的任一天，未发现总细胞数中NK细胞的％ (BI ; ⑶3⑶56+)在样品a和b之间有大的差别。
[0206] 然而，如图2所示，从培养开始后大概第13天起，样品a和b之间的总细胞数出现 差别。如表1所示，与其结果相对应，第14天的样品b的NK细胞的绝对数达到样品a的约 4倍。本方式中使用的NK细胞强化型血液制剂，在与用于培养的血液量以相同的液量进行 比较的情况下，由（培养结束时总细胞数X其中NK细胞的比例V(培养开始时PBMCsX 其中NK细胞的比例），判明了 NK细胞数为每单位体积的各血细胞数的平均值的10000倍以 上。因此，明确了根据本发明的制造方法，能够不需要高温刺激地有效地增殖NK细胞。
[0207][实施例3]
[0208]〈活化NK细胞的测定〉
[0209] 作为对NK细胞靶即K562细胞株的细胞毒活性，测定本发明的NK细胞强化型血液 制剂中的NK细胞的活化。
[0210] (方法）
[0211] 首先，将作为白血病细胞系株化细胞的K562细胞用荧光色素Calcein-AM进 行标记。标记通过向RPMI-1640培养基（含有10%胎牛血清）中添加百分之一体积的 Calcein-AM溶液（同仁化学研究所），在37°C下孵育30分钟来进行。标记后，用PBS (-)洗 涤该细胞，将其作为靶562细胞使用。接着，分别使用来自用前述实施例2的方法制造的样 品a和b的NK细胞强化型血液制剂中的NK细胞分别作为效应细胞（E)，调整使其与靶K562 细胞（靶细胞：T)的比（E/T比）成为规定值后，将其分别放入96孔板，在37°C、CO 2浓度 为5%的条件下反应2小时。反应后，使用Terascan VP( S氺;y夕社）根据其荧光 强度检测出保持荧光、即生存的靶细胞的量。K562的细胞毒活性值根据与毒害前的对照、即 不加效应细胞的状态的荧光强度的比较而算出。
[0212] (结果）
[0213] 来自用前述实施例2的方法制造的样品a和b的NK细胞的细胞毒活性示于前述 表1，以及来自第14天和第21天的样品a和b的NK细胞的细胞毒活性示于图3。使用的 E/T比分别示于各个表或图中。
[0214] 从表1和图3明确了，用本发明的NK细胞强化型血液制剂的制造方法和日本特许 第4275680号中的NK细胞强化型血液制剂的制造方法分别得到的NK细胞的细胞毒活性几 乎没有变化。即使将其进一步培养到第21天，细胞毒活性也并未下降。因此，明确了本发 明的NK细胞强化型血液制剂的制造方法能够维持用日本特许第4275680号的制造方法得 到的NK细胞的细胞毒活性，并能够得到更多的活化NK细胞。
[0215] [实施例4]
[0216] 〈来自癌患者的NK细胞强化型血液制剂的制造方法、NK细胞的增殖率和NK细胞 的活性测定〉
[0217] 前述实施例1中，NK细胞强化型血液制剂的制造中使用的血液供体为健常人。本 实施例中，以本来为治疗对象者的癌患者作为血液供体，验证即使对于来自癌患者的血液， 用本发明的方法制造的NK细胞强化型血液制剂也能够有效地增殖NK细胞。
[0218] (I)NK细胞强化型血液制剂的制造方法
[0219] 基本的方法依照实施例1记载的方法。但是，供体为取得了知情同意的表2中表 示的3名癌患者。
[0220] [表 2]
[0221]
[0222] (2) NK细胞的增殖率
[0223] NK细胞强化型血液制剂的基本的制造方法依照实施例1记载的方法。此外，为了 检验NK细胞的增殖率，依照实施例2记载的方法，调制在刺激工序中向NK细胞增殖刺激因 子中不添加抗人CD137抗体的阴性对照样品（样品A)和通过添加了抗人CD137抗体的本 发明的NK细胞增殖刺激因子处理后的样品（样品B)。培养工序中的培养天数是，来自患者 No. 1的样品为20天、来自患者No. 2的样品为21天、和来自患者No. 3的样品为14天。
