用于改善硫酸软骨素的生物利用度的含有硫酸软骨素、蛋白水解酶和巯基化合物的组合物的制作方法
【专利说明】用于改善硫酸软骨素的生物利用度的含有硫酸软骨素、蛋 白水解酶和巯基化合物的组合物
[0001] 发明概沐
[0002]本发明涉及组合物，其包含硫酸软骨素（CS)、具有蛋白水解活性的酶或酶混合物， 不存在或者存有巯基化合物，及其在治疗和预防骨关节炎和相关急性和慢性炎症过程中的 用途，或作为用于维持人类和动物肌肉骨骼的健康的营养组合物的用途。
[0003] 所述组合当口服施用时提高CS的肠道吸收。所述组合的效果适用于广范围分子 量的CS，包括由特征在于极低分子量（I-IOkDa)的寡糖组成的样品，已知其生物利用度高 于具有较高分子量样品的生物利用度。
【背景技术】
[0004] 在广泛临床证据的基础上，CS由EULAR(欧洲抗风湿病联盟（European League against Rheumatism))推荐作为骨关节炎的对症慢作用药物（SYSADOA)，用于治疗膝、髋和 手的骨关节炎。CS还用作用于实现局部和全身水平抗炎活性的组合物中的营养物（单独或 与其他成分组合）。
[0005] 硫酸软骨素（CS)是属于糖胺聚糖（glycosaminoglycans, GAGs)类的多糖，存在于 脊椎动物和无脊椎动物中，由二糖序列组成，所述二糖序列由葡糖醛酸（GlcA)残基及交替 的N-乙酰基-D-半乳糖胺（GalNAc)通过(6-1-3键连接并且在不同位置的硫酸化而形成。 所述二糖又由P 1-4键连接在一起。CS主要由在GalNAc的第4位和第6位单硫酸化的二 糖单元（分别称为二糖A和C)组成。取决于多糖来源，CS A和C以不同百分比存在。
[0006] 未被硫酸化的二糖和拥有两个与不同位置的氧原子连接的硫酸酯基团的二硫酸 化二糖还以更少的、可变的程度存在于CS中，这取决于具体的动物来源：在GlcA的2位及 GalNAc的6位（二糖D)、在GlcA的2位及GalNAc的4位、或在GalNAc的4和6位（二 糖￡)(￥〇1口11丄卩1^^11.?1^^11&。〇1.61，1271，2009.￥〇1口11丄？1^^11.5(^.96,3168,2007. Volpi N. Curr. Pharm. Des. 12, 639, 2006) 〇
[0007] 不同动物来源的CS特征还在于不同的分子量。
[0008] 例如，来源于陆地动物的CS具有彼此间类似的分子量值，但与来源于鱼类的那些 不同，来源于鱼类的那些具有更高的分子量值。陆地来源的CS具有14至26kDa的平均分 子量，而海洋来源（来自乌贼、软骨鱼和硬骨鱼）的CS具有超过50kDa的平均分子量。
[0009] 除了动物来源的CS外，还描述了这样的一些CS产品，其基于细菌来源的多糖骨 架，随后通过合成修饰，从而获得与天然CS类似的聚合物。这些细菌合成来源的生物技术 CS克服了与动物来源的提取CS相关的一些缺点，诸如残余杂质中可能存在病毒和/或朊病 毒或其他可能引起过敏的大分子；终产物中的高动物蛋白含量；动物产品与宗教或饮食限 制的不相容；以及对于满足增长的全球需求的可得到的有限来源。
[0010] 细菌合成来源的CS的实例例如描述于EP 1304338中，其中大肠杆菌05:K4:H4株 的荚膜多糖在原始聚合物提取和水解后被化学硫酸化。其他细菌合成CS的实例公开于WO 2012/152872、W0 2012/159655和WO 2013/174847中，其中化学硫酸化细菌荚膜多糖，得到 与动物来源类似的cs。
[0011]最后，通过对提取的多糖（Cho SY 等人? Biol. Pharm. Bull. 27, 47, 2004, Das A?等人? Osteoart. CartiI. 8, 343, 2000)及细菌来源的多糖（WO 2013/174847、TO 2012/152872)进行解聚，得到低分子量CS的一些实例。这些类型CS的小的分子尺寸导致 更好的口服吸收，同时维持了天然CS的许多已知活性。
[0012] 口服施用时，CS通过小肠和远端消化道的肠粘膜吸收。CS在小肠中部分地作为高 分子量多糖被吸收，而大部分在盲肠和结肠中作为寡糖的形式被吸收（Lauder R. ;Compl. Ther. Med. 17, 56-62, 2009)。这些寡糖通过消化系统的下消化道中的肠道菌群产生的水解 酶对原始多糖的部分解聚而产生。
