再现的结果，本发明还涵盖在能确保确立测试规程的专业 化实验室中测试患者样品。
[0150] VEGF12JP VEGF ii。蛋白质可使用本领域已知的任何方法来检测。例如，可以使 用Western、ELISA、等对来自哺乳动物的组织或细胞样品方便地测定例如蛋白质。可得 到多份参考文献来提供应用上述技术的指导（Kohler等，Hybridoma Techniques(Cold Spring Harbor Laboratory, New York，1980) ;Tijssen， Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevier, Amsterdam,1985) !Campbell，Monoclonal Antibody Technology(Elsevier, Amsterdam, 1984) ;HurrelI，Monoclonal Hybridoma Antibodies ： Techniques and Applications(CRC Press， Boca Raton， FL，1982);及 Zola， Monoclonal Antibodies ：A Manual of Techniques，pp.147-158(CRC Press， Inc. ，1987))〇
[0151] 如果提及VEGF121和VEGF n。的检测或水平的话，这表示测量这两种分子的和，例如 使用检测VEGF121和VEGF n。二者的测定法。检测VEGF 121和VEGF n。这两种分子的测定法包 括例如对相应其它形式（即在VEGF11。得到更好识别的情况中对VEGF 121，或在VEGF121得到更 好识别的情况中对VEGF110)具有至少25%灵敏度的测定法。在某些实施方案中，测定法对 相应其它形式具有至少50%、75%、80%、85%、90%或以上的灵敏度。在一个实施方案中， 以本质上相同的灵敏度测量VEGF 121和VEGF n。二者。
[0152] 至于VEGF121和VEGF n。蛋白质的检测，可得到多种测定法。例如，可以将样品与同 更长天然存在VEGF-A同等型VEGF 165和VEGF 189相比优先或特异性结合短VEGF-A同等型 VEGF12JP VEGF11。的抗体或抗体组合（例如在夹心式测定法中）接触。优选地，以与更长同 等型相比要高至少3倍的灵敏度检测短同等型。如果使用短同等型（根据SDS-PAGE纯度 至少90%和根据0D280nm测定的浓度）建立标准曲线且对于长同等型，在预先确定的浓度 (根据SDS-PAGE纯度至少90%和根据OD 280nm测定的浓度）使用相同的试剂和相同的 标准曲线，标准曲线的值读数只有预期浓度的三分之一或更小，那么承认灵敏度要高至少3 倍。还优选对短同等型的灵敏度与长同等型相比，尤其是与VEGF 165相比要高至少4倍、5倍、 6倍、7倍、8倍或9倍。
[0153] 在一个实施方案中，特异性检测短同等型VEGF12JP VEGF11。二者。此类特异性检 测是可能的，例如，如果使用和采用分别结合通过连接VEGF121中外显子4和8生成的序列 或VEGF 11。的游离C端的抗体，尤其是单克隆抗体的话。此类VEGF n。抗C端抗体不结合包 含氨基酸110作为更长多肽链一部分的任何VEGF-A同等型或例如在氨基酸109处结束的 更短VEGF-A片段。结合通过连接VEGF 121中外显子4和8生成的序列的单克隆抗体不会结 合更长VEGF同等型165和189中包含的氨基酸序列，因为其中因连接外显子4和外显子7 及外显子4和外显子5而存在其它氨基酸序列（参见Ferrara，N.，Mol.Biol.of the Cell 21 (2010) 687-690)。如果所使用的抗体对更短片段展现小于10%的交叉反应性及对那些不 具有游离C端氨基酸110的VEGF-A同等型（在抗VEGF11。抗体的情况中）或那些不包含通 过连接外显子4和8生成的序列的同等型（在抗VEGF121抗体的情况中）展现小于10%的 交叉反应性，那么承认上述意义的特异性结合。还优选对于更短片段和不具有游离C端氨 基酸110的或不具有通过连接外显子4和8生成的序列的VEGF同等型二者，交叉反应性会 小于 5%、4%、3%、2%和 1%。
