一种预防用h9n2型流感病毒样颗粒疫苗及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种预防用H9N2型流感病毒样颗粒疫苗 及其制备方法。
【背景技术】
[0002] H9N2型流感病毒即甲型流感病毒的禽流感病毒一种亚型，它最早于20世纪末期被 发现存在于火鸡之上。实验表明H9N2亚型流感病毒对鸡具有较强的致病性，引起鸡的免疫 力下降，继发感染引起鸡的大批死亡，引起蛋鸡的产蛋下降，造成严重的经济损失，只具对 人的致病性弱，另一方面这种病毒的传播很强，已经有了较为广泛的传播。H9N2型流感病毒 不仅能让机体发生免疫抑制，还可以让各种继发性的感染发生在宿主身上。据报道某地发 现猪已经被这种病毒所感染。研究表明，这种病毒完全可以传染到低等的哺乳动物，人也可 以被这种病毒所感染。
[0003] 由于H9N2型流感病毒的潜在危害能力较为巨大，于是世界上越来越多的人对它进 行了关注，越来越多的机构对它进行了研究，研究证明了其确实可以感染人类。研究还发现 病毒很有可能在人体里与其它的流感病毒亚型进行基因重组，然后形成新的病毒亚型，危 害人类。
[0004] 目前的传统疫苗主要用于鸡的感染，而现有的传统疫苗用分离的具有感染性的流 感病毒通过鸡胚复制病毒制备，需要加灭活剂甲醛和油乳佐剂，对人类的食用存在不安全 的因素，并且生产成本高，生产工艺复杂。同时由于它对人类存在的潜在危害，及在体内为 其他病毒提供基因组基因而基因重组形成新亚型流感，危害人类安全，故为了人类的安全， 动物禽流感的防控，防止H9N2型流感病毒的大规模、无节制的传播，研制H9N2型流感病毒的 新型疫苗(VLP疫苗)很有必要且具有十分重要的经济意义和社会意义。
【发明内容】
[0005] 基于现有技术存在的上述不足，本发明所要解决的技术问题是：如何提供一种预 防用H9N2型流感病毒样颗粒疫苗及其制备方法，弥补现在尚没有H9N2型流感病毒样颗粒疫 苗的空白，以防止H9N2型流感病毒在动物之间传播及向人类传播，防止H9N2型流感病毒对 人类的潜在威胁，且具有安全性高、免疫原性强、稳定性好的特点。
[0006] 实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种预防用H9N2型流感病毒样颗粒疫 苗，其组分包括H9N2型流感病毒样颗粒;其中，所述H9N2型病毒样颗粒为H9N2型流感病毒的 病毒样空壳颗粒结构，所述空壳颗粒结构的囊膜表面含有H9N2型流感病毒的一种或者多种 的结构蛋白。
[0007] 所述结构蛋白为H9N2型流感病毒的血凝素HA蛋白、神经氨酸酶NA蛋白和/或基质 蛋白Ml;其中，所述HA蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，编码所述HA蛋白的核苷酸序 列如SEQIDN0.2所示;所述NA蛋白的氨基酸序列如SEQIDN0.3所示，编码所述NA蛋白的 核苷酸序列如SEQIDN0.4所示;所述Ml蛋白的氨基酸序列如SEQIDN0.5所示，编码所述 Ml蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示。
[0008]上述预防用H9N2型流感病毒样颗粒疫苗的制备方法，包括如下步骤：
[0009] 1)根据SEQIDN0.2、SEQIDN0.4和SEQID勵.6所示的核苷酸序列，合成骱、嫩 和Ml基因，并设计合成HA、ΝΑ和Ml基因的引物，供检测之用；其中，HA基因的上游引物序列如 SEQIDN0.7所示，HA基因的下游引物序列如SEQIDN0.8所示，NA基因的上游引物序列如 SEQIDN0.9所示，NA基因的下游引物序列如SEQIDN0.10所示，Ml基因的上游引物序列如 SEQIDN0.11所示，Ml基因的下游引物序列如SEQIDN0.12所示；
[0010] 2)用限制性内切酶BamHI和Notl对昆虫杆状病毒表达载体pFastBac-DuaL和合成 的Ml基因进行酶切并连接过夜后，转化入感受态细胞进行培养，抽提阳性克隆的重组质粒DNA，得到重组质粒pFastBac-DuaL-Ml;
[0011] 3)用限制性内切酶SmaI和Nhe頂每对步骤2)得到的重组质粒pFastBac-DuaL-Ml和 合成的HA基因进行酶切并连接过夜后，转化入感受态细胞进行培养，抽提阳性克隆的重组 质粒DNA，得到重组质粒pFastBac-DuaL-HA-Ml;
[0012] 4)用限制性内切酶Smal和Nhel酶对步骤3)得到的重组质粒pFastBac-DuaL-HA-Ml和合成的ΝΑ基因进行酶切并连接过夜后，转化入感受态细胞进行培养，抽提阳性克隆的重 组质粒DNA，得到重组质粒pFastBac-DuaL-HA-NA-Ml;
[0013] 5)将步骤4)得到的重组质粒pFastBac-DuaL-HA-NA-Ml转导入E.coLi感受态细胞 株DHlOBac细胞中，并经过蓝白筛选，挑取白色菌落，并提取质粒，得到质粒rBacmid-HA-NA-M1；
