抗血栓形成移植物的制作方法
【专利说明】抗血栓形成移植物
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请有权根据35 U. S. C. § 119(e)要求于2013年5月20日提交的美国临时专 利申请号61/825, 256的优先权，该申请以其整体通过引用并入本文。
[0003] 关于联邦资助的研究或开发的声明
[0004] 本发明是在政府支持下利用由国立卫生研究所授予的HL083895完成的。政府在 本发明中拥有某些权利。
【背景技术】
[0005] 血管移植术是利用移植的血管或合成支架来替换、修复或绕过损伤的或潜在危险 的血管。血管移植物被植入到患有多种多样疾病和病症的受试者中，所述疾病和病症包括 心血管疾病、动脉粥样硬化、周围性血管疾病、腹主动脉瘤等等。这些移植物可以改善或恢 复至其中流动被阻塞的区域的血流。尽管现在传统地使用自体血管或由生物相容材料制成 的合成血管，但在使用脱细胞结构作为血管移植物中已经有了一些进展。脱细胞血管移植 物保留了天然血管的形状和结构，但不含有细胞，由此使移植物的免疫原性最小化。各种脱 细胞生物学结构正在被开发为小口径血管移植物。目前它们的主要缺点是高促凝性，可以 通过利用宿主细胞将植入物的腔侧再细胞化来降低高促凝性。然而，此解决方案意味着至 少一个月的患者专门等待时间，其原因是需要采集和扩充自体内皮细胞以衬于移植物腔。 对于刚出现的生物血管移植物（诸如组织工程的和天然脱细胞的移植物）的临床应用，在 需要的时候将是可用的解决方案对于临床应用来说是必不可少的。
[0006]因此，在本领域中存在对血管移植物的抗血栓形成涂层的需求。本发明满足了这 种尚未被满足的需求。
【发明内容】
[0007] 如下所述，本发明包括抗血栓形成组合物，诸如抗血栓形成血管移植物，所述组 合物包括涂覆有抗血栓形成涂层的脱细胞组织；制备抗血栓形成组合物的方法；和治疗方 法，所述治疗方法包括将所述抗血栓形成组合物植入需要所述治疗方法的受试者中。
[0008] 本发明的一个方面包括一种组合物，所述组合物包括具有至少一个涂覆有抗血栓 形成涂层的表面的基底。
[0009] 另一个方面包括制备涂覆有抗血栓形成涂层的移植物的方法，包括以下步骤：提 供具有至少一个表面的基底；以及将所述至少一个表面涂覆以抗血栓形成涂层，其中所述 涂覆包括：向所述表面施加第一交联溶液；以及向所述表面施加水凝胶溶液，由此在所述 基底的表面上提供第一层。
[0010] 在另一个方面，本发明包括治疗受试者中的患病血管的方法，包括通过将抗血栓 形成血管移植物植入所述受试者中来绕过所述患病血管，所述抗血栓形成血管移植物包括 具有涂覆有抗血栓形成涂层的腔面的基底。
[0011] 在还另一个方面，本发明包括在受试者中提供血管通路的方法，包括将抗血栓形 成血管移植物植入所述受试者中，所述抗血栓形成血管移植物包括具有涂覆有抗血栓形成 涂层的腔面的基底。
[0012] 在本文中描述的本发明的上述方面或任何其它方面的各种实施方式中，抗血栓形 成涂层包括第一层，所述第一层包含水凝胶。在一个实施方式中，第一层包含透明质酸，诸 如硫醇改性的透明质酸。在另一实施方式中，第一层与基底的至少一个表面一一诸如基底 的腔面一一交联。在又另一实施方式中，水凝胶溶液包含透明质酸。
[0013] 在另一实施方式中，抗血栓形成涂层进一步包括第二层，所述第二层包含抗凝剂， 其中第二层与第一层交联。在一些包括第二层的实施方式中，第二层包含肝素。在另一实 施方式中，抗凝剂溶液包含肝素。