[0154] 只结合短VEGF同等型VEGF121或VEGF n。的适宜特异性抗体可依照标准规程来获 得。通常，会合成呈现或包含VEGF11。最C端至少4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸的肽或呈 现或包含VEGF 121氨基酸115C端和N端至少5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸的肽，任选与载 体偶联，并用于免疫接种。特异性多克隆抗体可通过适宜免疫吸附步骤来获得。可以容易 地对单克隆抗体筛选与VEGF 121或VEGF n。的反应性及适宜的低交叉反应性。在VEGF n。特异 性抗体方面的低交叉反应性可以对VEGF11。的更短片段（例如缺失VEGF n。的C端氨基酸） 和不具有VEGF11。游离C端氨基酸的VEGF-A同等型二者来评估。在VEGF 121特异性抗体方面 的低交叉反应性可以使用含有连接外显子4和外显子7及连接外显子4和外显子5时形成 的氨基酸序列的VEGF-同等型来评估。
[0155] VEGF111蛋白质或核酸可使用本领域已知的任何方法来检测。例如，可以对来自哺 乳动物的组织或细胞样品方便地测定例如蛋白质（使用Western、ELISA)、来自感兴趣遗 传生物标志物的mRNA或DNA (使用Northern、点印迹、或聚合酶链式反应（PCR)分析、阵列 杂交、RNA酶保护测定法、或使用DNA SNP芯片微阵列，它们是商品化的，包括DNA微阵列 快照）。例如，实时PCR(RT-PCR)测定法诸如定量PCR测定法是本领域公知的。在本发明 的一个示例性实施方案中，一种用于检测生物学样品中来自感兴趣遗传生物标志物的mRNA 的方法包括使用至少一种引物通过逆转录自样品生成cDNA ;扩增如此生成的cDNA ;并检测 扩增cDNA的存在。另外，此类方法可包括一个或多个容许测定生物学样品中mRNA水平的 步骤（例如通过同时检查"持家"基因诸如肌动蛋白家族成员的比较性对照mRNA序列的水 平）。任选地，可测定扩增cDNA的序列。
[0156] 可得到多份参考文献来提供应用上述技术的指导（Kohler等，Hybridoma Techniques(Cold Spring Harbor Laboratory, New York,1980) ;Tijssen， Practice and Theory of Enzyme Immunoassays(Elsevier, Amsterdam,1985) !Campbell， Monoclonal Antibody Technology(Elsevier, Amsterdam,1984) ;Hurrell， Monoclonal Hybridoma Antibodies techniques and Applications(CRC Press，Boca Raton，FL，1982);及 Zola， Monoclonal Antibodies ：A Manual of Techniques，pp.147-158(CRC Press，Inc. ，1987)〇
[0157] 至于VEGF111蛋白质的检测，可得到多种测定法。例如，可以将样品与同更长天然存 在VEGF-A同等型VEGF 165和VEGF 189相比优先或特异性结合VEGF m的抗体或抗体组合（例 如在夹心式测定法中）接触。优选地，以与更长同等型相比要高至少3倍的灵敏度检测短 同等型VEGF 111。如果使用短同等型（根据SDS-PAGE纯度至少90%和根据OD 280nm测定 的浓度）建立标准曲线且对于长同等型，在预先确定的浓度（根据SDS-PAGE纯度至少90% 和根据OD 280nm测定的浓度）使用相同的试剂和相同的标准曲线，标准曲线的值读数只有 预期浓度的三分之一或更小，那么承认灵敏度要高至少3倍。还优选对短同等型的灵敏度 与长同等型相比要高至少4倍、5倍、6倍、7倍、8倍或9倍。
[0158] 在一个实施方案中，特异性检测同等型VEGF111。此类特异性检测是可能的，例如， 如果使用和采用结合VEGF111独特的外显子连接的抗体，尤其是单克隆抗体的话。此类抗体 不结合不包含这种特定外显子连接的其它VEGF-A同等型或其切割产物。如果所使用的抗 体对不具有这种独特外显子连接的其它VEGF-A同等型，像VEGF 121S VEGF 165展现小于10% 的交叉反应性，那么承认上述意义的特异性结合。还优选对于例如VEGF121，交叉反应性会小 于 5%、4%、3%、2%和1%。
[0159] 在一个实施方案中，对VEGF111的特异性通过使用相同试剂比较VEGF m (根据 SDS-PAGE纯度至少90 %和根据OD 280nm测定的浓度）和VEGF121 (根据SDS-PAGE纯度至 少90%和根据OD 280nm测定的浓度）来评估。如果在这项比较中对VEGF121材料获得的信 号只有用VEGF111材料获得的信号的十分之一或更小，那么针对VEGF 121的交叉反应性小于 10 %。正如技术人员会领会的，优选在产生VEGF111最大信号约50 %的浓度处读取VEGF 121 信号。
