sf9细胞，将接种了P3代重组病毒的sf9细 胞进行27°C温箱培养，待细胞明显出现病变时，用PBS吹下细胞，将吹下的细胞收集起来，然 后将收集的细胞反复冻融三次，超声处理样品，处理条件:AmpL38%、pLuson5s、pLusoff 10s、共lOmin，以3000r/min4°C离心30min，收集上清，分装后与_70°C保存备用。
[0089] 转染前的SF9细胞如图3所示，转染P3代重组病毒后的SF9细胞如图4所示，对比图3 和图4可以看出，转染后细胞出现了明显病变，即H9N2型流感病毒的VLP表达成功。
[0090] 10、鉴定：
[0091] 将P3代重组杆状病毒感染sf9细胞72小时，在感染了 72小时之后，用roS液小心的 将细胞吹下来，将吹下的细胞收集起来，并将此细胞冻融三次，用超声处理细胞，然后在4摄 氏度用离心机离心十分钟，离心机转速为3000转每分钟，然后收集上清液，在4摄氏度时 12000r/min收集沉淀，最后用磷钨酸进行负染，再利用透射电子显微镜观察流感病毒样颗 粒。
[0092 ]病毒颗粒的透射电镜图如图5所示，VLP颗粒的透射电镜图如图6所示，由图可以看 出视野中存在着H9N2的VLP颗粒，该颗粒大小为104nm，形状为圆球状。
[0093] 11、纯化：
[0094]将步骤9离心收集的细胞液装入13mL的超速离心管内，称重，平衡，封管。然后将离 心管放入超速离心机(Beckman公司产品）内，离心lh，速度为29000r/min，温度为4°C;取出 离心管后，小心倒掉上清液，保留离心管底的沉淀物，加入5mL的PBS，放入4摄氏度的冰箱 内，溶解24小时;次日，在另一个13mL的超速离心管内，小心的加入lmL质量浓度为60%的蔗 糖溶液，然后依次加入lmL质量浓度为30 %及3mL质量浓度为20 %的蔗糖溶液，最后将5mL的 溶解后的样品液置于其上;精确称重，平衡后，封管上超速离心机，4摄氏度离心一小时，离 速为29000r/min;取出离心管，分别收集位于20 %与30 %及30 %与60 %浓度交界处的二条 带，得到纯化的病毒样颗粒。
[0095]对纯化后的病毒样颗粒的HA进行测定，结果显示滴度由26上升至21()，说明纯化效 果良好。
[0096] 12、疫苗微球佐剂的制备：
[0097]将乙酸、吐温-80、水和壳聚糖混合均匀，配置成质量体积浓度为0.25%的壳聚糖 溶液（其中，乙酸的浓度为2 %，吐温-8 0的浓度为1 % )，在磁力搅拌和超声波作用下将 2mL10%(w/v)Na2S〇4溶液以lmL/min的速度滴入200mL的上述配制的壳聚糖溶液中，磁力搅 拌和超声波持续作用20min后，2750r/min离心20min，用超纯水清洗微球，再次离心，重复两 次后冷冻干燥过夜，得到微球佐剂。
[0098] 13、H9N2疫苗的制备及其免疫性能测试：
[0099]将5mg步骤12制得的疫苗微球佐剂溶于8mL步骤11纯化后的病毒样颗粒VLP中，置 于37°C下孵育3h，离心弃去上清液并清洗后，得到微球佐剂H9N2型疫苗，对微球的包封率和 载药量进行检测，结果显示该条件下微球载药量为89.04 %，包封率为38.45 %。
[0100] 载药量LC=(总抗原量-未吸附抗原量)/微球质量
[0101] 包封率LE=(总抗原量-未吸附抗原量)/总抗原量
[0102]对上述制得的微球佐剂H9N2型疫苗在模拟胃液和人工肠液中的释放速率进行检 测。
[0103]向上述制得的微球佐剂H9N2型疫苗中加入5mL模拟胃液，分别于0miη，15miη， 30min，60min，90min，120min，150min时，取20yL模拟胃液测其蛋白含量，计算包封率/载药 量并分析，结果如图7所示，微球佐剂VLP疫苗在模拟胃液中在前60min内的释放速率都很平 缓，到90min后则快速释放吸附的蛋白质。
[0104] 向上述制得的微球佐剂H9N2型疫苗中加入5mL模拟胃液，37°C孵育箱中轻摇5min 后快速清洗转入人工肠液中，分别于Omin，15min，30min，60min，90min，120min, 150min时取 20yL样品测其蛋白含量，计算包封率/载药量并分析。结果如图7所示，微球佐剂VLP疫苗在 人工肠液中也在前60min内缓慢释放，至Ij90min后则快速释放吸附的蛋白质且其在120min以 后释放的速度放缓。
[0105] 14、动物实验：
[0106]向步骤2制得的微球佐剂H9N2型疫苗中加入6.4mL生理盐水，制得微球佐剂H9N2型 疫苗悬液。
[0107]分别采用注射和口服的方法使用该疫苗悬液进行动物实验，所用动物为母源抗体 下降到4Lg2以下的2-3周龄雏鸡，空白对照组为生理盐水，阴性对照组为微球佐剂（口服 组）、微球佐剂(注射组）。
