新型的稳定十五肽盐，其制备方法，其在制备药物制剂中的用途以及其治疗用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于药物化学领域并涉及新型的稳定十五肽的盐，其在下文也称为式（I) 的 bepecin 盐：
[0003]其中n是1、2或3，并且BAA是碱性氨基酸，
[0004] 涉及其制备方法，其在制备药物制剂中的用途以及其治疗用途。
[0005] 技术问题
[0006] 许多药理学研究已证实了具有氨基酸序列Gly Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Ala Asp Asp Ala Gly Leu Val (SEQ ID NO I)的十五肽（缩写为 BPC-157 或 b印ecin)对人和 动物有机体的保护、再生和治疗活性。到现在为止，这种肽一直以游离形式或以醋酸盐形式 或作为与碱的盐例如钠盐使用。所有这些形式的特点均为在胃液中仍没有足够的稳定性， 这特别地限制了这些化合物的口服使用并同时降低了它们的治疗价值。因此，有必要以在 胃液中和在升高的环境温度下均实质性地更加稳定的形式制备此十五肽。该制剂的这种形 式可更成功地用于特别是至生物体中的口服递送。由于更高的稳定性，还可预期总体更好 的效力。 现有技术
[0007] 十五肽BPC 157或bepecin (身体保护化合物的缩写）具有以下肽序列：Gly Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Ala Asp Asp Ala Gly Leu Val ;并且其代表实际存在于哺乳动 物的胃液中的天然BPC蛋白质的N-末端部分。天然BPC蛋白借助复杂的生化方法（美国专 利号5, 288, 708)从人或动物的胃液中获得。且不论高要求的操作，这种方式的获得在原材 料来源的不确定性和可能污染病毒方面也是不合适的。因此，通过化学合成（P.Sikirii, R.Rucman,:B.Rucnian,M. Petek, Peptides 1998, Proceed, of 25th EPS, Budapest 1998, p. 814 ；Z. PfIaum and R.RllCllian,Acta Chim. Slov. , 2005, 52, 34 - 39)，仅制备了 具有上述序列的N-末端部分。令人惊讶的是，已发现该片段保留了天然BPC蛋白的几乎所 有效应（EP 0572688和美国专利号6, 268, 346)。具有15个氨基酸的序列的N-末端部分似 乎是整个蛋白质具有生物活性的最主要原因。从医学角度来看该化合物非常吸引人，因为 其在极低浓度（每公斤体重从ng到mg及更多的范围）下对几乎所有的器官具有效应并且 没有任何毒性或副作用。
[0008] 药理学研究已显不被引入生物体中的十五肽bepecin(SEQ ID NO 1)具有以下效 应：
[0009] -对胃肠道任何部分的溃疡的效应（P. SikirM等人，Life Sci.，1994 ; M，PL63 - 68) ; (P.Sildrid等人，Exp. Clin. Gastroenterol.，1991，1，17 - 20);
[0010]-不论病因的抗炎症效应（P.Sikirid等人，J. Physiol. / Paris/, 1997, 9i, 113 - 122)；
[0011] -针对胃肠道的炎性疾病-克罗恩氏病的效应（Sikirif等人，j. PhysioI? / Paris/, 2001, 95, 295 - 301)；
[0012] -对肝脏和胰脏的保护效应（Prka^iii等人，J. Physiol. / Paris/, 2001, 95, 315 - 324)；
[0013] -促进烧伤的愈合（D. Miku§, P.Sikirid等人，Burns 2003,盌，323 - 334 ; Burns, 2001. 127. 817 - 827)；
[0014] -促进伤 口愈合（S. Seiwerth, P. Sildrid 等人，J. Physiol. / Paris/, 1997, 9i, 173 - 178)；
[0015] -针对放射性辐射的保护效应（p. Sikirid,m. Petek, R. RuSman, J. Physiol. /Paris/, 1993, 87, 313 - 327)；
[0016] -促进骨折的愈合（b. SebefiiA,. v. MikM, p. BiMti 泛等 人，Bone, 1999, M，195 - 202);
[0017]-与肾上腺素能和多巴胺能系统相互作用，在应激条件下保护粘膜（P.Sikirid等人，Dig. Dis. Sci.，1997,坚，661 - 671);
