提取物和含有该提取物的制剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及通过试验或检查而确认含有规定量的硫酸化酪氨酸、品质更稳定的痘 苗病毒接种兔炎症皮肤提取物和W该提取物为有效成分的制剂等。
【背景技术】
[0002] 医药品是只有确保其品质才能受到制造销售的许可的商品。在日本，在药事法第 14条中对此进行了规定。在其他各国，在医药品的性质上，运样的处理基本上也是同样的。 运样在医药品中品质的确保被认为很重要是因为品质会保证医药品的有效性和安全性。反 过来说，品质没有得到确保的医药品，不能保证有效性和安全性，就缺少作为医药品的资 格。
[0003] 在日本，作为在医药品的生产中所使用的原料物质且为医药品的有效成分的物质 被称为"原药"。另外，原药也与医药品同样必须确保其品质。原因是医药品的品质依赖于 原药的品质。另外，在日本的药事相关法令中，原药被规定为专口用于制造其它医药品的医 药品，定义上，原药被包含在医药品中。但是，在本申请中，为了方便，有时分别称医药品和 原药，此时的医药品是指除去原药W外的医药品。
[0004] 一般而言，医药品和原药通过由规定的制造方法制造而制造成为规定品质的产 品。因此，为了保证医药品和原药的品质，制造管理也重要。因此，在日本制定了"关于医 药品和医药部外品的制造管理和品质管理基准的省令"。该省令在日本也称为GMP(Good Manufac化ringPractice的简称）。在GMP中对于医药品等的"制造管理"和"品质管理" 进行了规定。在"制造管理"中，采取了通过管理原料的采购、制造工序的最开始到最后从 而来保障品质的思路。"品质管理如下为中屯、进行：通过在制造后进行的试验或检查来 确认实际所制造的医药品和原药是否具有规定的品质。在那样的试验和检查的结果不符合 预先确定的基准时，该医药品和原药不被许可出厂、销售、使用等。运样医药品和原药通过 制造管理和品质管理来管理其品质。
[0005] 痘苗病毒接种兔炎症皮肤提取物（W下有时称为"本提取物"）是含有从接种痘苗 病毒而发痘的兔的炎症皮肤组织中提取分离的非蛋白性的活性物质的提取物。本提取物在 被提取后的状态下为液体，但通过干燥也能够制成固体。
[0006] 含有本提取物为有效成分的制剂（W下有时称为"本制剂"），如后所述，作为医药 品非常有用。此时，因为本提取物是本制剂的有效成分，所W本提取物就成为本制剂的原 药。作为本制剂，申请人在日本制造销售的具体商品中有"含有痘苗病毒接种家兔炎症皮肤 提取液的制剂"（商品名：肥UR0TR0PIN[注册商标]，W下称为"NTP制剂"）。在NTP制剂 中，有注射剂（W下称为"NTP注射剂"）和片剂（W下称为"NTP片剂"），均为医疗用医药 品（ethical化ug)。作为NTP制剂有效成分的痘苗病毒接种家兔炎症皮肤提取液（W下称 为"NTP提取液"）是NTP制剂的原药。NTP提取液包含在本提取物中，NTP制剂（NTP注射 剂和NTP片剂）包含在本制剂中。
[0007]NTP注射剂的适应症为"腰痛症、颈肩腕综合征、症状性神经痛、伴随皮肤病（湿 疹、皮肤炎、等麻疹）的搔痒、过敏性鼻炎、亚急性视神经脊髓病（SMON)后遗症的冷感-知 觉异常-疼痛"。NTP片剂的适应症为"带状瘤疹后神经痛、腰痛症、颈肩腕综合征、肩周炎、 变形性关节炎"。NTP制剂是申请人创制并作为医药品开发得到的制剂。就NTP制剂而言， 其有效性和安全性中的优异特点受到较高评价，长年被销售，在日本的医药品市场中确立 了稳固地位。另夕F，现在NTP制剂被出口到中国，神经妥乐平/肥UR0TR0PIN"的商品名 销售。在中国的NTP制剂的适应症与日本相同。
