软骨素以及维生素 和植物提取物的组合物，用于治疗骨和关节的炎症。
[0026] 发明详沐
[0027] 已发现CS与菠萝蛋白酶的组合，以及同时存在菠萝蛋白酶活性增强剂诸如半胱 氨酸、甲硫氨酸、谷胱甘肽或其他巯基化合物时，提高了其在小肠中的吸收。
[0028] 还发现纳豆激酶对于CS的生物利用度具有甚至更出人意料的效果，其提高了超 过 250%。
[0029] 本发明的一个目标是包含硫酸软骨素和一种或多种蛋白酶以及任选的巯基化合 物的组合物，条件是当所述蛋白酶不是纳豆激酶时，则存在所述巯基化合物。
[0030] "巯基化合物"在本文中是指包含至少一个巯基的天然或合成氨基酸、或小肽或其 它化合物。巯基化合物优选选自甲硫氨酸、半胱氨酸、高半胱氨酸、S-腺苷甲硫氨酸、乙酰 半胱氨酸、还原或氧化的谷胱甘肽和S-乙酰基-谷胱甘肽。
[0031] 在本发明的组合物中，硫酸软骨素/蛋白酶/巯基化合物比为 1. 0/0. 05-0. 8/0. 001-0. 05〇
[0032] 硫酸软骨素优选具有1至95kDa的分子量，更优选4至50kDa的分子量。
[0033] 硫酸软骨素优选为提取的动物来源的。CS可如下获得：对来自大肠杆菌的荚膜多 糖K4进行水解移除果糖残基后，进行化学硫酸化，如在EP 1304338、WO 2012/152872、TO 2012/159655中描述的那样；或对来自大肠杆菌的荚膜多糖K4进行水解移除果糖残基后， 进行化学硫酸化并随后进行酸或自由基解聚，如在WO 2013/174847和WO 2012/152872中 描述的那样。备选地，CS可通过化学硫酸化来自基因修饰的大肠杆菌株（例如DSM23644) 的荚膜多糖而获得，其中所述多糖最初即不存在果糖残基（W0 2012/159655)。如此获得的 CS的分子大小也可随后通过酸或自由基解聚而减小，如在WO 2013/174847中那样。
[0034] 蛋白酶优选选自菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶和纳豆激酶。纳豆激酶是 优选的。本发明优选实施方案因此提供了包含硫酸软骨素和纳豆激酶的组合物，其不存在 巯基化合物。本发明还涉及纳豆激酶在改善硫酸软骨素肠渗透性中的用途。
[0035] 本发明的组合物还可含有一种或多种用于预防或治疗急性和慢性炎症状态的活 性成分和/或一种或多种用于维持人和动物肌肉骨骼健康的营养物质。
[0036] 所述活性成分可以例如选自盐酸葡糖胺、硫酸葡糖胺、N-乙酰葡糖胺、透明质酸、 氨基酸、胶原、水解的胶原、多不饱和脂肪酸、角蛋白、甲基磺酰甲烷、叶酸（folate)、还原态 叶酸（folates)、维生素、B族维生素、S-腺苷甲硫氨酸（SAMe)、抗坏血酸和抗坏血酸锰。
[0037] 该组合物还可含有一种或多种药学上或营养学上可以接受的赋形剂。
[0038] 通常与硫酸软骨素联合的所有成分，诸如葡糖胺和甲基磺酰甲烷（MSM)，均可加入 到所述制备物中。
[0039] 药学上或营养学上可以接受的赋形剂例如是微晶纤维素、硬脂酸、硬脂酸镁、胶 体二氧化硅、乙基纤维素、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、含水虫胶盐（aqueous shellac salts)、藻酸钠、淀粉、改性淀粉、甲基丙烯酸共聚物、麦芽糊精和多元醇。
[0040] 本发明的组合物优选口服施用，例如以胶囊、软胶囊、片剂、颗粒剂、液体形式的饮 料或待重构的粉末饮料形式施用。营养领域中CS的日剂量可以为400mg至3600mg，并且作 为药物的通常日剂量为1200mg。
[0041] 附图简沐
[0042] 附图显示了 20kDa的牛硫酸软骨素（菱形）、9kDa的LMff硫酸软骨素（正方形） 以及40kDa的HMW硫酸软骨素（三角形）通过大鼠肠粘膜的渗透性。
[0043] 实验部分
[0044] 在体外模型中测试了 CS的渗透性，其中安乐死之后立即从动物中切离大鼠肠粘 膜，并且置于浸泡在合适缓冲液中的Ussing室中，位于两个隔室的界面处，使粘膜本来暴 露于肠腔的一面朝向一个隔室，称为供应隔室，并且底部朝向另一个隔室，称为接受隔室。
[0045] 存在或不存在所述组合的其他成分情况下，将CS置于供应隔室中，并且在一段温 育期后测定接受隔室中多糖的存在，在所述温育期间，CS通过由大鼠肠粘膜组成的膜渗透 至接受隔室中。