[0018]-在一些肿瘤类型（腹水，黑色素瘤）中的抗肿瘤效应（p. SikirM， M. Petek, R.Rucman,J. Phys iol. /Paris/, 1993, 87, 313 - 327 ；S. Radel jak, S. Seiwert, P.Sikiric,Melanoma Research, 2004, H(4), A14 - A15)；
[0019] -对疱疹病毒HSV-I和HSV-2、LCM、CMV、A型流感病毒和蜱传脑炎病毒的抗病毒效 应（P.SiMrMsR. Rufiman，. M. Petek, J. Physiol. /Paris/, 1993, §1，313 - 327);
[0020]-促进断裂的神经联系的再生（P.Sikirid等人，Dig. Dis.Sci. ,11,1604 - 1614; M. Giura§in 等人，Dig. Dis. Sci.，2003,坚，1879);
[0021] -促进断裂跟腱的愈合（M. StareSinid, p. Sikirid 等人，1〇竹11〇?6(1. Res. , 2003, 21, 976 - 983)；
[0022] -去除与NO形成有关的器质性异常（P. SikirK等人，Eur. J. Pharm. , 1997, 332, 23 - 33) 〇
[0023] 肽b印ecin作为活生物体自身物质的组成部分不显示任何毒性体征。为了测定 LD5。以及获得关于急性、亚慢性和慢性毒性的数据的目的而在小鼠上进行的测试仍未成功， 因为以IOng至100mg/kg体重的广泛剂量范围静脉内、口服或腹膜内施用的此肽不诱导任 何毒性变化。
[0024] 此外，致畸和遗传毒性的测试（沙门氏菌微粒体试验）没有证实这种作用的体征。
[0025] 合成的十五肽BPC-157的盐还公开于专利EP 0983300和美国专利号6, 288, 028 中。这些盐比原始的形式，即比游离酸或乙酸盐稍好，但它们仍缺乏在胃液中足够的稳定 性。
[0026] 技术问题的解决方案
[0027] 待解决的基本问题是化合物在升高的温度下的稳定性，特别是在胃液中的稳定 性。本发明涉及具有碱性氨基酸的新型十五肽盐，其具有显著改善的热稳定性和在胃液中 的稳定性。
[0028]胃液是不同化合物的复杂混合物且主要成分是：水，氯化钠，盐酸，粘蛋白类，酶， 特别是胃蛋白酶，等等。胃液主要是酸性的；其PH值从1至7不等且异常更高。正常pH值 的范围是从2至5,这也是分解的多肽、肽和蛋白质的胃蛋白酶的最大活性范围。
[0029] 本发明因此涉及式（I)的新型稳定十五肽盐：
[0031] 其中n是1、2或3,并且BAA是碱性氨基酸.
[0032] 作为碱性氨基酸，可使用L-、D_或DL-形式的碱性精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸或其它， 优选为L-精氨酸。
[0033] 本发明还涉及式（I)的十五肽盐的制备方法，其中具有序列（SEQ ID NO 1)的 十五肽与碱性氨基酸BAA在水溶液中于室温下以1至3摩尔碱性氨基酸对1摩尔具有SEQ ID NO 1的十五肽的摩尔比进行反应：
[0034]
[0035] 形成的溶液的pH值用滴定法调节，随后通过HPLC色谱和冷冻干燥以固体形式分 离形成的式（I)的盐。
[0036] 在本发明的方法的优选实施方案中，通过Imol碱性氨基酸与Imol十五肽（SEQ ID NO 1)的反应获得的溶液的pH值被调节至4. 1至5. 0,优选被调节至4. 60±0. 05。
[0037] 在本发明的方法的另一个优选实施方案中，通过2mol碱性氨基酸与Imol十五肽 (SEQ ID NO 1)的反应获得的溶液的pH值被调节至6. 7至7. 8,优选被调节至7. 40±0. 05。
[0038] 本发明还涉及固体和液体形式的药物制剂，其用于口服、静脉内、直肠、阴道、肌肉 内、局部和其它的使用，所述制剂含有治疗有效量的本发明的十五肽盐。
[0039] 本发明还涉及除了本发明的十五肽盐以外，还含有一种或多种其它活性物质，优 选为抗生素或抗氧化剂的药物制剂。
[0040] 本发明还涉及除了本发明的十五肽盐以外，还含有稳定性增强添加剂的药物制 剂，所述添加剂选自包含碱金属和碱土金属碳酸盐或碳酸氢盐的组，优选为碳酸氢钠。
[0041] 本发明还涉及除了本发明的十五肽盐以外，还含有稳定性增强添加剂的药物制 剂，所述添加剂选自包含糖诸如海藻糖、山梨糖醇或D-甘露糖醇的组，但优选为D-甘露糖 醇。
[0042] 本发明还涉及用于阻止、预防和治疗下列疾病和病状的药物制剂：
