的细胞免疫疗法。
[0160] 5-2.构成
[0161] 本方式是将第一方式的制造方法中得到的NK细胞强化型血液制剂给予生物体的 细胞免疫疗法。
[0162] 本方式中所说的"细胞免疫疗法"，是指通过将由前述第一方式的制造方法得到的 NK细胞强化型血液制剂给予生物体，提高该生物体的免疫力，从而治疗疾病的方法。本方式 的细胞免疫疗法特别优选为以过继免疫疗法为前提的疗法。这是因为，如前所述，过继免疫 疗法几乎没有排斥反应的危险性。
[0163] 前述给予的NK细胞强化型血液制剂是比每单位体积的通常血液平均值更多地包 含对癌、病毒感染症、细菌感染症或寄生虫感染症具有免疫力的淋巴细胞的血液制剂。这里 所说的"癌"是指全部恶性肿瘤。例如，上皮性肿瘤和/或肉瘤、白血病、骨髓瘤等。具体地 说，可举出例如，脑肿瘤、视网膜母细胞瘤、基底细胞癌、恶性黑色素瘤、舌癌、食道癌、胃癌、 大肠癌、肺癌、白血病、淋巴瘤、乳癌、子宫颈癌、子宫体癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸肿瘤、膀 胱癌、肾癌、肝癌、胰癌和纤维肉瘤等。此外，这里所说的"病毒感染症"是指全部由病毒感 染引起的疾病，特别是难以治愈的慢性病毒感染症、急性病毒感染症的预防。作为该难治的 慢性病毒感染症，可举出例如，引起AIDS的HIV感染症、病毒性慢性肝炎、引起子宫颈癌的 人乳头瘤病毒感染症。此外，作为急性病毒感染症可举出流感等病毒性呼吸器官感染症、免 疫功能低下状态下的急性病毒感染症。所谓"细菌感染症"，是由真细菌（包含革兰氏阳性 菌和革兰氏阴性菌）或真菌（包含丝状菌、酵母等和担子菌）引起的感染症。可举出例如， 念珠菌感染症、芽生菌病、组织胞浆菌病等。此外，这里所说的"寄生虫感染症"是指全部由 原生动物或蠕虫引起的疾病。可举出例如，疟疾、利什曼病、丝虫病、包虫病、日本血吸虫病 等。
[0164] 所谓"具有免疫力的淋巴细胞"，意思是免疫系统中功能被强化的淋巴细胞。例如， 处于细胞毒活性被激活状态的NK细胞、杀伤性T细胞、y ST细胞、NKT细胞。此外，这里所 说的"每单位体积的通常血液平均值"，意思是健常个体的血液中一般观察到的对癌、病毒 感染症、或真菌感染症具有免疫力的血中细胞数的每单位体积的平均值。例如，对于NK细 胞，健常成人的每ImL血液平均存在约5 X IO5个左右的NK细胞。
[0165] 5-3.方法
[0166] 关于本方式的细胞免疫疗法中NK细胞强化型血液制剂的给予方法，以下以进行 过继免疫疗法的情况为例进行说明。该给予方法除了给予第一方式的NK细胞强化型血液 制剂这点以外，同以往的过继免疫疗法中已知的方法基本相同。因此，关于给予方法，依照 公知的过继免疫疗法中的给予方法进行即可。可举出例如，将由从患者采取的血液通过第 一方式中的NK细胞强化型血液制剂的制造方法而制造的该血液制剂，在约2周后使用静脉 注射或点滴等给予到该患者体内的方法等。
[0167] 本方式中的NK细胞强化型血液制剂的每次的给予量，在人的情况下为包含细胞 数20 X IO7~5 X 10 9个的范围的NK细胞的容量即可。但是，这是对一般成人的给予量。实 际给予时，优选考虑给予该血液制剂的人的年龄、性别、体重、疾病的状态、体力等进行适当 调节。
[0168] 作为本方式中的细胞免疫疗法的一个例子，可举出将前述给予方法作为1个周 期，以约2周的间隔持续给予1个疗程（6个周期）以上的方法。在不是过继免疫疗法的情 况下，除了给予从非自身的生物体取得的NK细胞强化型血液制剂这点以外，用同样的方法 进行该细胞免疫疗法即可。
[0169] 5-4?效果
[0170] 根据本方式的细胞免疫疗法，与以往大量免疫疗法、特别是过继免疫疗法相比较， 在针对癌等疾病的治愈中具有高的有效性。此外，因为它与以往的过继免疫疗法基本操作 技术等相同，所以如果是具有过继免疫疗法的技术的人，则不需要特殊的技术学习就可以 实施。
