有对供体和患者侵袭性低的优点。
【附图说明】
[0059] 图1表示实施例的样品a (上段）和样品b (下段）的培养第0天、第14天和第21 天的散点图。各散点图中，横轴以对数标尺表示PC5标记-抗CD3抗体（第0天）、ECD标 记-抗⑶3抗体（第14和21天）的荧光强度，纵轴以对数标尺表示PE标记-抗⑶56抗体 (第0天）、PC5标记-抗CD56抗体（第14和21天）的荧光强度。基于前述各种荧光的强 度，将散点图划分为4个区域（BI~B4)。Bl (⑶3⑶56+)中分布着NK细胞，B2(⑶3+⑶56+) 和B4 (⑶3+⑶56 )中分布着T淋巴细胞，并且B3 (⑶3⑶56 )中分布着B细胞等除上述细胞 以外的细胞。各区域内的数值表示所测定的培养细胞中，该区域所含细胞的比例（％)。
[0060] 图2是表示实施例的样品a和b的培养天数与培养总细胞数的关系的细胞增殖曲 线。
[0061] 图3表示实施例的样品a和b的培养第14天和第21天的NK细胞的细胞毒活性。 X轴的E/T比为作为效应细胞（E)使用的培养NK细胞与靶K562细胞（靶细胞：T)的比。Y 轴以相对于不加效应细胞的毒害前的对照的相对值（％)表示NK细胞对K562的细胞毒活 性。
[0062]图4是表示实施例的样品a和P的培养天数与培养总细胞数的关系的细胞增殖 曲线。
【具体实施方式】
[0063] I. NK细胞强化型血液制剂的制造方法
[0064] 1-1?概要
[0065] 本发明的第一方式是NK细胞强化型血液制剂的制造方法。本方式的特征在于，用 增殖刺激因子来刺激从生物体采取的血液中的NK细胞，然后在生理细胞温度下培养。
[0066] 本发明中所谓"强化"，意思是使细胞增殖和/或活化，或者使细胞增殖和/或活化 了。本说明书中所谓细胞的"活化"，是指细胞、特别是NK细胞所具有的功能亢进或增大。 可举出例如，细胞毒功能亢进?增大、NK细胞表面的参与活性和/或增殖的受体的表达亢 进?增大等。本发明中所谓"NK细胞强化型血液制剂"，是指通过本方式的制造方法得到的 以包含大量的活化NK细胞的血液为主成分的制剂。
[0067] 1-2?构成
[0068] 本方式的NK细胞强化型血液制剂的制造方法包括刺激工序和培养工序。以下关 于各工序的构成具体进行说明。另外，本方式中，前提是各操作原则上以使用经灭菌处理的 试剂、培养基、器具等，培养在洁净室内的洁净工作台等无菌环境下进行。这是为了防止杂 菌等的污染。
[0069] 1-2-1?刺激工序
[0070] 所谓"刺激工序"，是通过NK细胞增殖刺激因子来刺激从生物体采取的血液中所 含的NK细胞的工序。
[0071] ⑴血液
[0072] 本发明中所谓"血液"，是指包含NK细胞的血液成分。例如有全血、脐带血、骨髓 液或其成分的一部分、例如单核细胞等。可以使用任一种血液，但在NK细胞强化型血液制 剂的制造上，红细胞、粒细胞等血液成分可成为阻碍因素，因此优选单核细胞。其中，特别 优选从外周血得到的外周血单核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells:以下称为 "PBMCs"）。这是因为，如果是外周血，则不仅能够不选择时期地从生物体容易地采取，而且 对供体的侵袭性低。
[0073] 本发明中所谓"生物体"，是指活着的哺乳动物。不要求哺乳动物的种类，但优选为 人。期望作为对象的生物体与给予用本发明的制造方法得到的NK细胞强化型血液制剂的 哺乳动物为相同的种类。例如，在将本发明的NK细胞强化型血液制剂给予人的情况下，优 选血液从人采取。更优选从与受者的HLA(人白细胞抗原）基因型匹配的供体采取。例如， 在受者进行器官移植或干细胞移植时通常其器官或干细胞的供体是与受者的HLA基因型 相匹配的供体。此外，多数情况下，HLA基因型匹配的适宜的受者为血缘关系者。这是因为， 如果是来自HLA基因型匹配的供体的血液的血液制剂，则能够尽可能多地排除给予后受者 发生排斥反应的可能性。因此，最优选给予本发明的NK细胞强化型血液制剂的受者自身为 其供体，即，进行以过继免疫疗法为前提的血液采取。以过继免疫疗法为前提的情况下，采 取的生物体不必须是健常体。例如，也可以是从罹患癌、病毒感染症的供体采取的血液。另 外，以下除非另有说明，本发明中所谓过继免疫疗法意思是前述的广义的过继免疫疗法。
