除去方法，例如，在刺激工序之后，从培养液回收PBMCs，然后转移至 不含抗CD16抗体、抗CD137抗体和0K432、以及抗CD3抗体、唑来膦酸等的新的培养液中即 可。前述因子的除去和PBMCs的回收通过对经过刺激工序的培养液进行离心处理、除去上 清来实现。具体的方法依照以下叙述的培养基交换的方法进行即可。
[0118] 培养在处于生理细胞温度条件下的5% CO2培养箱内进行7天~30天，优选为9 天~28天、12天~26天、或14天~24天。
[0119] 期望在培养期内以2~5天为间隔定期地添加新的培养基或交换为新的培养基。 培养基交换的具体例子为，首先，将包含刺激工序后的NK细胞的培养液转移至已经灭菌的 离心管中，接着，室温下以约1200rpm离心8分钟左右，然后除去上清或回收包含NK细胞的 沉淀物。回收的细胞沉淀物转移至包含IL-2和血浆的新的培养液中使得细胞密度为0. 6~ 1.0 X 106/mL。此时添加的IL-2等细胞因子以终浓度计为300U/mL~700U/mL左右即可。 这是因为，刺激工序后NK细胞已经被激活，NK细胞自身在产生IL-2等细胞因子。
[0120] 培养中使用的培养基原则上可以使用细胞培养中使用的任一种一般的培养基。可 举出例如，AIM-V 培养基（life technologies 社）、RPMI_1640 培养基（life technologies 社）、Dulbecco' s Modified Eagle's Medium(DMEM ; life technologies 社）、OpTmizer T-cellExpansion SFM(life technologies 社）、TIL(株式会社免疫生物研究所）、表皮 角化细胞培养基（KBM ; 3-^ A 4 才株式会社）、Iscove' s Modified Dulbecco' s Medium(IMEM ;life technologies社）、Alys培养基（株式会社细胞科学研究所）等。优 选为OpTmizer培养基。
[0121] 培养后确认培养液中无细菌、内毒素的污染。菌的有无可以通过菌落形成试验法 来检验，另外内毒素的有无可以通过市售的ELISA等的比色法、鲎试验等的混悬法来检验。
[0122] 1-3.效果
[0123] 根据本方式的NK细胞强化型血液制剂的制造方法，能够由从生物体采取的血液 来制造强化了 NK细胞的血液制剂。
[0124] 根据本方式的NK细胞强化型血液制剂的制造方法，日本特许第4275680号中作为 必需工序的在规定的温度保持规定的时间的工序（活化工序；相当于作为本发明的刺激工 序中的任意步骤的高温刺激）变为非必需工序。由此，使活化工序中曾经必要的设定到规 定温度的培养箱也变得未必是必要的，所以，能够大幅减轻实施本发明的研究设施的设备 方面、实施者的操作?管理方面的负担。
[0125] 此外，根据该制造方法，从生物体采取的血液也可以是外周血，因此，能够将对供 体的身体负荷控制在最小限度。
[0126] 根据该制造方法，不需要特殊的专用仪器等，可以直接进行细胞培养的一般检查 设施、研究设施等中常备的仪器等，所需的试剂等也均容易获得。因此，具有只要是洁净室 等能够无菌作业的研究设施，则几乎不需要初期设备投资等就能够实施本方式的制造方法 的优点。
[0127] 根据本方式的制造方法得到的NK细胞强化型血液制剂，在实际的临床实验中，能 够预防癌的复发、有效地治疗进行癌。此外，给予该血液制剂时未发现副作用等，能够提供 安全的血液制剂。
[0128] 此外，使用双膦酸衍生物作为NK细胞增殖刺激因子的一种的情况下，由于双膦酸 衍生物具有使T S T细胞的增殖活性亢进的作用，因此，不仅得到NK细胞的增殖，还能够得 到Y ST细胞的显著的增殖效果。
[0129] 2. NK细胞强化型血液制剂
[0130] 2-1.概要
[0131] 本发明的第二方式是通过第一方式的制造方法得到的NK细胞强化型血液制剂。