[0171]〈实施例〉
[0172]用以下的实施例具体地说明本发明。另外，以下的实施例只是例示本发明，本发明 不受这些实施例任何限定。此外，关于本实施例中使用的温度、量、时间等的数值，要考虑实 验上的一些误差和偏差。
[0173] [实施例1]
[0174] 〈NK细胞强化型血液制剂的制造方法（1) >
[0175] 关于本发明的第一的方式，举出关于过继免疫疗法中使用的该血液制剂的制造方 法的具体例子进行说明。另外，本说明书的实施例1~3中，以健常人取代癌患者等本来的 治疗对象者作为供体。
[0176] (1)自体血浆的调制
[0177] 首先，调制细胞培养用自体血浆。向采血管中添加肝素50U/mL，从供体的静脉采取 40mL的外周全血。将采取的外周全血转移至无菌锥形离心管，以3000rpm离心10分钟后， 将上清作为血浆进行分离。向采取血浆后残余的血细胞成分中添加相对于血浆分离前的全 血量为3倍量的无菌PBS (-)或培养用培养基，制成"血细胞成分溶液"，用于以下的PBMCs 的调制。将血浆在56°C下处理30分钟进行灭活，进一步在3000rpm下离心10分钟，除去血 小板等。其后，将血浆保存于4°C。将该血浆作为添加到培养基的细胞培养用自体血浆，在 每次调制培养基时使用必要量。
[0178] (2) PBMCs 的调制
[0179] 在血细胞成分溶液上重叠比重液，使用密度梯度离心法除去红细胞、粒细胞，分离 PBMCs。比重液使用Ficoll-Paqu PLUS(Amersham社），步骤依照附带的说明书。向回收的 PBMCs中添加30mL的不含血清的PBS(-)或培养细胞用的培养基，洗涤2~3次。培养细 胞用培养基中使用例如不含血清的RPMI1640培养基。洗涤后，从得到的PBMCs混浊液取 出一部分样品，爹少夕（Turk's Solution)染色后，用血细胞计数板计算其数目。从40mL 的外周全血，回收了细胞数为3. 4X IO7个的PBMCs。向添加了 5% (V/V)的上述自体血浆 的OpTmizer (life techelonogy社）培养基中添加回收后的PBMCs并混悬使得细胞密度为 lXlOY/mLo
[0180] (3)刺激工序
[0181] 将0? 2mg的抗人⑶16抗体（Clone3G8、Beckman Coulter)溶解于ImL的无菌蒸馏 水中。因为该抗⑶16抗体并非无菌制品，所以溶解后用0.22 ym过滤器进行过滤灭菌。添 加无菌蒸馏水199mL并进行混合使得终浓度为I y g/mL。过滤后，将抗⑶16抗体溶液5mL 装入25cm2培养瓶中，在37°C下静置一夜使抗CD 16抗体溶液固相化于瓶内面。其后，抛弃 前述溶液，用无菌PBS (-)洗涤2次。
[0182] 将前述调制的PBMCs的悬浊液5mL转移至前述瓶内。接着，将25 y L的抗人⑶137 抗体 〇? 2 y g/ y L 溶液（4-1BB、BioLegend)、4 y L/mL 的 0K432 (匕。シ只二一少：中外制药） 水溶液20 y L、和900U/ y L的IL-2 (Proleukin :Chiron社）溶液4 y L添加到前述PBMCs的 混悬液中，充分地进行搅拌。
[0183] 为了用前述各NK细胞增殖刺激因子充分地刺激PBMCs，将培养瓶转移至预先将内 部设定为37°C的5% 0)2培养箱中，保持3天。
[0184] (4)培养工序
[0185] 然后，为了从培养液中除去NK细胞增殖刺激因子，将5mL的培养液回收至锥形离 心管中，以1200rpm离心8分钟。离心后，除去上清的培养基，将细胞颗粒混悬于含有700U/ y L的IL-2、并含有5% (V/V)的自体血浆的4mL的OpTmizer培养基中并回收，转移至未固 相化抗⑶16抗体的新瓶后，用设定于37°C的5% 0)2培养箱再次培养21天。每2~4天 更换含有5% (V/V)的自体血浆的OpTmizer培养基。通过以上步骤，制作本发明的第二方 式的NK细胞强化型血液制剂。