[0074] 所谓"从生物体采取"，意思是来自生物体。例如，除了像外周血、骨髓液那样将 注射针等直接刺入生物体来采取的血液、像脐带血那样从分娩后的脐带直接采取的血液之 外，还可以考虑从移植器官的回流液采取的血液。也可以是从向前述采取的血液中添加肝 素等实施抗凝处理后或进一步分离单核细胞后、将它们暂且冷藏或冷冻保存后的保存血液 等中采取的血液。
[0075] (2)血液的调制
[0076] 本工序中使用的血液为从生物体直接采取的血液的情况下，其采取方法依照公知 的采血方法即可。例如，对于外周血，注射外周部的静脉等进行采取即可；对于骨髓液，通过 骨髓穿刺（V少夕）采取即可；对于脐带血，将针刺入分娩后胎盘的娩出前脐带进行采取即 可。以下，关于外周血的采取，举出一例进行具体说明。
[0077] 外周全血可以通过将注射针刺入生物体的外周部血管，例如，静脉或动脉，通过 真空采血管、采血袋等公知的全血采取法进行采取。采取的容量根据必要的NK细胞强化 型血液制剂的量而变动，例如，制造对成人一人给予一次的前述血液制剂的情况下，通常有 20mL~60mL即可。其中，像癌患者那样血中的PBMCs数极其低下的情况下，也可以通过成 分采血（析离：apheresis)选择性地仅采取必要量的PBMCs。为了采取后血液不凝固，优选 例如，预先用肝素等血液抗凝剂或凝血抑制剂涂布采血管注射器内部等，或向采取的血液 中添加肝素等。此外，也可以从外周全血分离出血浆，只使用血细胞成分。血浆的分离例如 可以如下实现：将外周全血转移至离心管，以2000rpm~4000rpm离心5~20分钟，除去其 上清液，从而实现。分离的血浆可以通过56°C下加温30分钟左右进行灭活，以2000rpm~ 4000rpm离心5~20分钟，除去血小板等沉淀物，从而作为细胞培养的营养源使用。
[0078] 根据需要，也可以从外周全血进一步分离PBMCs。PBMCs可以以聚鹿糖-泛影 钠（Ficoll-Hypaque)、聚鹿糖-碘酞葡胺（Ficoll-Conray)作为比重液，使用密度梯度 离心法，从外周全血或血浆分离后的血细胞成分中得到。这些比重液利用市售的分离液 等是便利的。例如，可以利用 Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare Life Sciences 社）、 LYMPHOPREP (AXIS-SHIELD社）等。关于PBMCs的分离方法，依照试剂盒附带的说明书即可。
[0079] 为了除去比重液，将分离后的PBMCs用PBS (_)、培养细胞用的培养基洗涤数次。其 中，作为培养细胞用的培养基，可以使用例如，不含血清的PBS(-)、或RPMI-1640培养基或 其他用于培养的无血清培养基等。优选用前述PBS(-)或培养基洗涤后，用血细胞计数板 计算回收的PBMCs数目。通常，健康成人的情况下，可以从20mL~60mL的外周全血回收 2 X IO7个以上的PBMCs。
[0080] 本工序中使用的血液为冷冻或冷藏血液的情况下，根据公知的方法解冻和加温处 理后使用即可。可举出例如，向冻结保存的PBMCs中添加RPMI-1640培养基解冻后，在37°C、 5% CO2下孵育3小时的方法。
[0081] (3) NK细胞增殖刺激因子
[0082] 本发明中所谓"NK细胞增殖刺激因子"，是指直接地或间接地强化NK细胞的因子。 直接强化的因子中，可举出例如，具有通过与NK细胞表面上的受体特异性结合，在该NK细 胞的细胞内传递增殖信号或活化信号的功能的因子。此外，间接地诱导的因子中，可举出 例如，与NK细胞以外的单核细胞等的细胞表面的受体结合，诱导细胞因子等体液因子产 生?释放的因子。NK细胞被释放的体液因子间接地强化。
