定，所述实验使 用浓度为IOwID5ivimu1的HSV-I和浓度为10 11ID5ivimu1的HSV-2的脑内接种。B印ecinL-精 氨酸盐以10 y g/kg和100 y g/kg的剂量施用。未经处理的动物组用于比较的目的；这些动 物仅用盐水和l〇mg/kg和100mg/kg剂量的阿昔洛韦处理。在一个组中，所有药剂施加48 小时，并且在病毒感染后施加另外的72小时。结果表明，bepecin显著减少致死感染小鼠 中患病动物的数量并且比公认药物阿昔洛韦更有效。用阿昔洛韦治疗的小鼠的存活时间为 112/105/115小时（中值/最小值/最大值），而用bepecin治疗的小鼠的存活时间（在较 小剂量上！）显著更长：131/128/135小时。
[0333] 10 y g/kg和100 y g/kg剂量的bepencin的效率被证实在相同的测试条件下好于 10mg/kg和100mg/kg的显著更高剂量的阿昔洛韦的效率。
[0334] 在用巨细胞病毒CMV感染的情况下获得类似的结果。
[0335] 甲铟流感病毒
[0336] 在MDCK模型（Madin Darby犬肾）上进行b印ecin对甲型流感病毒HlNl和H3N2 型的活性研究。作为培养基，施用补充了 5%胎牛血清和抗生素的MEM(最小必需培养基） (Naruse N?等人，J. Antibiot.，1991，44, 733 - 740)。Bepecin 显示出对甲型流感病毒的强 抑制效应，即使在非常低的32 μg/ml的浓度也如此，并且其比迄今已知使用的化合物显著 更加有效。
[0337] 猫白血病病毒
[0338] 猫白血病病毒（FeLV)是逆转录病毒,由此作为RNA病毒传播，但RNA被逆转录成 DNA。其在猫中以唾液或鼻分泌物传播。该动物的免疫系统失效并且感染对动物是致命的。 这种类型的疾病是血液淋巴细胞癌（白血病）的类型。
[0339] bepecin的活性通过使用在从6个月至5岁大的32只猫（两种性别）上进行的测 试来研究（由所有者同意），这些猫没有针对这种疾病进行预先疫苗接种。所有猫处在强烈 表达的疾病期，Combo FeLV/FIV测试为阳性。所有动物具有高至41. 5°C的高体温，以及严 重疾病的体征：黄疸，腹泻，心动过速，腹痛，脱水和抑郁。
[0340] 经诊断后，所有猫接受皮下注射形式的I y g/kg体重剂量（Iml中的）的bepecin 溶液，前8天每天一次，随后同样的剂量口服多达总共一个月。
[0341] 立即观察到了改善，体温仅在30分钟内即下降最少1°C，并且一般性病况在一周 内回复。然而，一些动物中的病况在4-5天后再次暂时恶化24小时，但在第6天再次改善， 然后在约10天内观察到完全恢复。
[0342] 结论：如果施用I y g/kg体重的每天bepecin剂量，未经预防性接种疫苗并因猫白 血病患病的猫可在10天内完全恢复。迄今为止，除了接种疫苗和非常昂贵的干扰素以 外，还没有针对此疾病的有效药物。
[0343] 基于病毒亚型的相似遗传学，可预期bepecin在一些其它病毒感染的病例中是 有效的，例如水痘带状疱疹（VZV或HHV-3)，Epstein-Barr(EBV)病毒，人疱疹病毒HHV-6、 HHV-7、HHV-8 (Kaposi)和基孔肯雅热（CHIKV)。
[0344] 考虑到这些病毒中的一些也在人中诱导类似疾病现象，相信bepecin可用于也在 人中治疗这些疾病，尤其是在形式对于患者是非常不利时候（例如AIDS和AIDS相关的综 合征）。
[0345] 实施例40 :括约肌作用