[0224] 关于培养液中总细胞数的测定和NK细胞的绝对数的测定依照实施例2中记载的 方法。
[0225] ⑶NK细胞的活性测定
[0226] 基本的方法依照实施例3中记载的方法。反应后，使用多功能酶标仪 (Multi-labelreader) (A-_ >工;-社）检测上清中的游离荧光量。K562的细胞毒 活性值通过与不添加效应细胞状态的荧光强度相比较算出。
[0227] (结果）
[0228] 结果示于表3中。
[0229] [表 3]
[0230] 培养开始时（第0天）
[0231]
[0236] 如表3所示，在样品A和B之间未发现总细胞数中NK细胞的％有大的差另Ij。然而， 发现与样品A相比较，样品B的NK细胞的绝对数增加。从该结果可明确，即使在使用来自 癌患者的血液的情况下，根据本发明的制造方法，也能够更有效地增殖NK细胞。
[0237] 此外显示，用本发明的制造方法得到的NK细胞强化型血液制剂，即使在使用来自 癌患者的血液的情况下，也具有与用不含抗CD 137抗体的以往的制造方法得到的NK细胞强 化型血液制剂一样的细胞毒活性。
[0238] [实施例5]
[0239] 〈NK细胞强化型血液制剂的制造方法（2) >
[0240] 对于在实施例1中举出的本发明的NK细胞强化型血液制剂的制造方法中，通过与 实施例1不同的NK细胞增殖刺激因子进行刺激时的NK细胞的增殖效果进行检验。
[0241] (I)NK细胞强化型血液制剂的制造方法
[0242] 基本的方法依照实施例1中记载的方法。但是，血液供体为取得了知情同意的75 岁的女性胰癌患者（IV期），刺激工序如以下那样处理。
[0243](样品 a)
[0244] 通过实施例1中记载的NK细胞增殖刺激因子进行刺激工序。
[0245](样品 0)
[0246] 将0? 2mg的抗⑶16抗体（Clone3GB、Beckman Coulter)溶解于ImL的无菌蒸馏 7义，用0. 22 y m过滤器进行过滤灭菌。添加无菌蒸馏水199mL并混合使终浓度为I y g/mL。 过滤后，将抗⑶16抗体溶液5mL放入25cm2培养瓶中，在37°C下静置一夜使抗⑶16抗体溶 液固相化于瓶内面。然后，抛弃前述溶液，用无菌PBS (-)洗涤2次。
[0247] 将用与实施例1同样的方法调制的PBMCs的混悬液4. 7mL转移至前述瓶内。接 着，向前述PBMCs的混悬液中添加4. 7 y L的抗⑶3抗体1000倍稀释溶液（才；I/ y夕口 一 y 0KT3、亇 y 七 y 7 7 - Y 社）、24 y L 的抗人 CD137 抗体 0? 2 y g/ y L 溶液（4-1BB、 BioLegend)、终浓度 4yL/mL 的 0K432(匕二一;1/ :中外制药）水溶液 19yL、0.5yM/ mL的双膦酸衍生物（唑来膦酸；商品名、/ 7夕（注册商标）、7八;1/亍4只7 7 - V社）和 900U/ y L 的 IL-2 (Proleukin:Chiron 社）溶液 3. 7 y L，充分进行搅拌。
[0248] 培养工序中的培养天数为15天。
[0249] ⑵NK细胞的增殖率和NK细胞的活性测定
[0250] 培养液中总细胞数的测定和NK细胞绝对数的测定在培养后第3天、第5天、第6 天、第8天、第10天、第12天和第15天进行，依照实施例2中记载的方法进行测定。另外， 关于NK细胞的活性测定依照实施例4中记载的方法。
[0251] (3) y S T细胞数或a 0 T细胞的增殖率
[0252] YS T细胞和a 0 T细胞绝对数的测定使用与实施例2中NK细胞同样的流式细胞 仪分析法。使用荧光物质标记的单克隆抗体（FITC标记-抗V Y 9抗体、E⑶标记-抗⑶3 抗体；Immunotech社）的组合对血液制剂中的y 5 T细胞和a 0T细胞进行免疫染色。免 疫染色通过向细胞悬浮液中添加各抗体的附带说明书中推荐的抗体量，室温下遮光染色15 分钟，然后离心、冲洗包含荧光抗体的上清来进行。接着，T S T细胞和a 0T细胞的动态 通过流式细胞仪Cytomic FC500 (Beckman社），用上述的抗体的组合进行测定。测定数据通 过CXP分析进行分析。一般地，⑶3+V y 9+区域分布着y S T细胞、⑶3 V y 9区域分布着除 T细胞以外的细胞（包含NK细胞）、⑶3+V y 9区域分布着a 0 T细胞。