[0160] 只结合短VEGF同等型VEGF111的适宜特异性抗体可依照标准规程来获得。通常，会 合成呈现或包含VEGF 111氨基酸105C端和N端氨基酸的肽，任选与载体偶联，并用于免疫接 种。优选地，此类肽会是长至少六个氨基酸且至少包含VEGF 111氨基酸105和106。还优选它 会至少包含VEGF111氨基酸104、105、106和107。正如技术人员会领会的，包含例如VEGF m 氨基酸105和106之间外显子连接N和C端3或更多个氨基酸的更长肽也可用于获得特异 性结合VEGF111的抗体。
[0161] 未修饰VEGF蛋白质可使用本领域已知的任何适宜方法来检测。优选地，会使用至 少具有与经修饰VEGF相比，对未修饰VEGF的优先结合特性的抗体，如MAB 3C5,它可购自 RELIATech GmbH，WolfenbUttel，Germany。例如，可以使用 Western、ELISA、等对来自哺乳 动物的组织或细胞样品方便地测定未修饰VEGF蛋白质。可得到多份参考文献来提供应用 上述技术的指导（Kohler 等，Hybridoma Techniques (Cold Spring Harbor Laboratory, New York，1980) ;Tijssen， Practice and Theory of Enzyme Immunoassays(Elsevier, Amsterdam，1985) !Campbell，Monoclonal Antibody Technology (Elsevier, Amsterdam, 1984) ；HurrelI,Monoclonal Hybridoma Antibodies techniques and Applications(CRC Press， Boca Raton， FL，1982); 及 Zola， Monoclonal Antibodies ：A Manual of Techniques，pp.147-158(CRC Press， Inc. ，1987))。
[0162] 如果提及未修饰VEGF的检测或水平，这表示测量未修饰VEGF分子（同等型或切 割产物），如例如MB 3C5结合的。
[0163] 至于未修饰VEGF蛋白质的检测，可得到多种测定法。例如，可以将样品与同经修 饰VEGF(例如如患者的样品中天然存在的）相比优先或特异性结合未修饰VEGF的抗体或 抗体组合（例如在夹心式测定法中）接触。优选地，使用特异性结合未修饰VEGF的抗体， 即用对未修饰VEGF 165的灵敏度与经修饰VEGF165相比要高至少3倍抗体来检测未修饰VEGF。 此类对未修饰VEGF高至少3倍的灵敏度通过使用相同试剂比较在大肠杆菌中重组生成的 VEGF165 (根据SDS-PAGE纯度至少90 %和根据OD 280nm测定的浓度）和在HEK细胞中重组 生成的VEGF165 (根据SDS-PAGE纯度至少90 %和根据0D280nm测定的浓度）来评估。如果 在这项比较中对HEK生成的材料获得信号只有用大肠杆菌衍生的材料获得的信号的十分 之一或更小，那么以高至少3倍的灵敏度检测未修饰VEGF。正如技术人员会领会的，优选 在最大信号约50%处读取信号。优选地，在这项评估中，使用实施例5的测定法。还优选 特异性结合未修饰VEGF (来自大肠杆菌的VEGF165)的抗体是与经修饰VEGF材料（来自HEK 细胞的VEGF165)相比以高至少4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍的灵敏度检测未修饰 VEGF的抗体。
[0164] 在一个实施方案中，使用至少具有与经修饰VEGF相比，对未修饰VEGF的相同结合 偏好的抗体，如商品化MB 3C5来特异性检测未修饰的VEGF。在一个实施方案中，在夹心 式免疫测定法中评估抗体对未修饰VEGF的相对灵敏度或优先结合，其中使用针对未修饰 VEGF的抗体作为捕捉抗体并使用结合在所有主要VEGF-同等型或切割产物上存在的表位 的检测抗体。在一个实施方案中，检测抗体会结合在MB 3C5的表位以外的表位，即它不会 结合跨越VEGF氨基酸33至43的合成肽中包含的表位。优选地，检测抗体会结合范围1至 32、44至105的氨基酸中包含的表位、成熟VEGF165的最后六个氨基酸、或与MAB 3C5结合的 表位不交叠的构象表位。在一个实施方案中，与经修饰VEGF相比特异性结合未修饰VEGF165 的抗体具有结合跨越VEGF氨基酸33至43的合成肽中包含的表位的特性。
[0165] 特异性结合未修饰VEGF的适宜特异性抗体可依照标准规程来获得。通常，会使用 在大肠杆菌中重组生成的或合成（例如通过固相多肽合成）获得的VEGF同等型或呈现或 包含在大肠杆菌中重组生成的或合成（例如通过固相多肽合成）获得的VEGF的表位的肽 作为免疫原。单克隆抗体可依照标准规程容易地生成，并筛选与未修饰VEGF的反应性及与 经修饰VEGF的适宜低交叉反应性。一种方便且优选的筛选方法基于使用在大肠杆菌中重 组生成的VEGF 165 (根据SDS-PAGE纯度至少90 %和根据OD 280nm测定的浓度）和在HEK细 胞中重组生成的VEGF165 (根据SDS-PAGE纯度至少90 %和根据0D280nm测定的浓度）。