[0083] 本发明的NK细胞增殖刺激因子包含抗⑶16抗体、抗⑶137抗体、0K432和细胞因 子作为必需的因子。
[0084] 所谓"抗⑶16抗体"，是针对⑶16抗原的抗体。⑶16抗原是NK细胞、粒细胞的标 志物，作为休止期的大多数NK细胞的细胞表面上存在的Fc受体的结构蛋白质Fe y RIII而 为人所知。关于抗CD16抗体的NK细胞增殖诱导活性，是日本特许第4275680号中提出的， 在此之前并未为人所知。尽管抗CD16抗体的NK细胞增殖诱导机制尚不明确，但通过将抗 CD16抗体与IL-2等的细胞因子一起添加，与单独添加细胞因子的情况相比，能够飞跃性地 增大NK细胞的增殖诱导率（日本特许第4275680号；非专利文献1)。本抗体可以为单克 隆抗体、多克隆抗体和它们的片段中的任一种。
[0085] 本说明书中所谓"它们的片段"，是指作为多克隆抗体或单克隆抗体的部分片段 的、具有与该抗体所具有的抗原特异性结合活性实质上同等的活性的多肽链或其复合物。 例如，包含至少1个前述的抗原结合部位的抗体部分，即，具有至少一组的轻链可变区域 (VL)和重链可变区域（VH)的多肽链或其复合物。作为具体例子，可举出通过将免疫球蛋白 用各种肽酶切断而产生的大量带有充分特征的抗体片段等。例如，Fab、F(ab'）2、Fab'等。 这些抗体片段均包含抗原结合部位，具有与抗原（即，此处为CD16)特异性结合的能力。
[0086] 此外，本说明书中，单克隆抗体也可以是化学合成或使用重组DNA法合成的合成 抗体。例如，可举出使用重组DNA法构建的抗体。具体为介由具有适当的长度和序列的连 接肽等将本发明的单克隆抗体的一个以上的VL和一个以上的VH人工连接而成的单体多 肽分子、或其多聚体多肽（多元抗体），但不限于此。作为这样的多肽的例子，可举出单链 Fv(scFv:single chain Fragment of variable region(可变区的单链片段）、双价抗体 (diabody)、三价抗体（triabody)或四价抗体（tetrabody)等。双价抗体这样的二价以上的 多价抗体中，各抗原结合部位不必须与同一表位结合，也可以分别识别不同的表位，具有特 异性结合的多重特异性。作为本发明的抗CD16抗体，优选的抗体是单克隆抗体、即抗CD16 单克隆抗体。特别优选以人CD16作为抗原的抗人CD16单克隆抗体。这样的抗体可以利用 市售品。例如，作为抗人⑶16单克隆抗体，可举出3G8、B73. 1等。
[0087] 所谓"抗⑶137抗体"，是针对⑶137抗原的抗体。⑶137抗原是属于共刺激分子群 TNF受体超家族的30kDa的糖蛋白。已经明确了抗⑶137抗体引起的活化有助于T细胞活 化、活性 T 细胞和记忆 T 细胞的维持（Schwarz H，et al. 1996, Blood 87:2839-2845 ;Croft M, et al. 2003 ;Nat Rev Immulo. 3:609-620)。另一方面，目前为止还未知证实了对人NK细 胞的活化等的报告（Baessler T，et al. 2010 ;Blood 115:3058-3069)。本发明的 NK 细胞 增殖刺激因子中使用的抗CD137抗体，只要是特异性地识别并结合CD137抗原的抗体，就不 特别限定。可以包含单克隆抗体、多克隆抗体和它们的片段。优选为单克隆抗体。本发明 的单克隆抗体可以利用市售的抗体。例如，作为抗人CD137单克隆抗体，可举出4_1BB、G6、 4B4-1、0? N. 185、BBK-2、C-20、D-20、G-l、N-16、BBEX2 或 Lq-14 等。
[0088] 所谓"0K432"（商品名：匕二一;I/(Picibanil))，是以青霉素处理后的溶血 性链球菌（化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes) A群3型）Su株为有效成分的抗肿瘤 制剂，属于前述BRM。如前所述，"BRM"是指通过修饰宿主对肿瘤细胞的生物学应