次洗涤离心后，将沉淀物冷冻干燥，得到微球佐剂;其中，所述Na2S04溶液 与所述混合溶液的体积比为1:100~120。
[0037]二、上述预防用H9N2型流感病毒样颗粒疫苗的制备方法：
[0038]1、参考病毒株:GenBank:AF400779.1，H9N2型流感病毒HA、NA基因、Ml基因的合成： [0039]所述HA蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，编码所述HA蛋白的核苷酸序列如 SEQIDN0.2所示；所述NA蛋白的氨基酸序列如SEQIDN0.3所示，编码所述NA蛋白的核苷 酸序列如SEQIDN0.4所示；所述Ml蛋白的氨基酸序列如SEQIDN0.5所示，编码所述Ml蛋 白的核苷酸序列如SEQIDN0.6所示。
[0040] 根据以上基因序列，送由上海宝生物公司合成HA、NA和Ml基因。
[0041]根据上述各基因的核苷酸序列，设计相应的引物，各基因引物如下：
[0048] RT-PCR体系（25.0yL) :RNA模板（禽流感病毒H9N2型西南毒株RNA)15.0yL，5xM-MLVRTase反应缓冲液5.(^1^，(1犯1^(10_〇1/1)241^，下游引物1?(25口111〇1/^〇2.(^1^，8祖酶抑 制剂(40u/yL)0 · 5yL，M-MLVRTase(200U/yL)0 · 5yL;反应程序:42°Clh;95°C5min，反应结束 获得cDNA。
[0049] PCR体系（25.0yL):上述得到的cDNA 5.0yL，10x Ex Taq Buffer 2.5yL，MgCl2 (2·5mmo 1/L)2·OyL，dNTPs(2·5mmo 1/L)2·OyL，上、下游引物（25pmo 1/VL)各0·5yL，Ex Taq酶 (5U/yL)0.3yL，ddH20 12.2yL。反应程序：95°C预变性5min;95°C 50s，56°C 50s，72°C60s， 进行35个循环;最后72%延伸10min。
[0050] 2、构建表达Ml基因的昆虫杆状病毒表达质粒：
[0051] 用限制性内切酶BamHI/Notl对昆虫杆状病毒表达载体pFastBac-DuaL(Invitrogen公司）和公司合成的Ml基因进行酶切，于37°C过夜消化水解后，用凝胶电泳和 过柱抽提纯化。在T4DNA连接酶的作用下，酶切后的质粒与酶切后的Ml基因DNA片段于16°C 连接过夜，连接反应体系如下：10XT4连接缓冲液lyL，Ml酶切回收的DNA片段3yL，酶切 pFastBac-DuaL质粒回收产物lyL，T4DNA连接酶lyL，ddH20 补至 10yL。
[0052]将得到的连接产物转化入感受态细胞中，具体操作步骤如下：将50yLDH5a感受 态细胞移入到离心管中，加入5yL上述得到的连接反应液，混匀后将离心管置于冰上30min， 随后转入42°C水浴中热休克45s，迅速放回冰上，2min后加入950yLLB培养液，于37°C摇床 培养1小时。培养结束后取l〇〇yL培养菌液涂布于LB固体培养基(含有100ug/mL氨卞西林） 上，37°C培养16小时，从平板上挑取阳性克隆菌落，用特异性引物（1134:5'_ GTTTTCCCAGTCACGAC-3' ；M13-R:5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3'）进行PCR筛选，挑取筛选的阳性 单克隆菌落接种于2mLLB培养液(含100ug/mL氨卞西林）中，37°C250r/min振摇培养16小 时。培养液离心收集菌体，抽提质粒。经DNA序列测定后，获得重组质粒pFastBac-DuaL-ΜΙ。 [0053] 3、构建表达HA和Ml基因的重组质粒：
[0054] 用限制性内切酶Smal/Nhe頂每切上述获得的重组质粒pFastBac-DuaL-ΜΙ和HA基 因，酶切后的pFastBac-DuaL-Ml质粒和HA基因在T4DNA连接酶的作用下进行连接，于16°C连 接过夜，连接反应体系如下：10XT4连接缓冲液lyL，HA酶切回收的DNA片段3yL，酶切重组质 粒pFastBac-DuaL-MllyL，T4DNA连接酶lyL，ddH20 补至 10yL。
[0055]将上述连接后的连接产物转化入E.coLiDH5a感受态细胞中，转化的实验步骤同 2,培养、抽提数个阳性克隆菌落的重组质粒DNA，序列测序确定无误后，获得重组质粒 pFastBac-DuaL-HA-Ml〇
[0056] 4、构建表达HA、NA和Ml基因的重组质粒：
[0057]用限制性内切酶Smal/Nhe頂每切上述获得的重组质粒pFastBac-DuaL-HA-Ml和NA基因，酶切后的PFastBac-DuaL-HA-Ml和NA基因在T4DNA连接酶的作用下进行连接，于16°C 连接过夜，连接反应体系如下：10XT4连接缓冲液1yL，HA酶切回收的DNA片段3yL，酶切重组 质粒pFastBac-DuaL-MllyL，T4DNA连接酶lyL，ddH20 补至 10yL。