[0046] 现在将更详细地描述用于评估在其各种组合中的CS的肠渗透性的实验技术。通 过吸入CO 2安乐死重为150-170g的Lewis大鼠，并且立即切除小肠，洗涤，并安装在充满 介质的Ussing室中，所述介质由125mM氯化钠（NaCl)、1.3mM硫酸镁（MgSO 4)、5mM氯化钾 (KCl)、20mM葡萄糖和25mM碳酸钠（NaHCO3)组成。用HEPES调节溶液pH至7. 4。在37°C 的温度下，在由95% 02和5% CO 2组成的气氛中进行渗透性研究。在切离肠粘膜后不超过 15分钟进行渗透性测试。
[0047] 测试中使用的CS样品就其性质和分子大小而言不同。牛来源和生物技术（细菌 合成）来源的CS样品以不同的组合用于肠渗透性测试。使用的CS样本特征还在于不同的 分子量，范围为1至95kDa，或优选4至50kDa。
[0048] 硫酸软骨素以3% (质量/体积）的浓度添加至供应隔室中。对于菠萝蛋白酶存 在下的渗透性研究，以1. 5%的浓度添加菠萝蛋白酶至CS溶液中。备选地，选自甲硫氨酸、 半胱氨酸、高半胱氨酸、S-腺苷甲硫氨酸、乙酰半胱氨酸、S-乙酰基-谷胱甘肽和还原或氧 化的谷胱甘肽的巯基化合物以0. 075%的浓度与菠萝蛋白酶一起添加。对于纳豆激酶存在 下的渗透性研究，以1. 5%的浓度将酶添加至溶液中，如菠萝蛋白酶一样。
[0049] 总温育时间为3小时，期间每30分钟从接受隔室中取100 y 1样品，并用新鲜介质 补充移除的体积。应用以下描述的方法，在用软骨素酶ABC(比活性：0. 5U/ml)消化多糖后， 通过HPLC分析所取样品中构成CS的二糖的存在。
[0050] 所用的HPLC方法涉及使用强阴离子交换柱（SAX)，基于pH4的酸化水的洗脱液， 以及在最先仅用酸化水等度洗脱5分钟后，25分钟内从0 %至100 %的I. 2M NaCl线性梯 度。使用的流速为I. 〇ml/min，以及二糖的检测用UV检测仪在232nm处进行。
[0051] 应用标准硫酸软骨素的8-点校准曲线计算接受隔室中CS的量，所述校准曲线相 应于初始CS浓度C的0. 78 %至100%的范围。硫酸软骨素的标准品用软骨素酶ABC预温 育，稀释于与实验所用相同的介质中。基于在接受隔室中发现的CS，表观渗透系数（P app)通 过公式Papp(cm/sec) = Q/A *C 计算，其中Q是渗透的CS的总量（y g)，A是Ussing室的 扩散面积（cm2)，C是供应隔室中CS的初始浓缩（y g/cm3)，并且t是温育时间（30-180min)。 增长比R基于Papp计算为（P app CS+蛋白酶V(Papp CS单独）。在取得每一样品时，即在30、 60、90、120、150和180min时，计算Papp。然后计算在这些点获得的不同P app值的平局值，以得 到每一样品在整个实验中的平均渗透系数。CS渗透数据表达为分别测量的二糖A di-OS、 A di-6S和A di-4S的浓度峰值的平均值。
[0052] 数据的统计值由Student' s "t"检验来分析，其中p〈0. 05为最小显著性。
[0053] 这一实验模型的有效性得到了这样一个事实的确认，即三种不同分子量（即9、20 和40kDa)的CS样品表现出针对肠膜的渗透性，其为分子量的函数，如体内发生的那样。这 得到了下述曲线的证实，所述曲线显示了在180分钟实验期间内所考虑的所有时间间隔的 CS累积转运（附图）。
[0054] 然后将具有低（9kDa)或高（40kDa)分子量的非动物来源的CS样品在下述情况下 用于渗透性测试：存在或不存在蛋白酶，以及在菠萝蛋白酶的情况下，添加或不添加增强剂 化合物。
[0055] 在不存在其他佐剂或在存在菠萝蛋白酶、菠萝蛋白酶和甲硫氨酸、或纳豆激酶的 情况下得到CS样品的随时间的渗透性结果。
[0056] 尽管菠萝蛋白酶促进许多大分子细胞旁渗透的能力是已知的，这一能力与其弱化 紧密连接的能力是相关的（Grabovac等人，Int. J. Pharm. 326, 153-159, 2006)，但在这一测 试中，单独使用菠萝蛋白酶而没有其他因子的介入，没有提高低分子量CS的吸收。这可从 表1中所示平均P app值之间的比较