[0132] 2-2.构成
[0133] 本方式的NK细胞强化型血液制剂可以从前述第一方式中经过培养工序后的培养 液中得到。但是，在NK细胞强化型血液制剂中，用于培养的培养基、向该培养基中添加的增 殖刺激因子是不必要的。因此，使用NK细胞强化型血液制剂时，优选从前述培养液中尽可 能地除去培养基、增殖刺激因子，预先调制好已强化的NK细胞等。作为培养基、增殖刺激因 子的除去方法的一个具体例子，首先，将包含已强化的NK细胞的培养液转移至已灭菌的离 心管中，在1200rpm、室温下离心8分钟左右，除去包含增殖刺激因子的上清的培养基。NK 细胞能够作为沉淀物回收。回收的NK细胞优选用PBS (-)洗涤2次以上。使用血细胞计数 板计算洗涤后的NK细胞的细胞数，用IOmL~200mL的乳酸林格氏液或生理盐水进行调整。 以这种方式能够调制本实施方式的NK细胞强化型血液制剂。也可以根据需要向该血液制 剂添加细胞因子等。
[0134] 为了使用本实施方式的血液制剂得到充分的效果，期望含有的NK细胞数的70% 以上处于活化状态。NK细胞的活化可以通过使用K562白血病细胞株后的细胞毒活性或活 化标志物的表达来进行判断。活化标志物可以利用⑶69等公知的标志物。此外，为了检出 这些标志物，可以使用针对各个标志物的抗体。
[0135] 本实施方式的NK细胞强化型血液制剂可以在制造后立即使用，也可以在0°C~ 8°C的温度下保存规定的时间、或添加保存液等在超低温下（约-80°C)或液氮中保存达数 年的长时间。作为前述保存液，如果使用市售的淋巴细胞保存液则是便利的。例如，可以 利用力-（日本^工氺7夕只社）、亇一工厶只>力一11(3只乇只< 才社） 等。
[0136] 2-3.效果
[0137] 根据本方式的NK细胞强化型血液制剂，20mL~60mL的外周全血包含IOX IO9个~ 100X IO9个NK细胞，所以，通过该血液制剂的给予能够迅速增大受试体的NK细胞数。因此， 通过给予NK细胞强化型血液制剂，能够增强具有肿瘤等疾病的受试体的自然免疫系统、抑 制的进行、治愈该疾病。
[0138] 根据本方式的NK细胞强化型血液制剂，能够冻结保存包含大量已强化NK细胞的 血液制剂，因此，能够在必要时给予受试体必要量。
[0139] 3. NK细胞强化用组合物
[0140] 3-1.概要
[0141] 本发明的第三方式是NK细胞强化用组合物。通过将本方式的NK细胞强化用组合 物添加到包含血液、优选PBMCs的培养基中，能够简便且有效地使培养基中的NK细胞强化。
[0142] 3-2.构成
[0143] 所谓"NK细胞强化用组合物"，是指通过添加到培养基中，能够使该培养基中存在 的NK细胞强化的组合物。
[0144] 本方式的NK细胞强化用组合物包含前述第一方式中已说明的抗⑶16抗体、抗 CD137抗体、0K432和细胞因子，或根据需要进一步包含抗CD3抗体、前述式1表示的双膦酸 衍生物等。抗⑶16抗体优选3G8那样的抗人⑶16单克隆抗体。抗⑶137抗体优选4-1BB 那样的抗人⑶137单克隆抗体。此外，细胞因子优选为选自IL-2、IL-12、IL-15、TNF-a、 IL-I P和IL-18中的化合物，更优选IL-2。另外，抗⑶3抗体优选莫罗单抗⑶3那样的抗 人CD3单克隆抗体。此外，双膦酸衍生物优选为选自唑来膦酸、帕米膦酸、阿仑膦酸、利塞膦 酸、伊班膦酸、英卡膦酸和依替膦酸中的化合物，更优选唑来膦酸。除此之外，还可以包含 RPMI-1640那样的淋巴细胞用培养基的成分、pH稳定剂、抗生素等。