[0013] 尽管对于与构成CS的多糖的肠道吸收相关的机制尚不完全清楚，但相信通过肠 上皮细胞旁路空间的吸收在量上是显著的，如同对于大多数大分子那样；CS的寡糖片段也 通过这一途径吸收。在这一水平存在紧密连接，其形成限制大分子吸收的屏障，所述大分子 的转运不涉及通过特定分子载体穿越肠道粘膜的介导。
[0014] 高分子量CS的吸收预计约为1-5%。如此前所述，吸收的大部分CS由寡糖组 成，所述寡糖来源于肠道微生物菌落产生的软骨素酶对其的酶消化作用。然而，考虑寡糖 的吸收，由肠粘膜摄取的总CS占摄入的多糖的不超过20-23%(1^11(1611?. ;(：〇11^1.1'1161\ Med. 17, 56-62, 2009-Barthe L?等人? Arzneimittelforsch. /Drug Res. 2004 ;54:286-92) 〇
[0015] 一般而言，口服施用后的CS吸收仍然是个问题，能够提高所述糖胺聚糖肠道吸收 的任何方法是受到高度关注的。
[0016] 菠萝蛋白酶（Bromelain)是提取自菠萝（Ananas comosus)水果和莖的半胱氨 酸蛋白酶混合物，菠萝是一种属于凤梨科（Bromeliaceae)的植物。其提取物的主要来 源是所述水果的茎，在这里它的浓度是最高的。可将这一混合物区分为四种不同级分 (fractions)，或根据通过质谱进行的更精细的分析表征，区分为8种蛋白水解组分，其均 具有相当的蛋白水解活性。因此通常使用其天然形式的混合物。菠萝蛋白酶分类为属于ClA 肽酶（MER0PS命名法）亚类的内切酶。除了蛋白酶混合物外，该提取物还含有过氧化物酶、 酸性磷酸酶和糖苷酶。所述成分的分子量为8至28. 5kDa。菠萝蛋白酶浓度通常以蛋白水 解单位（GDU单位或国际单位，IU)表示，而不是以重量单位表示。
[0017] 就其蛋白水解特征，菠萝蛋白酶具有与胰蛋白酶类似的活性，并且因此促进消化。 其与胰腺提取物组合用于消化不良。菠萝蛋白酶还分割长链脂肪。
[0018] 菠萝蛋白酶还拥有其他的药理学活性，最重要的是有效的抗炎活性，这使得其能 有效治疗软组织中与创伤或手术后反应以及局部炎症相关的炎症状态。还证实菠萝蛋白酶 通过升高抗炎前列腺素（诸如E2前列腺素）的生物合成以及相反地通过抑制促-炎症前 列腺素的生物合成而发挥这一活性。
[0019] 菠萝蛋白酶的其他药理活性包括抗血栓和促溶纤维蛋白（pro-fibrinolytic)作 用、低血压活性以及诱导动脉粥样硬化斑块消退的作用。其在抗菌和抗肿瘤治疗中的协同 能力也得以描述。
[0020] 菠萝蛋白酶的特征在于良好的口服生物利用度，估计约40%，这对于蛋白来说是 非常罕见的特性。此外，多数未吸收的菠萝蛋白酶保持完整，并且能够在肠道中发挥其酶活 性，因为其不会受到胃液或唾液中的胱蛋白的强烈攻击。鉴于其特性，其类似于木瓜蛋白酶 和无花果蛋白酶（分别来自木瓜（Carica papaya)和无花果（Ficus carica)的类似提取 物）。
[0021] 纳豆激酶是最初分离自纳豆（natto)的酶，纳豆是基于用特定种类的枯草芽胞杆 菌（Bacillus subtilis)即纳豆芽胞杆菌（B. subtilis natto)发酵的煮大豆（soybeans) 的日本传统食物。
[0022] 纳豆激酶是约32kDa的丝氨酸蛋白酶，其具有很强的纤维蛋白溶解活性。其与枯 草杆菌蛋白酶的同源性超过72 %。其纤维蛋白溶解活性包括对纤维蛋白溶解的直接作用， 以及诱导尿激酶和纤溶酶产量增加的能力。纳豆激酶的特征在于相对高的对温度和低PH 值的稳定性；这一特征赋予该蛋白对胃环境的良好耐受性，使得其可通过口服施用。
[0023] 其在胃环境中相对稳定的特征及其蛋白水解活性使得其成为可类似于菠萝蛋白 酶存在于本文阐明的应用中。
[0024] US 5679344公开了用于关节疾病的营养组合物，其含有葡糖胺和具有抗炎性质的 蛋白水解酶。该组合物含有至少一种蛋白酶和至少一种酸稳定的蛋白酶。
[0025] US 5888514公开了含有软骨、蛋白水解酶、硫酸葡糖胺和硫酸