[0008] 运样，本制剂作为医药品十分有用，本提取物作为本制剂的原药也十分有用。但 是，如上所述，本提取物是从接种痘苗病毒而发痘的兔的炎症皮肤组织中提取分离的提取 物。因此，本提取物含有极多的物质（成分），使用本提取物制造的本制剂也仍然含有极多 的物质（成分）。因此，怎样管理本提取物和本制剂的品质使其稳定是非常重要的事项。
[0009] 许多医药品是种或最多2~3种物质（成分）作为有效成分的制剂，通常，运 些物质是被化学合成的化合物。因此，测定该制剂中的该化合物的含量，如果含有规定的 量，则从该制剂的有效成分含量的方面出发的品质就得到保证。但是，本提取物是来自接种 痘苗病毒而发痘的兔的炎症皮肤组织的提取物，含有极多种类的物质。W本提取物为有效 成分的本制剂，当然也同样含有极多种类的物质。运样，本提取物和本制剂不是W特定的1 种或数种物质作为有效成分，所W不能进行将有效成分作为物质进行特别规定的通常的医 药品中那样的品质管理。因此，申请人制造的本提取物和本制剂、即NTP提取液和NTP制剂 的有效成分的定量（quantitativedetermination),通过测定其生物活性（效价、titer) 的方法进行。
[0010] 上述方法是使用作为疼痛阔值比正常动物低的慢性应激动物的SART应激（反复 寒冷负荷）动物求出镇痛系数的生物学试验方法（"日药理志"、第72卷、第5号、573-584 页、1976年）。通过该文献所记载的方法，使用作为疼痛阔值比正常动物低的慢性应激动物 的SART应激（反复寒冷负荷）动物，由炎症足加压（RandaU-Selitto)法进行镇痛试验求 出镇痛系数。该方法是在小鼠的尾部施加压力刺激，W直到小鼠显示逃避反应的加压重量 为指标，测定镇痛效果的方法。所谓镇痛系数是将在投与药物后测定的加压重量除W药物 投与前测定的加压重量得到的值。关于NTP提取液和NTP制剂，W显示申请人规定的一定 值W上的镇痛系数的情况作为镇痛效果阳性，求出被判断为阳性的动物只数的比例，作为 镇痛有效率（％)。从该值，根据对于稀释为各种浓度的标准品测定的结果求出邸5。值。作 为申请人关于NTP制剂使用的生物活性（效价）的单位的"Neurotropin单位（NU)"，通过 将邸5。值为给药量lOOmg/kg(小鼠体重）的本提取物Img显示的活性设为INeurotropin 单位来定义。然后，关于各NTP制剂测定邸W值，与标准品进行比较来定量镇痛活性（有效 成分量）。W下，在本申请中，作为本提取物和本制剂的有效成分量（效价）的尺度，使用 "单位"运样的表示，但实质上与NTP提取液和NTP制剂中使用的"化urotropin单位"意义 相同。 W11] 但是，在申请人制造的本提取物和本制剂，即NTP提取液和NTP制剂中，在上述镇 痛活性的定量W外，还进行如下的多个确认试验，规定必须符合运些试验。目P，关于申请人 制造的本提取物和本制剂，不是只在上述生物活性（效价）中确保其制造批次适合，而且还 进行如下的多个确认试验，将符合运些试验作为本提取物和本制剂的使用、出厂的必要条 件。
[0012] ?由液相色谱法进行的氨基酸的确认试验
[0013] ?由紫外可见吸光度测定法进行的紫外部吸收物质的确认试验
[0014] ?由显色反应法进行的憐的确认试验
[0015] ?由液相色谱法进行的核酸碱基的确认试验
[0016] ?由invitro试验法进行的血管舒缓素样物质产生抑制作用的确认试验