[0058]将上述连接后的连接产物转化入E.coLiDH5a感受态细胞中，转化的实验步骤同 2,培养、抽提数个阳性克隆菌落的重组质粒DNA，序列测序确定无误后，获得重组质粒 pFastBac-DuaL-HA-NA-Ml〇
[0059] 5、重组昆虫杆状病毒基因组的合成：
[0060] 将步骤4到的重组质粒pFastBac-DuaL-HA-NA-Ml转导入E.coLi感受态细胞株 DHlOBac细胞中（该细胞中含有一特殊的大分子质粒BacyLoviruspLasmid，该质粒内包含 有昆虫杆状病毒AcMNPV的全部基因组）（北京天恩泽科技有限公司），转导方法同步骤2转入 感受态细胞的步骤，挑取阳性克隆菌株，得rBacmid-HA-NA-Ml/DH10Bac菌株。
[0061] 蓝白筛选:取经过灭菌且已经添加了四环素(浓度lOyg/mL)、庆大霉素(浓度7yg/ mL)、卡那霉素(浓度50yg/mL)的LB平板，在无菌条件下将40yL0.2mg/mL的IPTG(异丙基-β-D_半乳糖)加入40yLX-gaL(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖）中混合均匀，并将混合液涂布 于上述含有抗生素的平板上，将平板转移至37°C恒温箱中放置2.5h，使色素底物X-gaL被培 养基完全吸收。将上述得到的rBacmid-HA-NA-Ml/DHIOBac菌株在无菌条件下将菌液涂布于 蓝白斑平板上，将平板正面向上放置30分钟，已确认菌液完全被平板吸收后将平板倒置，将 平板转移至37°C恒温箱中培养48h，观察平板，白色菌落即为所需菌株，将菌落挑取适量于 LB培养液中，-20°C无菌保存待用。
[0062] 6、提取质粒：
[0063](1)在无菌条件下，将lmL步骤5的LB培养菌液用移液器移入1.5mLEP管中，将离心 机调节至12000r/min，离心lmin，弃尽上清；
[0064](2)在（1)中的EP管中加入250yLBufferS1溶液，祸旋振荡器重悬细菌沉淀；
[0065](3)将经过(2)操作的EP管中加入250yLBufferS2溶液，迅速轻轻反复颠倒混匀 数次，室温下操作不超过5min;
[0066] (4)将300yLBufferS3加入(3)中的EP管中，轻轻颠倒混匀数次，冰上静置10min， 12000r/min离心10min;(Sl和S2、S3来自PlasmidMiniKitI试剂盒，购自天根生化科技有 限公司）
[0067](5)用移液器将上清转移至另一无菌的EP管中，加入与上清液等体积的酚氯仿(苯 酸和氯仿用前等体积混匀），轻轻颠倒混匀数次，12000r/min离心1Omin;
[0068](6)吸取上清至另一无菌的EP管中，加入等体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀，冰上静 置 15min，12000r/min离心 15min;
[0069] (7)上清完全除去后，加入500yL质量浓度为70%的无水乙醇，反复颠倒洗涤沉淀， 12000r/min离心 5min;
[0070] (8)重复上一个步骤，洗涤沉淀；
[0071] (9)除去无水乙醇，放置在无菌操作台内干燥8min，将杆粒溶于40yLTE(pH8.0) 中，-20°C保存备用。
[0072] 7、PCR鉴定：
[0073]对抽提的质粒rBacmid-HA-NA-Ml进行PCR鉴定，其中各引物序列如下：
[0080] PCR反应体系：
[0083]混匀后稍离心，置于PCR仪中。
[0084]反应程序:95°C预变性5min;95°C50s，53°C(HA基因）或56°C(NA基因）/60°C(Ml基 因）50s，72°C60s，进行35个循环；最后72 %延伸lOminAT-PCR产物以1.0 %琼脂糖凝胶电 泳，置凝胶成像系统中观察结果（图1和图2)或4°C保存。由图1和图2可以看出在1683bp、 1401bp、764bp位置处均有明显条带，与预期的HA基因、ΝΑ基因、Ml基因大小一致，与初期设 置的结果一致。
[0085] 8、接种转染：
[0086]SF9细胞株:从西南大学家蚕基因组生物学国家重点实验室引进，重庆理工大学药 学与生物工程学院生物制药实验室保存。取SF9细胞经复苏、贴壁细胞培养、悬浮培养、细胞 传代后，得到生长状态好的SF9细胞，将抽提的质粒rBacmid-HA-NA-Ml转染SF9细胞，在27°C 下进行培养，待细胞明显出现病变时，收集细胞培养上清液，获得第一代(P1)重组病毒;将 P1代重组病毒以1:10的稀释倍数接种SF9细胞，同P1代的制备，收集细胞培养上清液，获得 P2代重组病毒;采用相同的方法，将P2代重组病毒接种SF9细胞，收集细胞培养上清液，获得 P3代重组病毒。其中，所述复苏、贴壁细胞培养、悬浮培养、细胞传代和转染步骤为通用生物 学方法，详见分子生物学实验手册。
[0087] 9、重组蛋白的表达：
[0088] 将P3代重组病毒以1:10的稀释倍数接种