[0346] 实验测试方法具体地描述于]\?1^1'1]^(3〇1.3(3；[.，2007，104(1)，7-18311(1工 Pharmacol. Sci.，2006, 102(3)，269 - 277and Regul. Pept. , 2013.181C. 50-66 中。发现 Bepecin (10ng/kg至IOy g/kg体重，胃肠外或口服）保持大鼠中的括约肌功能（食道括约 肌，幽门括约肌和尿道括约肌）和括约肌内的压力，否则这将发生紊乱。此外，即使在长期 持续的病症（即食管炎，急性胰腺炎）后，或在不同的压力性尿失禁程序后，bepecin也可 迅速恢复括约肌功能及其压力。此外，bepecin还缓解和消除由括约肌失能引起的食管炎 和其它病症（急性胰腺炎；不同的压力性尿失禁）。
[0347] 因此，考虑到使用的模型与人体病理学的相似性，bepecin可以是用于与失效的括 约肌功能相关的所有病症的原始疗法。
[0348] 实施例41 :动物体重增加-兽医学
[0349] 通过使用Dig. Dis. Sci.，2009, 54(1)，45 - 56中描述的方法，对具有广泛小肠切 除后的晚期短肠综合征和进展性体重减轻的大鼠进行了 4周的研究。在手术后，动物的疲 惫随着伴随的体重减轻、隐窝深度的两倍增加、在第一个周内肌肉厚度的四倍增加、空肠和 回肠扩张和紊乱的空肠/回肠比率而增加。在b印ecin施用后立即观察到持续的体重增加 和以下的增加：绒毛高度，隐窝深度和肌肉厚度（圆形肌肉层）。以l〇ng/kg至10 y g/kg体 重剂量的bepecin i.m.或p.o.处理的大鼠不具有空肠和回肠直径的不同。它们有恒定的 空肠/回肠比和增加的吻合断点。
[0350] 因此，用所述剂量的b印ecin从第1天至21天处理小猪具有实质更好的体重增加 并且无腹泻。
[0351] 因此，考虑到使用的模型与动物病理学的相似性，b印ecin可以是在与短肠功能相 关的所有病症中的原始疗法。此外，bepecin可因而用于也在耕作动物中改善体重增加。
[0352] 实施例42 =Bepecin对精子保存的影响
[0353] 通常已知在精子的保存中由于温度变化和渗透效应，精子冷冻过程导致精子活动 力降低大约50%。形态学变化由于精子膜的组织、通透性和脂质组成而发生。
[0354] 已发现bepecin对根据稍作改良的标准方法（培养基在冷冻前加入bepecin)冷 冻的牛精子的活动力具有有益作用。
[0355] 实验的第一部分旨在测定体外最有效bepecin剂量（20ng/ml)对精子（如果精子 在冷冻前以这样的方式处理）解冻后的质量的效应。第二部分研究对精子形状的效应。结 果由相差显微镜和通过CASA计算机处理进行评价。
[0356] 在培养基冷冻前使用bepecin的处理相较于对照精子样品改善了在37°C下的解 冻后活动力（P〈〇. 05 ;主观法：P= 0? 0046;CASA:P= 0? 014)。
[0357] 精子与b印ecin在解冻后立即的共处理改善了其相较于对照样品的活动力 (P〈0. 05 ;主观法：P = 0? 0018 ;CASA :p = 0? 014)。
[0358] 考虑所述结果，可得出结论，在加入b印ecin的情况下冷冻牛的精子对精子解冻 后的体外质量具有很好的效应。为了确认这些结果，进一步的体内研究将是有益的。
[0359] 结论：根据目前可用的结果，bepecin对精子在低温保存中的质量具有有利的效 应。
[0360] 实施例43:在血管摘除后的效应