[0014] 在又另一实施方式中，基底是脱细胞组织，诸如脱细胞血管。在另一实施方式中， 脱细胞组织是具有腔面的脱细胞血管，并且其中抗血栓形成涂层被涂覆在脱细胞血管的腔 面上。
[0015] 在还另一实施方式中，涂覆进一步包括向所述第一层施加第二交联溶液并且向所 述第一层施加抗凝剂溶液，由此在所述第一层上面提供第二层。
[0016] 在还又另一实施方式中，受试者具有选自以下的病症：周围性血管疾病、动脉粥样 硬化、动脉瘤和静脉血栓形成。在一个实施方式中，受试者正在经历或预期要经历血液透 析。
【附图说明】
[0017] 当结合附图阅读时将更好地理解下面对本发明的优选实施方式的详述。为了举例 说明本发明的目的，在附图中显示了目前优选的实施方式。然而，应当理解的是，本发明不 限于在附图中显示的实施方式的准确布置和手段。
[0018] 图1是脱细胞移植物结构的基于HA-肝素的涂层的示意性描述，所述细胞移植物 结构使用巯基化-HA作为涂层的第一层和使用"端点（end-on) "胺化的肝素作为涂层的第 二层。
[0019] 图2A描绘了对用于"端点"肝素改性的肝素改性和添加磺基-SMCC用于自发的肝 素交联至涂覆透明质酸的脱细胞血管的示意性描述。
[0020] 图2B描绘了肝素改性的NMR表征。
[0021] 图3是一组图像，描绘了使用递增浓度的SM(PEG) 12交联剂（NHS-马来酰亚胺交联 剂）的涂覆HA的脱细胞猪腹主动脉的横截切片。当交联剂的浓度增加时，涂层光滑度和厚 度也增加，如通过表面上厚度增加的蓝色染料（甲苯胺蓝）层和橙色染料层（Alamar Blue pH 1)所证明的。由甲苯胺蓝和Alamar Blue pH 1(AB pH 1)两者中的箭头指示涂层。
[0022] 图4是一组图像，描绘了对照脱细胞大鼠腹主动脉（被脱细胞而没有进一步处理 的主动脉）、透明质酸涂覆的脱细胞主动脉和透明质酸-肝素逐层涂覆的主动脉的鸟瞰视 图SEM图像。
[0023] 图5是描绘了 HA-肝素逐层涂覆的整个管状脱细胞大鼠腹主动脉的SEM横截切片 的图像。可以在血管的腔侧上清晰地看到涂层为几微米厚的层，如由白色箭头所指示的。
[0024] 图6是一组图像，描绘了整个管状对照大鼠腹主动脉（没有进一步处理的脱细胞 主动脉）和透明质酸-肝素逐层涂覆的脱细胞主动脉的组织学切片。这些切片用甲苯胺蓝、 爱茜蓝pH 1和爱茜蓝PAS染色。可以在血管的腔侧上清晰地看到涂层为几微米厚的层。
[0025] 图7是在脱细胞对照大鼠腹主动脉、透明质酸涂覆的和透明质酸-肝素逐层涂覆 的脱细胞主动脉上孵育的分离自大鼠血液的血小板的一组SEM图像。血小板和血栓形成在 对照上清晰可见。经处理的血管显示完全没有血小板粘附。
[0026] 图8是一组图像，描绘了来自实验的结果，在所述实验中，血小板被鬼笔环肽染色 (其在血小板中产生红颜色），在脱细胞对照大鼠腹主动脉和透明质酸-肝素逐层涂覆的脱 细胞主动脉上孵育。在对照主动脉上血小板清晰可见。涂覆的主动脉显示没有血小板。
[0027] 图9是描绘经由X因子测定确定功能性表面肝素的图，其中以反算的肝素当量表 示肝素对X因子灭活的作用。测定的样品为：脱细胞对照主动脉、新鲜切除的保留了连续层 的内皮细胞的天然大鼠主动脉、培养的连续单层的HUVEC和透明质酸-肝素涂覆的脱细胞 大鼠王动脉。
[0028] 图10是描绘其中HUVEC被铺在HA-肝素逐层涂覆的主动脉上并培养2周的实验 的结果的图像。HUVEC细胞骨架用鬼笔环肽（红色）染色且HUVEC核用DAPI (蓝色）染色， 并且在10ym协议栈（z-stack)上成像。x和y轴显示在图像的侧面上，其中看见HEVEC长 成了非平面单层。可以看到HUVEC侵入了涂层。