[0017]虽然进行运样的试验，但是并不是说作为试验对象的氨基酸、紫外部吸收物质、憐 和核酸碱基等是本提取物和本制剂的核屯、的有效成分。另外，运些试验中，氨基酸、紫外部 吸收物质、憐和核酸碱基的各确认试验为定性试验，作为试验对象的氨基酸等存在即可，不 管含有的量多少。尽管如此，运些试验在有效成分未知的本提取物和本制剂两者中，作为用 于减少每制造批次的品质偏差、保证均质性的措施，是申请人从当局得到医药品制造许可 中所规定的。
[0018] 一般而言，对于制造来自动物或植物运样的生物的提取物和含有该提取物作为有 效成分的制剂的制造者来说，该制剂必须符合的基准少，由于不需要用于试验和检查的时 间、劳动、费用，另外制造品变得不合格的可能性也降低，所W是有利的。但是，从保证上述 那样的提取物和制剂品质的观点出发，希望应该符合的基准被更严格地规定。本发明是从 运样的观点出发，关于申请人制造的本提取物和本制剂，作为应该符合的新基准而深入研 究适合的基准，结果完成的发明。目P，测定本发明设及的本提取物和本制剂所含有的硫酸化 酪氨酸的量，该含量在一定范围内时，将该本提取物和本制剂作为被适当制造的物质处理， 良P，许可使用、出厂。由此，本提取物和本制剂的每制造批次的偏差进一步降低，品质变得更 加稳定。另外，由此，本提取物和本制剂的有效性和安全性受到更加严格地保证。只要是硫 酸化酪氨酸的含量脱离所规定的一定范围的本提取物和本制剂，就将其作为不良品（不合 格品）处理，由此能够将本提取物和本制剂的品质管理得更稳定。目P，对于本提取物和本制 剂所含有的硫酸化酪氨酸的量，能够设置自主的或公共的基准。另外，申请人关于至今制造 的NTP提取物和NTP制剂，对于它们中所含有的硫酸化酪氨酸的量没有设定基准，没有进行 在测定该含量、确认该含量在一定范围内的基础上将NTP提取物和NTP制剂投入使用、出厂 等。
[0019] 作为公开本提取物或本制剂的文献，存在专利文献1~3。在运些文献中有关于 在本提取物或本制剂中的氨基酸和核酸碱基的含量的记载。另外，同样关于本提取物或本 制剂，在专利文献4中有关于娃类含量的记载。但是，在运些专利文献1~4中，关于本提 取物或本制剂含有多少硫酸化酪氨酸运样的特定物质却没有任何记载。而且，在运些文献 中，关于将本提取物或本制剂中的硫酸化酪氨酸的含量作为用于将本提取物或本制剂品质 管理得更加稳定的指标既没有记载也没有启示。
[0020] 现有技术文献 阳OW专利文献
[0022] 专利文献1 :中国专利公开CN1205233A公报
[0023] 专利文献2 :国际公开W02004/060381号公报
[0024] 专利文献3 :中国专利公开CN1613305A公报 阳0巧]专利文献4 :日本特开平7 - 97336号公报
【发明内容】
[00%] 发明所要解决的课题
[0027] 如上所述，在本提取物和本制剂中，没有鉴定单一物质作为有效成分。因此，本提 取物和本制剂的品质，通过使用SART应激小鼠求出镇痛系数的生物学试验进行的效价检 测和多个确认试验等来确保。另外，尽管如此，在本提取物和本制剂中包含的各种成分在每 个制造批次中不可避免地有相当程度的偏差。但是，既然本制剂作为治疗疾病的医药品而 使用，就希望其品质尽可能保持一定。更稳定地确保本提取物和本制剂的品质，关系到将本 提取物和本制剂的有效性和安全性制造得更恒定，是非常有意义的。
[0028] 用于解决课题的方法
[0029] 本发明是W在本提取物和本制剂中含有的硫酸化酪氨酸的量作为指标来确保本 提取物和本制剂的品质的发明。即，本发明提供：通过确认含有规定量的硫酸化酪氨酸而被 评价为是适当制造得到的本提取物和本制剂等。
[0030] 发明的效果