[0361] B印ecin在大血管切除后具有特定的有益效应。不同于L-NAME和L-精氨酸， bepecin迅速桥接血管断端之间的缺损，从而即使在最坏的情形下，也迅速地重新组织血液 供应。
[0362] 大鼠中股动脉的一部分（腹壁后动脉和旋股侧动脉之间）被切除以研究在临界 尺寸血管缺损形成后的血管缺损内侧支血管的出现。血管缺损内侧支血管出现根据在 CardiovascRes. 1997Sep;35 (3) : 547 - 52中对于微血管造影评估所描述的方法进行评估。 使用红外摄像机进行热成像。
[0363] 在切除大鼠中股动脉的限定部分后5-10分钟在于血管缺损出现后立即接受局部 1分钟盐水浴（lml/大鼠，5ml/kg)的对照组中没有观察到血管缺损内的侧支血管出现。图 5A〇
[0364] 在于血管缺损出现后立即接受局部1分钟L-精氨酸浴（lml/大鼠，100mg/kg)的 大鼠中切除股动脉的限定部分后5-10分钟在血管缺损内存在微小的侧支血管但没有相互 连接。
[0365] 在于血管缺损出现后立即接受局部1分钟L-NAME浴（lml/大鼠，5mg/kg)的大鼠 中切除股动脉的限定部分后5-10分钟血管缺损的区域是完全空的并且血管缺损内没有侧 支血管存在。
[0366] 在b印ecin施用的情况下，在于血管缺损出现后立即接受局部1分钟b印ecin浴 (lml/大鼠，10 y g/kg)的大鼠中切除股动脉的限定部分后5-10分钟在血管缺损内可观察 到（由热成像记录确认）具有完全相互连接形成桥接网络和功能性网络的侧支血管。图 5B〇
[0367] 该证据表明，bepecin介导的适应在股动脉切除和闭塞后迅速出现在现有侧支动 脉内以恢复血管传导和从而肢体血流。事实上，晚期适应是动脉生成，其是侧支动脉重塑 的过程，而早期适应是血管舒张J. Vase. Surg. 2010Jan ;51 (1) : 165 - 73。无论如何，L-精 氨酸和bepecin之间的明显区别证明早期适应（目前在血管损伤后按天-周期（而不是 分钟-周期）研究，并且不是在血管缺损本身内研究）不是简单的血管扩张，而是特定的 bepencin介导的桥接过程。我们可以谈论的是对通过络脉的血液的初始增加（以成为永久 的方式）具有显著效应的重要过程。因此实现了高度发达的阶段和改善的最终结果（从两 个断端形成血管树）。
[0368] 基于该实验结果，bepecin可以是针对其中血液供应的快速重组会是强制性的所 有病况的原始疗法。
[0369] 实施例44 :急性毒性
[0370] 在所有的研究中，b印ecin显示非常安全的特征谱。作为二-L-精氨酸盐（1:2)以 及所有其它盐形式的B印ecin，当以非常高的剂量方案即lg/kg体重腹膜内、静脉内或胃内 给予雄性和雌性Wistar Albino大鼠时，显不无毒性且无不良效应。
【主权项】
1. 通式（I)的新型稳定十五肽盐：其中n表示1、2或3,并且BAA表示碱性氨基酸。2. 式（I)的新型稳定十五肽盐，其中碱性氨基酸是L-、D-或DL-形式的精氨酸、赖氨 酸、鸟氨酸或其它氨基酸，优选是L-精氨酸。3. 通式（I)的新型稳定十五肽盐的制备方法，其特征在于，将具有（SEQIDNO1)的 十五肽与碱性氨基酸BAA在水溶液中于室温下以1至3的碱性氨基酸对1摩尔具有（SEQ IDNO1)的十五肽的摩尔比进行反应：其中所形成的溶液的pH值用滴定法调节，随后通过HPLC色谱和冷冻干燥以固体形式 分离形成的式（I)的盐。