[0029] 图11是显示了在脱细胞猪主动脉上孵育的HA凝胶和HA-PEG交联剂的恢复模量 (G'整圆）和损失模量（G"开口圆）被绘制为时间的函数的一组图。组A和B显示了在 没有PEG交联剂的情况下加载到脱细胞猪主动脉上的透明质酸，并且其中弹性模量（G') 和损失模量（G")以Log(组A)或Ln (组B)针对时间作图。组C和D显示在添加PEG交 联剂的情况下加载在脱细胞猪主动脉上的透明质酸。弹性模量（G')和损失模量（G") 以Log(组C)或Ln(组D)针对时间作图。使用上面的复合恢复模量方程，在凝胶的80% 聚合形式下，对于HA-PEG恢复模量G计算为37kPa，而对于不含PEG交联剂的HA凝胶计算 为2kPa。对于涂层开发重要的是，HA-PEG凝胶在4小时孵育时间内达到它们的成熟交联形 式，而HA凝胶在23小时的孵育时间内单独达到成熟形式。这指示在血管内HA凝胶的腔灌 注至少4小时后应当具有完全聚合的涂层。
[0030] 图12是一组图像，显示了在37°C下对在PBS(组A)和新鲜抽取的大鼠血浆（组 B)下孵育2周的未涂覆的脱细胞大鼠主动脉对照（左手组图像）和涂覆了透明质酸/肝素 的脱细胞大鼠主动脉（右手组图像）的稳定性评价。经PBS和大鼠血浆两者孵育后，涂层 仍然存在并经AB/PAS和甲苯胺蓝染色可见。
[0031] 图13是一组图像，显示了培养三天后用DAPI (蓝色）和VE-钙粘蛋白（红色）染 色的接种在三种不同的沉积涂层上的HUVEC。涂层组分是生物相容的并且支持内皮细胞在 体外短时期内生长和增殖。
[0032] 图14是一组图像，显示了在大鼠腹主动脉中端-对-端植入的大鼠-脱细胞移植 物在植入4周后的横截切片。上组显示了对照组的实施例，在该对照组中植入的移植物是 没有进一步改性的脱细胞大鼠主动脉。下组显示了在大鼠腹主动脉中端-对-端植入的透 明质酸涂覆的大鼠脱细胞移植物在植入后4周的实施例。所有切片用苏木精和伊红（H&E) 染色，其显示近腔细胞在移植物内的迀移以及对照组大鼠的大血凝块内的细胞沉积。
[0033] 图15是一组图像，显示了在第4周时的外植体和在第4周时对移植物通畅性 (graft patency)的多普勒超声成像评估。上组是对照脱细胞大鼠主动脉，而下组是透明质 酸涂覆的脱细胞大鼠主动脉。根据多普勒超声成像，对照植入物显示没有流动记录，在多普 勒超声成像中扁平线指示没有流动。外植体的图片显示在植入物的中心形成的大纤维化血 凝块阻止任何血流通过移植物。移植物也扩张到其原始尺寸的20X，这指示移植物壁可能很 薄弱和大的吻合形成。另一方面，透明质酸涂覆的大鼠脱细胞主动脉（下组）多普勒记录 显示了指示健康血管流量的典型大鼠脉动流和速度峰值为30cm/s的典型大鼠主动脉流量 读数。外植体图片显示了没有腔阻塞、凝块和堵塞物，并且显示移植物在2mm直径的植入尺 寸范围内，这指示没有扩张。
[0034] 图16是一组图像，显示了在犬颈动脉中端-对-侧植入的脱细胞TEVG在植入4 周后的横截切片。上组显示了对照组的实施例，在对照组中植入的移植物是没有进一步改 性的脱细胞TEVG。下组显示了透明质酸涂覆的脱细胞TEVG的实施例。所有切片用苏木精 和伊红（H&E)染色。在涂覆的移植物中看到了没有血凝块和阻塞，并且在透明质酸-肝素 涂覆的移植物上也可看到内皮细胞的沉积。
【具体实施方式】