[0014] 6)将步骤5)得到的质粒rBacmid-HA-NA-Ml转染SF9昆虫细胞，得到重组杆状病毒；
[0015]7)将步骤6)得到的重组杆状病毒感染SF9昆虫细胞，培养后收集上清液，并对上清 液进行纯化，得到H9N2型流感病毒样颗粒；
[0016] 8)将佐剂溶于步骤7)得到的所述H9N2型流感病毒样颗粒中，于37°C下孵育3h后， 离心弃去上清液，对沉淀进行清洗，即得到所述预防用H9N2型流感病毒样颗粒疫苗。
[0017]相比现有技术，本发明具有如下优点：
[0018] 1、本发明H9N2型流感病毒样颗粒(Virus-Likeparticles，VLP)是一种不含核酸 空心颗粒病毒，所述VLP上含有H9N2型流感病毒的一种或多种结构蛋白，虽然VLP是病毒颗 粒，但并没有病毒的核酸物质，所以VLP不能够自主进行复制，也不具有所有病毒都具有的 感染性，是一种空壳结构，安全性高。
[0019] 2、本发明H9N2型流感病毒样颗粒在结构和形态上与完整的病毒非常的相似，表面 能够呈现出高密度重复行，可进行抗原表位的表达，从而可以刺激机体产生较为强烈的免 疫应答，免疫原性强，具有更广泛的抗感染谱。
[0020] 3、本发明预防H9N2型流感用流感病毒样颗粒疫苗以H9N2型流感病毒样颗粒为有 效成分，通过实验验证，鸡只注射该疫苗后体温、采食量、呼吸频率、精神状况和排泄物没有 异常，体重呈正常的状态，且接种了该疫苗的注射部位没有肉眼可见的局部或全身反应;进 一步通过实验验证，发现本发明疫苗具有免疫保护作用，从HI实验结果可以看出该疫苗的 免疫效果良好，高于传统灭活疫苗，具有良好的市场前景;细胞免疫结果显示该疫苗的刺激 指数SI达到有效刺激值，产生有效的细胞免疫。安全实验证明，该疫苗性能安全。
[0021] 4、本发明预防H9N2型流感用流感病毒样颗粒疫苗稳定性好，不容易失活，没有在 消化道内被酶分解掉;且本发明采用微球佐剂用来包埋H9N2型流感用流感病毒样颗粒，包 埋效果良好，能有效保证病毒样颗粒的活性不被破坏，使用微球佐剂的疫苗可以采用鼻内 或肌肉注射的方式接种，疫苗的吸收效果好，除动物应用外，也适用于老年人、小孩等高危 人群的使用，给口服疫苗的研发奠定了基础。
[0022] 5、同其他疫苗相比，本疫苗毒株制备的疫苗具有免疫用量小，免疫次数少，免疫时 间长等优点，具有良好的市场潜力，能有效阻止H9N2型流感病毒对动物和人类的侵害。 [0023] 6、本发明预防用H9N2型流感病毒样颗粒疫苗采用基因工程的方法进行制备，通过 构建多基因共表达载体，并转染昆虫细胞获得本发明病毒样颗粒疫苗，制备过程中不易散 毒，制备方向更加可控，制备出的疫苗粗品相比现有其他方法制得的疫苗更容易进行纯化， 纯化效率高，易于进行筛选，纯化后疫苗的滴度由2 6上升至21'纯化效果良好。
【附图说明】
[0024] 图1为HA基因和NA基因PCR鉴定结果图；
[0025]图2为Ml基因PCR鉴定结果图；
[0026]图3为转染前的SF9细胞图；
[0027]图4为转染P3代重组病毒后的SF9细胞图；
[0028]图5为病毒颗粒的透射电镜图；
[0029]图6为VLP颗粒的透射电镜图；
[0030]图7为微球佐剂H9N2型疫苗在模拟胃液和人工肠液中的释放速率图。
【具体实施方式】
[0031]下面结合具体实施例和说明书附图对本发明作进一步详细说明。
[0032] 一、一种预防用H9N2型流感病毒样颗粒疫苗，其组分包括H9N2型流感病毒样颗粒； 其中，所述H9N2型病毒样颗粒为H9N2型流感病毒的病毒样空壳颗粒结构，所述空壳颗粒结 构的囊膜表面含有H9N2型流感病毒的一种或者多种的结构蛋白。
[0033]所述结构蛋白可以是H9N2型流感病毒的血凝素HA蛋白、神经氨酸酶NA蛋白和基质 蛋白Ml;其中，所述HA蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，编码所述HA蛋白的核苷酸序 列如SEQIDN0.2所示;所述NA蛋白的氨基酸序列如SEQIDN0.3所示，编码所述NA蛋白的 核苷酸序列如SEQIDN0.4所示;所述Ml蛋白的氨基酸序列如SEQIDN0.5所示，编码所述 Ml蛋白的核苷酸序列如SEQIDN0.6所示。
[0034]上述预防用H9N2型流感病毒样颗粒疫苗的组分还可以包括佐剂;所述佐剂可以是 微球佐剂，采用如下方法制备：
[0035] 1)将乙酸、吐温-80、水和壳聚糖混合均匀，配制成混合溶液，所述混合溶液中壳聚 糖的质量浓度为〇. 25%~0.3%、乙酸的质量浓度为2%~2.5%、吐温-80的质量浓度为1 % ~1.2% ;
[0036] 2)在磁力搅拌和超声作用下，将质量浓度为10%~15%的Na2S〇4溶液以1~1.2mL/ min的速度滴入步骤1)配制的混合溶液中，持续磁力搅拌和超声作用20~25min后，以2750 ~3500r/min离心20~30min，用超纯水清洗离心沉淀物，以2750~3500r/min离心20~ 3〇min，再次重复两