[0043]-应激相关疾病和病症，胃肠道任何部分中的溃疡，一般性抗炎活性，胃肠炎性疾 病，克罗恩氏病，急性胰腺炎；
[0044] _器官保护活性：保护肝脏和胰腺病变，保护内皮细胞，预防粘连形成，预防和治 疗心肌梗死和脑卒中，在免疫系统中的保护作用；
[0045]-治疗病毒感染，特别是甲型肝炎、疱疹病毒、A型流感病毒和ARBO病毒，诸如蜱传 脑炎，西尼罗河热，登革热1-4型，巨细胞病毒CMV和LCM病毒，猫白血病病毒；
[0046] _治疗黑色素瘤及相关肿瘤；
[0047]-伤口、烧伤、骨折的加速愈合，断裂的神经联系、跟腱和破裂的肌肉、脊髓损伤的 再生；
[0048] _治疗与NO形成相关的器质性异常：高血压，低血压，过敏反应，循环和感染性休 克，凝血细胞聚集；
[0049]-治疗神经系统疾病和病症：多发性硬化，重症肌无力，红斑狼疮，神经病变，躯体 感觉神经功能障碍，哮喘，鼻炎，天疱疮和湿疹；
[0050] _儿茶酚胺能功能障碍，精神分裂症，苯丙胺，药物和酒精戒断效应；
[0051]_预防和消除因皮质类固醇和NSAID引起的病症；
[0052] _治疗眼中的鳞状黄斑变性；
[0053]-作为原始疗法用于其中血液循环的快速重组是必需的所有病况；
[0054] _在兽医医学中用于动物增重以及用于增加精子的贮存稳定性。
[0055] 本发明还涉及本发明的十五肽盐在制备用作食品补充剂的制剂中的用途。
[0056] 发明详述
[0057] 新型化合物的组成和结构通过使用质谱仪，通过氨基酸分析，1H-NMR, FTIR和UV光 谱来测定。UV光谱在Varian Carry 50光谱仪中记录，FTIR光谱在Perkin Elmer 727B光 谱仪中记录，质谱在AutoSpec Q质谱仪上记录，以及1H-NMR光谱在Bruker Advance DPX500 光谱仪上记录。比旋度[a ]D28使用Perkin Elmer 141型光谱仪测定。对于实施例43中 的光学成像，使用摄像机Veho Discovery VMS-001，x30-30,对于热成像，使用利用FLIR QuickPlot软件的红外摄像机的T-335 (FLIR，USA)。
[0058] 上述问题通过具有可以是L-、D-或DL-形式的碱性氨基酸的新型十五肽 bepecin盐而得到解决。典型的氨基酸是精氨酸，赖氨酸，鸟氨酸，2, 4-二氨基丁酸， 2, 6-diaminocapronic acid，2, 6-二氨基己酸，2, 5-二氨基戊酸，2, 6-二氨基庚二酸， 2, 3-二氨基丙酸，瓜氨酸，高精氨酸，高赖氨酸（homolysine)等。这些盐可由一分子的十五 肽和一个、两个或三个分子的碱性氨基酸组成。
[0059] 盐溶液的pH值取决于介导盐稳定性的盐组成。优选使用具有L-精氨酸的盐。它 们通常通过将十五肽（SEQ ID NO 1)与碱性氨基酸在水溶液中以1:1至1:3 (十五肽：碱 性氨基酸）的摩尔比反应来制备。首先，将氨基酸过量加入，随后用稀乙酸重新滴定过量的 氨基酸以调节适宜的pH值。最佳pH值是：在具有摩尔比1:1 (十五肽：BAA)的盐中，4. 1 至5.0,优选4. 60±0. 05 ;在具有摩尔比1:2的盐中，6. 7至7. 8,优选7. 40±0. 05 ;在具有 摩尔比1:3的盐中，该值未经调节。该盐溶液随后在填充有反相吸附剂的HPLC柱上纯化。 在冷冻干燥相应的流出物后，获得高纯度的十五肽盐。
[0060] 所获得的盐非常易溶于水。含有2mol碱性氨基酸/Imol十五肽的十五肽盐具有 最有利的特性，优选的是bepecin二-L-精氨酸盐（缩写：Arg-BPC)。
[0061]如在之前的专利EP 0572688、US 6, 268, 346和在出版物Z. Pflaum, R. Rl^man, Acta Chem. Slov.，2005,翌，34 - 39中所描述的，用于合成的起始化合物（十五肽BPC-157 或b印ecin)在固体聚合物载体上利用肽合成制备。十五肽可以是游离形式，如铵或钠盐， 或甚至是乙酸盐或三氟乙酸盐的形式。
[0062] bepecin二-L-精氨酸盐（1:2,缩写：Arg-BPC)在升高温度下的稳定性通过加速 老化法在50°C和65%的相对湿度（其代表具有肽结构的化合物的非常严格的条件）下测 定。
[0063] 表1 :处于50°C和65%相对湿度中的十五肽含量涕减:
[0065] 该表进一步显示碳酸氢钠至bepecin盐的添加增加了其在升高温度下的稳定性。 这样的添加将在〇. 5mg至3. Omg/lmg bepecin的范围中。在片剂和胶囊剂的组成中将考虑 此特性。使用特定糖例如海藻糖或D-甘露糖醇的添加的单独实验显示稳定性的类似改善。
[0066] 具有L-精氨酸的b印ecin盐