[0035] 本发明涉及抗血栓形成涂层组合物，制备这种组合物的方法，和使用这种组合物 的方法。例如，在某些实施方式中，本发明提供了涂覆有抗血栓形成涂层的血管移植物。本 发明基于下面的发现：将脱细胞血管的腔面涂覆以透明质酸（HA)层或HA和肝素或其它分 子的多层涂层阻止血管中的血栓形成。因此，在一个实施方式中，本发明提供了抗血栓形成 血管移植物组合物，所述组合物包括脱细胞血管，其中所述血管的腔面涂覆以HA层。在另 一实施方式中，本发明提供了抗血栓形成血管移植物组合物，所述组合物包括脱细胞血管， 其中所述血管的腔面涂覆以多层涂层，其中至少一层包含HA并且至少一个其它层包含肝 素。在一个实施方式中，HA层与血管的腔面交联。在一个实施方式中，肝素层与HA层交联。 在某些实施方式中，涂层中的一层或多层包含水凝胶。在其它的实施方式中，HA层与其它 血液接触表面结合，诸如在血管移植物或导管中包含的塑料、或引导血液的天然脉管系统。
[0036] 本发明进一步提供了治疗方法，所述治疗方法包括将本发明的抗血栓形成组合物 植入到受体中。例如，在一个实施方式中，该方法包括将HA-涂覆的或HA-肝素-涂覆的血 管移植物植入至需要所述治疗方法的受试者中。涂覆的血管移植物可以用于，例如，治疗具 有患病的或阻塞的血管的受试者。在某些实施方式中，涂覆的血管移植物用于治疗动脉瘤 的方法。在另一实施方式中，涂覆的血管移植物用于绕过患病的或阻塞的血管的方法。在 另一实施方式中，涂覆的血管移植物用于在经历或预期要经历血液透析的受试者中提供血 管通路的方法。
[0037] 定义
[0038]除非另外定义，本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域中的普 通技术人员所普遍理解的含义相同的含义。尽管与本文所述的那些相似或等效的任何方法 和材料可以用于实施或测试本发明，但描述了优选的方法和材料。
[0039] 如本文所使用，下面术语中的每一个具有在此部分中与其相关联的含义。
[0040] 冠词"一个（a)"和"一种（an)"在本文中用来指一个或多于一个（即，指至少一 个）该冠词的语法对象。举例而言，"一个要素"意指一个要素或多于一个要素。
[0041] 如本文所使用，当术语"异常的"用于生物体、组织、细胞或其组分的语境中时，是 指与表现出"正常的"（预期的）各自特征的那些生物体、组织、细胞或其组分在至少一个可 观察到的或可检测到的特征（例如，年龄、治疗或每天的时间）方面不同的那些生物体、组 织、细胞或其组分。对于一种细胞或组织类型来说是正常的或预期的特征对于不同的细胞 或组织类型可能是异常的。
[0042] 如本文所使用，当"约"指可测量到的值诸如量、时间持续时间等时，意在涵盖与指 定值的±20%或±10%，更优选±5%，甚至更优选±1%，且还更优选±0. 1%的变化，因 为这些变化适合于实施公开的方法。
[0043] 如本文所使用，"减轻"疾病、缺陷、病症或病况意指降低所述疾病、缺陷、病症或病 况的一种或多种症状的严重性。
[0044] 如本文所使用，"抗凝剂"指阻止血液凝结或凝固的药剂或一类药剂。
[0045] 如本文所使用，"抗血栓形成涂层"指减少血栓或血凝块形成的涂层。
[0046] 如本文所使用，"自体的"指来源于将在以后再引入其中的相同个体的生物学材 料。
[0047] 如本文所使用，"同种异体的"指来源于与所述材料将引入其中的个体相同的物种 的基因上不同的个体的生物学材料。
[0048] 如本文所使用，"生物相容的"指当在哺乳动物中植入时不会引起所述哺乳动物中 的不良反应的任何材料。当被引入至个体中时，生物相容材料对该个体是无毒的或无害的， 其也不在哺乳动物中诱发对所述材料的免疫排斥。
[0049] 如本文所使用，术语"生物相容聚合物"和"生物相容性"当与聚合物