[0145] 将组合物中各构成成分添加到规定量的培养基时，以各自为规定的终浓度的方 式混合即可。具体地说，使抗⑶16抗体以终浓度计为0. 01 y g/mL~100 y g/mL，优选为 0? I y g/mL ~10 y g/mL，更优选为 I y g/mL，0K432 以终浓度计为 0? 005KE/mL ~0? 05KE/ mL，优选为0. 008KE/mL~0. 015KE/mL，更优选为0. 01KE/mL，抗CD137抗体以终浓度计为 0? I y g/mL ~10 y g/mL，优选为 0? 3 y g/mL ~6 y g/mL，更优选为 I y g/mL ~3 y g/mL，且 细胞因子（优选为IL-2)为200U/mL~2000U/mL，优选为700U/mL~1500U/mL，更优选为 lOOOU/mL进行混合即可。此外，包含抗⑶3抗体和/或双膦酸衍生物等的情况下，使抗⑶3 抗体（优选为莫罗单抗⑶3)以终浓度计为0? Olng/mL~1000ng/mL，优选为0? Ing/mL~ 10ng/mL，更优选为Ing/mL进行混合即可；另外包含双膦酸衍生物等（优选为唑来膦酸） 的情况下，使其以终浓度计为I y M/mL~10 y M/mL，优选为3 y M/mL~7 y M/mL，更优选为 5 y M/mL进行混合即可。
[0146] 对组合物的剂型没有特别限定。可以为溶解于适当的缓冲液中的液体状态、粉末 状态、将粉末添加适当的赋形剂等并进行片剂化后的状态。或者也可以为不同状态的混合 物。例如，也可以为抗⑶16抗体固相化于塑料珠等支持体、且0K432、抗⑶137抗体和细胞 因子、以及根据需要的抗CD3抗体和/或前述式1表示的双膦酸衍生物等混合于包含它们 的溶液中那样的剂型。
[0147] 3-3.效果
[0148] 根据本方式的NK细胞强化用组合物，只要添加到含有NK细胞的规定量的适当的 细胞培养液中进行培养，就能够使NK细胞强化。
[0149] 4. NK细胞强化型血液制造用试剂盒
[0150] 4-1 ?概要
[0151] 本发明的第四方式是NK细胞强化型血液制造用试剂盒。本方式通过在培养血液、 优选为PBMCs时使用，能够简便且容易地制造NK细胞强化型血液制剂。
[0152] 4-2?构成
[0153] 本方式的NK细胞强化血液制造用试剂盒包含前述第一方式中已说明的抗⑶16抗 体、抗CD137抗体、0K432和细胞因子、以及根据需要的抗CD3抗体、前述式1表示的双膦酸 衍生物和/或除0K432以外的BRM等而形成。除此之外，可以包含用于溶解各NK细胞增殖 刺激因子的灭菌水和/或缓冲液、使用说明书等。
[0154] 本试剂盒中包含的抗⑶16抗体和抗⑶137抗体、以及根据需要增加的抗⑶3抗 体，只要是能够分别特异性识别并结合CD16抗原、CD137抗原、CD3抗原的抗体即可，无论 单克隆抗体或多克隆抗体。优选为单克隆抗体。抗CD16抗体进一步优选固相化于适当的 支持体。此外，作为抗CD137抗体的具体例子，可举出4-1BB。此外，细胞因子优选为选自 IL-2、IL-12、IL-15、TNF-a、IL-IP 和 IL-18 中的化合物，更优选为 IL-2。
[0155] 此外，作为本试剂盒中包含的抗CD3抗体的具体例子，可举出莫罗单抗CD3(商品 名：才;!/ y夕口一 > 0KT3 (注册商标）、亇>七>7 7- Y社）。此外，双膦酸衍生物优选 为选自唑来膦酸、帕米膦酸、阿仑膦酸、利塞膦酸、伊班膦酸、英卡膦酸和依替膦酸中的化合 物，更优选唑来膦酸。
[0156] 各种NK细胞增殖刺激因子可以单独地或以二种以上组合的状态包含于试剂盒 内。例如，除抗CD16抗体以外的NK细胞增殖刺激因子可以分别单独地包装被包含，也可以 以将一部分或全部的因子归在一起的状态包含于试剂盒内。此外，对各NK细胞增殖刺激因 子的状态不特别限定。也可以一种NK细胞增殖刺激因子为液体状态，其他的NK细胞增殖 刺激因子为固体状态。特别是抗CD16抗体优选以固相化于塑料珠等适当的支持体的状态 而被包含。
[0157] 5.治疗疾病的细胞免疫疗法
[0158] 5-1 ?概要
[0159] 本发明的第五方式涉及将第一方式中制造的NK细胞强化型血液制剂给予生物 体，从而提高免疫力、治疗疾病