[0166] 可以评估作为生物学样品的患者样品中VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的 表达水平。患者样品可以是血液样品、血清样品或血浆样品。在一个实施方案中，样品是 EDTA-血浆。在一个实施方案中，样品是柠檬酸盐-血浆。获得血液样品、血清样品和血浆 样品的方法是本领域公知的。患者样品可以在新辅助疗法之前或之后或在辅助疗法之前或 之后得自患者。
[0167] 在本发明的语境中，贝伐单抗要添加至作为本领域已知的标准化疗方案的一部 分施用的一种或多种化疗剂或与作为本领域已知的标准化疗方案的一部分施用的一种 或多种化疗剂一起作为共同疗法或共同治疗施用。此类标准化疗方案中包括的药剂的 例子包括5-氟尿啼啶、亚叶酸、伊利替康（irinotecan)、吉西他滨、厄洛替尼、卡培他滨 (capecitabine)、紫杉烧（taxane)诸如多西他赛（docetaxel)和帕利他赛（paclitaxel)、 干扰素阿尔法、长春瑞滨（vinorelbine)、和基于钼的化疗剂诸如卡钼（carboplatin)、顺 钼（cisplatin)和奥沙利钼（oxaliplatin)。如所附示例性实施例中证明的，添加贝伐单抗 实现了依照VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的表达水平定义和选择的患者和/或患者 群体中无进展存活的延长。如此，贝伐单抗可以与化疗方案，诸如多西他赛疗法组合，如所 附示例性实施例中证明的。
[0168] 常用施用模式包括胃肠外施用如推注或如设定时间段里的输注，例如在10分钟、 20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、60分钟、75分钟、90分钟、105分钟、120分钟、3小时、4小 时、5小时或6小时里施用总的日剂量。例如，可以根据所治疗的癌症的类型每周、每2周或 每3周施用2. 5mg/kg体重至15mg/kg体重贝伐单抗（Avastin? )。剂量的例子包括每周、 每2周或每3周给予2. 5mg/kg体重、5mg/kg体重、7. 5mg/kg体重、10mg/kg体重和15mg/kg 体重。剂量的其它例子是5mg/kg体重每2周、每2周lOmg/kg体重、每3周7. 5mg/kg体重 和每3周15mg/kg体重。在本文所述发明的语境中，低剂量贝伐单抗包括例如每周2. 5mg/ kg体重、每2周5mg/kg体重和每3周7. 5mg/kg体重的剂量。在本文所述发明的语境中，高 剂量贝伐单抗包括例如每周5mg/kg体重、每2周10mg/kg体重和每3周15mg/kg体重的剂 量。对于治疗乳腺癌，特别是局部晚期、复发性或转移性HER-2阴性乳腺癌，剂量包括低剂 量贝伐单抗，特别是每3周7. 5mg/kg和高剂量贝伐单抗，特别是每3周给予一次15mg/kg 体重。技术人员会认识到，本发明涵盖由具体患者和化疗方案确定的贝伐单抗的其它施用 模式，而且具体施用模式和治疗剂量由主治医师依照本领域已知的方法最佳确定的。
[0169] 依照本发明的方法选择的患者用与化疗方案组合的贝伐单抗来治疗，而且可以进 一步用一种或多种别的抗癌疗法来治疗。在某些方面，该一种或多种别的抗癌疗法为放射。
[0170] 本发明还涉及一种诊断组合物或试剂盒，其包含适合于测定VEGFA、VEGFR2和 PLGF中一项或多项的表达水平的寡核苷酸或多肽。如本文中详述的，寡核苷酸（诸如DNA、 RNA或DNA和RNA的混合物）探针可用于检测标志物/指示物蛋白质的mRNA水平，而多肽 可用于经特异性蛋白质-蛋白质相互作用间接检测标志物/指示物蛋白质的蛋白质水平。 在本发明的优选方面，作为用于VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的表达水平的探针涵 盖的且本文中描述的试剂盒或诊断组合物中包括的多肽是对这些蛋白质特异性的或对其 同源物和/或截短物特异性的抗体。
[0171] 因而，在本发明的又一个实施方案中，提供一种对于进行本文中描述的方法有用 的试剂盒，其包含能够测定VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的表达水平的寡核苷酸或 多肽。寡核苷酸可包含对编码一种或多种本文中描述的标志物/指示物的mRNA特异性的 引物和/或探针，而多肽包含能够与标志物/指示物蛋白质特异性相互作用的蛋白质，例如 标志物/指示物特异性抗体或抗体片段。