[0186] 实际上作为NK细胞强化型血液制剂使用的情况下，有必要进行污染试验、前处 理。以下对于这些进行简单说明。
[0187] (5)(污染试验）
[0188] 关于培养液中有无内毒素的验证，使用Limulus ES-II (Wako社），依照附带的说 明书进行确认。此外，关于细菌、霉菌的有无可通过在琼脂培养基上涂布一部分的培养液， 通过菌落形成测定法来确认。
[0189] (6) NK细胞强化型血液制剂前处理
[0190] 将培养3周后的培养液转移至离心管，以1200rpm进行离心10分钟后，抛弃上清。 添加50mL PBS(-)来混悬沉淀，再次以1200rpm离心10分钟后，抛弃上清。将此操作重复进 行3次，除去培养基成分。最后混悬于乳酸林格氏液70mL中。通过以上的操作，得到作为最 终产物的NK细胞强化型血液制剂。该血液制剂中，NK细胞增殖率在14天后变为约16000 倍，21天后变为约44000倍。这与以往只使用抗⑶16抗体、IL-2和0K432的NK细胞强化 型血液制剂的制造方法得到的NK细胞增殖率相比较，14天后、21天后均增强4倍。
[0191][实施例2]
[0192] 〈NK细胞的增殖率〉
[0193] 为了确认本发明的NK细胞强化型血液制剂的制造方法不需要高温刺激，对NK细 胞的增殖率进行了检验。
[0194](方法）
[0195] 本实施例中，为了比较使用包含抗⑶16抗体、抗⑶137抗体、0K432和IL-2的NK 细胞增殖刺激因子的本发明的NK细胞强化型血液制剂的制造方法、与除了 NK细胞增殖刺 激因子中不使用抗CD137抗体以外，其余全部与本发明的NK细胞强化型血液制剂的制造方 法相同的方法分别得到的结果，对以下2个样品检验了从已取得知情同意的健常人供体得 到的血液中的NK细胞的增殖率等。
[0196] 样品a :作为NK细胞增殖刺激因子，使用了终浓度为I y g/mL的抗⑶16抗体、 0.0 lKE/mL的0K432和700U/mL的IL-2。该样品的NK细胞增殖刺激因子相当于日本特许 第4275680号所用的增殖刺激因子。
[0197] 样品b :作为NK细胞增殖刺激因子，使用了终浓度为I y g/mL的抗⑶16抗体、 0? 01KE/mL 的 0K432、终浓度 I y g/mL 的抗 CD137 抗体溶液（4-lBB、BioLegend)和 700U/mL 的IL-2。该样品的NK细胞增殖刺激因子相当于本发明的NK细胞增殖刺激因子。
[0198] 此外，样品a和b与日本特许第4275680号中使用的制造方法不同，不经过39 °C的 高温刺激工序。
[0199] NK细胞强化型血液制剂的制造方法除了上述各样品的组成和工序的不同点之外， 基本的操作与前述实施例1相同。将PBMCs混悬于OpTmizer培养基使得细胞密度为I X IO6 个/mL的日期作为第0天，通过各刺激因子给予刺激，将添加10 %自体血浆至培养基并开始 刺激和培养的日期作为第〇天。在培养第3、5、7、10、12、14、17和21天回收一部分培养液， 分别测定培养液中的总细胞数。
[0200] 培养液中的NK细胞的测定在第0天、第14天、和第21天使用流式细胞仪分析法 进行。具体地说，使用用焚光物质标记的单克隆抗体（PC5标记或E⑶标记-抗⑶3抗体、 PE标记或PC5标记-抗⑶56抗体；Immunotech社）的组合对血液制剂中的NK细胞进行 免疫染色。免疫染色通过向细胞悬浮液中添加各抗体的附带说明书中推荐的抗体量，室温 下遮光染色15分钟，然后离心，冲洗包含荧光抗体的上清来进行。接着，通过流式细胞仪 Cytomic FC500 (Beckman社）以上述抗体的组合测定NK细胞的动态。测定数据通过CXP分 析进行分析。
[0201] (结果）
[0202] 结果示于图1和2以及表1中。
[0203][表1]
[0204]
[0205] 如图1所示，在第0、14和21天中