养基溶解抗CD16抗体后，根据需要，例如，用孔径0. 22 y m的过滤器进行过 滤灭菌，用无菌蒸馏水或培养基调整使得终浓度为I y g/mL而得到。将抗CD16抗体固相化 于支持体的情况下，优选使用考虑了固相化的支持体的表面积等的液量的抗CD16抗体溶 液。例如，如果是固相化于内壁表面积150cm 2的塑料瓶的情况，则使用I y g/mL的抗⑶16 抗体溶液15mL左右即可。此外，25cm2和75cm2的培养瓶的情况下，分别使用5mL和IOmL即 可。其后，在37°C下孵育12~24小时，抗CD16抗体附着于支持体。或者，也可以使用市售 的抗体固定化试剂盒等。例如，可以利用CarboLink(PIERCE社）等。这样的固定化试剂盒 对于支持体为抗体难于附着的材质的情况是有用的。
[0106] 将抗CD16抗体固相化于支持体后，期望根据需要，洗涤固相化了抗CD16抗体的支 持体，除去抗CD16抗体溶液。关于洗涤，例如，用适量的PBS洗涤支持体数次、例如2~5 次左右即可。这样在支持体上固相化了抗⑶16抗体的培养容器通过在0°C~8°C、优选为 3°C~6°C保存，能够不使抗体活性减少或失活地使用约1个月。
[0107] 通过抗⑶137抗体来刺激的情况下，在包含PBMCs的培养液中以例如终浓度为 0.1 y g/mL~10 y g/mL添加抗体即可。这是因为，在少于0.1 y g/mL的情况下，在诱导增 殖刺激方面不充分，另外，在多于10 y g/mL多的情况下，反而抑制NK细胞的增殖。优选为 0? 3 y g/mL ~6 y g/mL、更优选为 I y g/mL ~3 y g/mL。
[0108] 通过0K432来刺激的情况下，在包含PBMCs的培养液中以例如终浓度为0. 005KE/ mL ~0. 05KE/mL、优选为 0. 008KE/mL ~0. 015KE/mL、更优选为 0. 01KE/mL 添加 0K432 溶液 即可。0K432溶液可以将二一少（5KE/瓶冲外制药社）用水（例如，注射用水）2mL 溶解而调制。
[0109] 通过细胞因子来刺激的情况下，既可以单独添加，也可以组合多种类型而添加。如 果考虑成本方面等，优选单独添加IL-2。添加的量，例如，对于IL-2,优选终浓度为100单 位（U)/mL~2000U/mL的范围。这是因为，如果少于100U/mL，则在诱导增殖刺激方面不充 分，另外，如果多于2000U/mL，则并不能看到与IL-2浓度的增加相应的NK细胞的增殖。优 选为700U/mL~2000U/mL的范围。
[0110] 此外，NK细胞增殖刺激因子包含抗⑶3抗体和/或双膦酸衍生物等的情况下，抗 CD3抗体添加到包含PBMCs的培养液中，使其例如终浓度为0.0 lng/mL~lOOOng/mL、优选 为0.1 ng/mL~10ng/mL、更优选为Ing/mL即可。此外，NK细胞增殖刺激因子包含双膦酸衍 生物等的情况下，直接使用挫来膦酸水合物注射液（2. 94 ymol/mL ; 7八4只7 7 - V社）4mg/瓶即可。或者，向培养基添加使其例如终浓度为I yM/mL~10 yM/mL、优选为 3 y M/mL~7 y M/mL、更优选为5 y M/mL即可。
[0111] 添加前述各NK细胞增殖刺激因子后，为了给予PBMCs充分的刺激，优选将该血液 在后述的生理细胞温度保持1~3天。此期间可以与接下来的培养工序同时进行。即，可 以一边给予刺激一边培养NK细胞等。
[0112] 另外，在上述生理细胞温度的保持期间内，可以在38°C~40°C下以10小时~30 小时的时间施加高温刺激。通过该高温刺激，可以使NK细胞更进一步活化。此外，刺激工 序中的保持温度低于37°C情况下，不能使淋巴细胞充分地活化，另外，高于40°C的情况下， 淋巴细胞受热而变性、损伤的可能性变高，因此不优选。
[0113] 关于保持在规定的温度的方法，只要能够将血液保持在一定温度，就不特别限定。 可举出例如，使用CO 2培养箱，将每个装有该血液的容器设定于规定的温度的方法。
[0114] 1-2-2?培养工序
[0115] 所谓"培养工序"，是在刺激工序之后，将该血液在生理细胞温度下培养的工序。本 工序的特征在于，一边维持NK细胞的强化，一边增加其细胞数。
[0116] 所谓"生理细胞温度"，是指在培养细胞方面最适的温度。通常为提供使用的血液 的哺乳动物的体温。因此，在前述哺乳动物为人的情况下，一般为37°C，在以该温度为中心 小于0. 5°C的范围内、即36. 5~37. 5°C即可。这是因为，培养箱内的温度有可能在前述温 度范围内前后变化。
[0117] 本工序可以将确保用初期刺激工序中给予的NK细胞增殖刺激因子充分刺激NK细 胞的时期和这些细胞的培养同时进行，但是优选在进行了充分的刺激之后，从培养基暂且 除去NK细胞增殖刺激因子、解除刺激工序。这是因为，细胞因子等因子大多即使在培养工 序中也能够对NK细胞继续给予强化诱导刺激，但抗⑶16抗体、抗⑶137抗体、0K432、抗⑶3 抗体和/或唑来膦酸等的对NK细胞的长期刺激可能会造成如细胞凋亡等这样的对NK细胞 的强化不期望的影响。