[0172] 因而，本发明涉及供患有乳腺癌的患者的改良化疗方案中使用的贝伐单抗，其中 测定患者样品中VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的表达水平，并由此对VEGFA VEGFR2 和PLGF中一项或多项的水平相对于在诊断有乳腺癌的患者中测定的对照水平升高的患者 施用添加至化疗方案的贝伐单抗。
[0173] 加以必要的变更后可以应用下述类似用途。
[0174] 本发明涉及贝伐单抗用于改进患有乳腺癌的患者的化疗方案的治疗效果的用途， 包括下述步骤：
[0175] (a)测定患者样品中VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的表达水平；
[0176] 并
[0177] (b)对VEGFA VEGFR2和PLGF中一项或多项的水平相对于在诊断有乳腺癌的患者 中测定的对照水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗。
[0178] 该乳腺癌可以是局部晚期、复发性或转移性HER-2阴性乳腺癌。该化疗方案可以 包括紫杉烧疗法，诸如多西他赛或帕利他赛疗法。
[0179] 因而，本发明涉及贝伐单抗用于改进患有乳腺癌的患者的化疗方案的治疗效果的 用途，包括下述步骤：
[0180] (a)自所述患者获得样品；
[0181] (b)测定VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的表达水平；并
[0182] (c)对VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的水平相对于在诊断有乳腺癌的患者 中测定的对照水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗。
[0183] 该乳腺癌可以是局部晚期、复发性或转移性HER-2阴性乳腺癌。该化疗方案可以 包括紫杉烧疗法，诸如多西他赛或帕利他赛疗法。
[0184] 本发明涉及贝伐单抗用于改进患有乳腺癌的患者的无进展存活的用途，包括下述 步骤：
[0185] (a)测定患者样品中VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的表达水平；
[0186] 并
[0187] (b)对VEGFA VEGFR2和PLGF中一项或多项的水平相对于在诊断有乳腺癌的患者 中测定的对照水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗。
[0188] 该乳腺癌可以是局部晚期、复发性或转移性HER-2阴性乳腺癌。该化疗方案可以 包括紫杉烧疗法，诸如多西他赛或帕利他赛疗法。
[0189] 因而，本发明涉及贝伐单抗用于改进患有乳腺癌的患者的无进展存活的用途，包 括下述步骤：
[0190] (a)自所述患者获得样品；
[0191] (b)测定VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的表达水平；并
[0192] (c)对VEGFA、VEGFR2和PLGF中一项或多项的水平相对于在诊断有乳腺癌的患者 中测定的对照水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗。
[0193] 该乳腺癌可以是局部晚期、复发性或转移性HER-2阴性乳腺癌。该化疗方案可以 包括紫杉烧疗法，诸如多西他赛或帕利他赛疗法。
[0194] 本发明提供贝伐单抗用于改进患有乳腺癌的患者的无进展存活的用途，包括下述 步骤：
[0195] (a)测定患者样品中VEGFA或VEGFR2的表达水平；并
[0196] (b)对VEGFA或VEGFR2的组合表达水平相对于在诊断有乳腺癌的患者中测定的对 照组合表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗。
[0197] 该乳腺癌可以是局部晚期、复发性或转移性HER-2阴性乳腺癌。该化疗方案可以 包含紫杉烷疗法，诸如多西他赛或帕利他赛疗法。施用的贝伐单抗剂量可以是低或高剂量 贝伐单抗。
[0198] 本发明涉及贝伐单抗用于改进患有乳腺癌的患者的无进展存活的用途，包括下述 步骤：
[0199] (a)自所述患者获得样品；
[0200] (b)测定VEGFA或VEGFR2的表达水平；并
[0201] (c)对VEGFA或VEGFR2的组合表达水平相对于在诊断有乳腺癌的患者中测定的对 照组合表达水平升高的患者施用与化疗方案组合的贝伐单抗