[0031] 本发明设及的本提取物和本制剂是含有规定量的硫酸化酪氨酸的提取物和制剂。 由此，本发明设及的本提取物和本制剂能够作为适当制造得到的提取物和制剂处理。本发 明是在更稳定地确保本提取物和本制剂的品质、本提取物和本制剂的有效性和安全性变得 更恒定的方面有利的发明。
【具体实施方式】
[0032] 蛋白质在生物体内发挥着重要作用。构成蛋白质的氨基酸序列信息被基因组DNA 编码。WDNA为模板合成mRNA后，根据该mRNA的信息，氨基酸逐渐被结合起来，由此合成 蛋白质（翻译：Translation)。运样被合成的蛋白质，有W其自身发挥功能的，但也有很多 在翻译后通过添加糖、部分切断或憐酸化等来表达活性或被控制的蛋白质（翻译后修饰： Post-translationalmodification)。酪氨酸硫酸化（Tyrosinesulfation)是蛋白质的 翻译后修饰之一，在蛋白质的酪氨酸残基上添加横基。硫酸化酪氨酸是在受到了酪氨酸硫 酸化的蛋白质被代谢的过程中生成的，是不容易被哺乳类具有的硫酸醋酶分解的非常稳定 的物质。
[0033] 然而，如果在生物体内引起炎症反应等，就会观察到白细胞在其组织周边的血管 内皮上翻滚的现象（白细胞滚动：LeucocyteRolling)。白细胞通过位于其表面的选择素 等黏附分子，与内皮细胞反复接触，捜索在血管内皮上提呈的趋化因子等游走因子。白细胞 如果识别趋化因子，就会与血管内皮细胞牢固地黏附并停止移动。然后，白细胞局部地破坏 内皮细胞的连接，从生成的间隙浸润到炎症组织中。经由选择素的白细胞与血管内皮细胞 的黏附运样诱导白细胞滚动，但已知酪氨酸的硫酸化参与该黏附反应。即表明，作为选择素 的受体的PS化-1(P-选择素糖蛋白配体，P-selectinglycoproteinligand-1)的氨基末 端附近的酪氨酸被硫酸化修饰，对于选择素向PS化-1的基于高亲和性的结合是必须的。另 夕F，在白细胞表面存在的作为G蛋白偶联型受体的趋化因子受体（CCR5、CXCR4等）也受到 通过酪氨酸硫酸化的翻译后修饰。运样，由于炎症和酪氨酸硫酸化密切相关，所在炎症 组织中被硫酸化的各种蛋白质为起源的硫酸化酪氨酸能够作为皮肤组织炎症状态的指标 利用。本提取物是从对兔接种痘苗病毒使炎症发生的皮肤组织中提取的提取物，需要引起 充分的炎症反应。因此，作为用于将本提取物和本制剂的品质管理得更稳定的指标，硫酸化 酪氨酸成为符合目的的物质（成分）。即可W支持如下事实：通过确保本提取物或本制剂 中所含有的硫酸化酪氨酸的量在一定量W上或一定的范围内，包括本提取物或本制剂中所 含有的来自兔炎症皮肤组织的有效成分在内的各种成分成为稳定的成分。另外，确认了在 W与本提取物同样的方法从正常的兔皮肤提取的提取物不存在镇痛作用等。
[0034] 接着，说明制造本提取物和本制剂的方法。
[0035] 本提取物能够通过采集在兔的皮肤中接种痘苗病毒而发痘的炎症皮肤，进行破 碎，加入提取溶剂处理后，除去组织片，进行除蛋白处理，在酸性条件下使其吸附于吸附剂， 接着在碱性条件下将有效成分洗脱而得到。
[0036] 其中，痘苗病毒（vacciniavirus)可W是任意株的痘苗病毒。作为例子，可W列举 利斯特化ister)株、大连值airen)株、池田（化eda)株、EM-63株、纽约市公众卫生局（New YorkCityBoardofHealth)株等。
[0037] 另外，兔只要属于兔形目就可W为任意的兔。作为例子，有穴兔、家兔（将穴兔驯 化的兔）、野兔（日本野兔）、鼠兔、雪兔等。其中，适合使用家兔。在日本，有从过去被饲养 的作为家畜或实验用动物而频繁使用的称为家养兔（^工9亏半）的兔，但运也是家兔的 别称。在家兔中存在多个品种化reed),但能够优