[0108]实验动物的免疫方案如下：
[0109] 1、疫苗首免和二免的确定
[0110] (1)首免日的确定：
[0111] 分别于雏鸡7、9、11、13日龄测其母源抗体，当母源抗体效价下降到4Lg2时可进行 首免。
[0112] (2)二免日的确定：
[0113]首免后每周测定HI效价，当单组的平均抗体滴度低于4.5Lg2时进行二免。
[0114] 2、试验雏鸡的分组
[0115] (1)将鸡只分组，分为微球VLP口服组（12只）、微球VLP注射组（12只）、空白对照生 理盐水组(5只），微球口服组、微球注射组各5只；
[0116] 表1分组情况表
[0118] (2)注射/ 口服疫苗剂量的确定
[0119]有资料显示，只有每剂量疫苗中血凝素含量大于0.3yg时，才能产生较高的HI抗 体；当血凝素含量大于〇.4yg时，免疫鸡在攻毒后既不会出现任何临床症状，又分离不出病 毒。
[0120]具体剂量根据H9-VLP及标准疫苗中HA的含量决定，用定量ELISA法测定HA含量。 [0121] HA含量的测定方法按试剂盒操作。
[0122] 采用标准曲线法，得到HA-ELISA标准曲线，标准方程为y= 0.0002X-0.0203，R2 = 0.9842。进一步利用该标准曲线可算出本实施例所用的VLP溶液中HA浓度为：x=(y+ 0 · 0203) /0 · 0002 X 5 X 106 = 6 · 06 X 109pg/mL = 6 · 06mg/mL。
[0123] 进一步确定微球VLP口服组为采用0.3mL微球佐剂H9N2型疫苗悬液灌胃；微球VLP 注射组为采用0.3mL微球佐剂H9N2型疫苗悬液颈部皮下注射;空白对照生理盐水组为0.3mL 生理盐水颈部皮下注射;微球（口服)组、微球注射组采用〇.3mL微球佐剂的生理盐水悬液颈 部皮下注射或灌胃。
[0124]疫苗注射方式:注射组均采用颈部皮下注射方式。口服组采用灌胃方式。
[0125]颈部皮下注射的正确方法:小鸡一人操作，注射时用拇指和食指把鸡颈部后1/3处 皮肤捏起，使皮肤和肌肉分离，注射器针头向着背部方向，以小于30度的角度刺入捏起的皮 下，注射速度不宜过快。注射时要防止刺穿另一侧皮肤将疫苗注射到体外，也要防止注射到 肌肉内或刺伤颈椎。
[0126]检测注射疫苗后鸡只体温、采食量、体重的变化;观察实验鸡只精神、排泄物是否 出现异常现象;观察注射部位是否出现因注射疫苗而引起的局部或全身反应。
[0127]结果显示注射疫苗前后鸡只在加料后l_2h内就可将饲料吃光，嗉囊饱满。说明疫 苗的注射并未使鸡只采食量变化。
[0128]注射疫苗后鸡只的体温变化如表2,结果显示注射或口服疫苗后各组均未出现明 显的体温变化。各组雏鸡的体温无显著差异(P>〇.05)。
[0129]表2注射后体温变化
[0131]对注射疫苗后鸡只的呼吸频率变化做检测，检测结果如下表3所示，结果显示注射 或口服疫苗后各组均未出现明显的呼吸频率变化。
[0132] 表3呼吸频率变化结果
[0134]对注射疫苗后鸡只的体重变化做检测，检测结果如下表4所示，结果显示首免2d后 鸡只体重呈正常增长状态，2d增重13~16g，首免后2d到5d之间雏鸡的体重各组均增加17-20g，首免后5d到7d之间雏鸡的体重各组均增加12-14g，首免7d到14d之间各组雏鸡的体重 明显上升，且在首免后14d时各组的雏鸡体重差异不明显(p>0.05)。
[0135] 表4体重变化表
[0136]
[0137] 对注射疫苗后鸡只的注射部位是否出现因注射疫苗而引起的局部或全身反应进 行试验，结果显示注射疫苗后注射部位没有肉眼可见的局部或全身反应。
[0138] 对注射疫苗后鸡只的精神和排泄物是否出现异常进行检测，结果显示注射疫苗后 各组雏鸡精神状况并没有异常;鸡只的排泄物均未观察到肉眼可见的异常现象。鸡粪便像 海螺一样，下面大上面小，呈螺旋状，上面有一层白色液体，粪便整体多为棕褐色。早晨排出 稀软糊状的棕色粪便。
[0139] 非特异性免疫保护水平的检测，溶菌酶实验:分别取14d，21d，35d雏鸡翅静脉血， 静止后析出血清按试剂盒说明书操作。
[0140]表5空白对照法测定溶菌酶
[0141]
[0142] 混匀各检测液体，37°C水浴15min，立即取出置于0°C以下的冰水浴中3分钟，逐管 取出倒入lcm光径比色皿中，530nm处以双蒸水调透光度100%，测各管透光度T15(即37°C水 浴15min后的透光度值）。
[0143] 计算公式：
[0145] 测试结果如下表6所示，结果可知，21日龄时，微球VLP注射组和阴性对照组中的微 球注射组的溶菌酶含量极显著高于其他组的溶菌酶含量(P〈〇. 01)。微球VLP注射组和阴性 对照组无显著差异(P>〇.05)。14日龄和35日龄时，各组间溶菌酶的含量均无显著差异(