[0253](结果）
[0254] 结果示于图4和表4中。
[0255] [表 4]
[0256] 培养开始时（第0天）
[0257]
[0258] 培养结束时（第15天）
[0262] 如图4所示，到培养第6天为止，样品a和P之间几乎未发现总细胞数有差别。 然而，通过进一步的培养，用添加了抗CD3抗体和双膦酸衍生物的NK细胞增殖刺激因子刺 激处理后的样品P比样品a更有效地增殖，在培养结束时的第15天，如图4和表4所示 那样，样品0的总细胞数达到样品a的约2倍。此外，NK细胞的绝对数也变为约2倍。另 一方面，样品P的NK细胞与样品a具有同等的细胞毒活性。
[0263] 此外，关于样品a和0之间的YS T细胞和a 0T细胞的增殖率，发现样品0 的Y ST细胞增殖率上升为样品a的约6倍、样品P的a 胞增殖率上升为样品a 的约1. 5倍。
[0264] 以上的结果表明，通过向包含抗⑶16抗体、0K432、抗⑶137抗体和细胞因子的NK 细胞增殖刺激因子中进一步添加抗CD3抗体和双膦酸衍生物等，能够更有效地增殖NK细 胞、以及y S T细胞和a 0T细胞。
[0265] 本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请直接作为参考而纳入本说明书 中。
【主权项】
1. 一种NK细胞强化型血液制剂的制造方法，包括下述工序： 刺激工序，通过包含抗⑶16抗体、0K432、抗⑶137抗体和细胞因子的NK细胞增殖刺激 因子来刺激从生物体采取的血液中所含的NK细胞，和 培养工序，在刺激工序之后，在生理细胞温度下培养该血液。2. 根据权利要求1所述的制造方法，细胞因子是IL-2。3. 根据权利要求1或2所述的制造方法，NK细胞增殖刺激因子进一步包含抗CD3抗 体、和/或双膦酸衍生物或其盐或它们的水合物。4. 根据权利要求1~3中任一项所述的制造方法，生理细胞温度为36. 5~37. 5°C。5. 根据权利要求1~4中任一项所述的制造方法，培养工序中的培养期为7天~30 天。6. 根据权利要求1~5中任一项所述的制造方法，抗CD16抗体被固相化于支持体。7. -种NK细胞强化型血液制剂，通过权利要求1~6中任一项所述的制造方法得到。8. -种NK细胞强化用组合物，包含抗⑶16抗体、OK432、抗⑶137抗体和细胞因子。9. 根据权利要求8所述的组合物，细胞因子是IL-2。10. 根据权利要求8或9所述的组合物，进一步包含抗CD3抗体、和/或双膦酸衍生物 或其盐或它们的水合物。11. 一种NK细胞强化型血液制造用试剂盒，包含权利要求8~10中任一项所述的NK 细胞强化用组合物。
【专利摘要】提供能够侵袭性低、简便且迅速地使从生物体采取的血液中的NK细胞等增殖的NK细胞强化型血液制剂的生产方法。通过用包含抗CD16抗体、OK432、抗CD137抗体、和细胞因子的NK细胞增殖刺激因子刺激血液中的NK细胞，然后在生理细胞温度下培养该血液来生产NK细胞强化型血液制剂。
【IPC分类】A61K35/14, C12N5/0783, A61P35/00
【公开号】CN105101978
【申请号】CN201380075111
【发明人】照沼裕, 邓学文, 贽田美江
【申请人】株式会社日本生物治疗研究所
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2013年3月27日
【公告号】WO2014155572A1