4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，将L-、D-或DL-形式的精氨酸、赖氨酸、 鸟氨酸或其它氨基酸，优选L-精氨酸，用作碱性氨基酸。5. 根据权利要求3和4所述的方法，其特征在于，通过lmol的碱性氨基酸与lmol 的十五肽（SEQIDNO1)的反应获得的溶液的pH值被调节至4.1至5.0,优选被调节至 4. 60±0. 05。6. 根据权利要求3和4所述的方法，其特征在于，通过2mol的碱性氨基酸与lmol 的十五肽（SEQIDNO1)的反应获得的溶液的pH值被调节至6. 7至7. 8,优选被调节至 7. 40±0. 05。7. 固体和液体形式的药物制剂，其用于口服、静脉内、直肠、阴道、肌肉内、局部和其它 的使用，所述制剂含有治疗有效量的根据权利要求1和2所述的具有通式I的十五肽盐。8. 根据权利要求7所述的药物制剂，其特征在于除了所述十五肽盐以外，还含有一种 或多种其它活性物质，优选为抗生素或抗氧化剂。9. 根据权利要求7和8所述的药物制剂，其特征在于含有用于增加稳定性的添加剂，所 述添加剂选自碱金属和碱土金属碳酸盐或碳酸氢盐，优选为碳酸氢钠。10. 根据权利要求7、8和9所述的药物制剂，其特征在于含有用于增加稳定性的添加 剂，所述添加剂选自糖诸如D-甘露糖醇、海藻糖、山梨糖醇或类似的，优选为D-甘露糖醇。11. 根据权利要求7至10所述的药物制剂，其用于在下列疾病、病状和病症的预防、保 护和治疗中使用： -应激相关疾病和病症，胃肠道任何部分的溃疡，一般性抗炎活性，胃肠炎性疾病，克罗 恩氏病，急性胰腺炎； _器官保护活性：保护肝脏和胰腺病变，保护内皮细胞，预防粘连形成，预防和治疗心 肌梗死和脑卒中，在免疫系统中的保护效应； -治疗病毒感染，特别是甲型肝炎、疱疹病毒、A型流感和ARBO病毒，诸如蜱传脑炎，西 尼罗河热，登革热1-4型，巨细胞病毒CMV和LCM病毒，猫白血病病毒； -治疗黑色素瘤及相关肿瘤； -伤口、烧伤、骨折的加速愈合，断裂的神经联系、跟腱和破裂的肌肉、脊髓损伤的再 生；； -治疗与NO形成相关的器质性异常：高血压，低血压，过敏反应，循环和感染性休克，凝 血细胞聚集； -治疗神经系统疾病和病症：多发性硬化，重症肌无力，红斑狼疮，神经病变，躯体感觉 神经功能障碍，哮喘，鼻炎，天疱疮和湿疹； -儿茶酚胺能功能障碍，精神分裂症，苯丙胺，药物和酒精戒断效应； -预防和消除因皮质类固醇和NSAID引起的病症； -治疗眼中的鳞状黄斑变性； -作为原始疗法用于其中血液供应的快速重组是必需的所有病况； -在兽医医学中用于动物增重以及用于增加精子的贮存稳定性。12. 根据权利要求1和2所述的十五肽盐在制备用作食品补充剂的制剂中的用途。
【专利摘要】新型的稳定十五肽盐，其制备方法，其在制备药物制剂中的用途以及其治疗用途。本发明公开了通式(I)的新型稳定十五肽盐：其中n表示1、2或3，并且BAA表示碱性氨基酸，其制备方法，使用其用于制备液体和固体形式的药物制剂的方法以及其用于在疾病和病状的治疗中进行预防、保护和用于制备用作食品添加剂的制剂的用途。
【IPC分类】C07K14/47, C07K7/08, A61K38/17, A61K38/10
【公开号】CN105101987
【申请号】CN201380074630
【发明人】R·鲁奇曼
【申请人】迪亚根有限责任公司
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2013年5月9日
【公告号】CA2903970A1, WO2014142764A1