35] 实施例3、布美他尼对K562细胞的抑制作用
[0036] 采用CCK-8试剂盒检测布美他尼对K562细胞的抑制作用，具体步骤如下：
[0037] 1、取96孔板；将处于对数生长期的K562细胞制备成细胞悬液（细胞悬液中，K562 细胞的浓度为120个细胞/微升）接种至96孔板的试验孔和对照孔，每孔50微升；将完全 培养基加至96孔板的空白孔，每孔50微升。
[003引 2、完成步骤1后，取96孔板；试验孔各孔分别加入不同体积的布美他尼母液和完 全培养基（使得试验孔各孔内培养体系的体积相等，均为50微升，布美他尼在培养体系中 的终浓度分别为1、2、4、8、16、32、64、128 U g/ml，每个浓度设置3个复孔）；对照孔各孔加入 完全培养基（使得对照孔各孔内的培养体系的体积与试验孔各孔内培养体系的体积相等， 均为50微升，设置3个对照孔）；空白孔各孔加入完全培养基（使得空白孔各孔内的培养 体系的体积与试验孔各孔内培养体系的体积相等，均为50微升，设置3个空白孔）；然后将 96孔板置于37 °C、5 % C02培养箱培养72h。
[0039] 3、完成步骤2后，取96孔板，每孔加入10微升CCK-8,1小时后于波长450nm下测 定吸光度。
[0040] 用GraphPad PrismS软件作图，抑制率-log药物浓度曲线见图3。布美他尼对 K562细胞的IC50值见表1。
[0041] 实施例4、布美他尼对Ecaiog细胞的抑制作用
[0042] 采用CCK-8试剂盒检测布美他尼对Ecaiog细胞的抑制作用，具体步骤如下：
[0043] 1、取96孔板；将处于对数生长期的Ecaiog细胞制备成细胞悬液（细胞悬液中， Ecaiog细胞的浓度为30个细胞/微升）接种至96孔板的试验孔和对照孔，每孔100微升； 将完全培养基加至96孔板的空白孔，每孔100微升；然后将96孔板置于37°C、5% 0)2培养 箱中培养24h。
[0044] 2、完成步骤1后，取96孔板，吸出孔内的培养液：试验孔各孔分别加入不同体积的 布美他尼母液和完全培养基（使得试验孔各孔内培养体系的体积相等，均为100微升，布美 他尼在培养体系中的终浓度分别为1、2、4、8、16、32、64或128U g/ml，每个浓度设置3个复 孔）；对照孔各孔加入完全培养基（使得对照孔各孔内的培养体系的体积与试验孔各孔内 培养体系的体积相等，均为100微升，设置3个对照孔）；空白孔各孔加入完全培养基（使 得空白孔各孔内的培养体系的体积与试验孔各孔内培养体系的体积相等，均为100微升， 设置3个空白孔）；然后将96孔板置于37°C、5% (?培养箱培养72h。
[0045] 3、完成步骤2后，取96孔板，吸出孔中的培养液，每孔加入10微升CCK-8和90微 升DMEM培养基，40分钟后于波长450nm下测定吸光度。
[0046] 用GraphPad PrismS软件作图，抑制率-log药物浓度曲线见图4。布美他尼对 Ecaiog细胞的IC50值见表1。
[0047] 实施例5、布美他尼对化Ia细胞的抑制作用
[0048] 采用CCK-8试剂盒检测布美他尼对化Ia细胞的抑制作用，具体步骤如下：
[0049] 1、取96孔板；将处于对数生长期的化Ia细胞制备成细胞悬液（细胞悬液中，Hela 细胞的浓度为30个细胞/微升）接种至96孔板的试验孔和对照孔，每孔100微升；将完全 培养基加至96孔板的空白孔，每孔100微升；然后将96孔板置于37°C、5% 0)2培养箱中培 养2地。
[0050] 2、完成步骤1后，取96孔板，吸出孔内的培养液：试验孔各孔分别加入不同体积的 布美他尼母液和完全培养基（使得试验孔各孔内培养体系的体积相等，均为100微升，布美 他尼在培养体系中的终浓度分别为1、2、4、8、16、32、64或128U g/ml，每个浓度设置3个复 孔）；对照孔各孔加入完全培养基（使得对照孔各孔内的培养体系的体积与试验孔各孔内 培养体系的体积相等，均为100微升，设置3个对照孔）；空白孔各孔加入完全培养基（使 得空白孔各孔内的培养体系的体积与试验孔各孔内培养体系的体积相等，均为100微升， 设置3个空白孔）；然后将96孔板置于37°C、5% (?培养箱培养72h。
[0051] 3、完成步骤2后，取96孔板，吸出孔中的培养液，每孔加入10微升CCK-8和90微 升DMEM培养基，40分钟后于波长450nm下测定吸光度。
[0052] 用GraphPad PrismS软件作图，抑制率-log药物浓度曲线见图5。布美他尼对 化Ia细胞的IC50值见表1。
[0053] 实施例6、布美他尼对化rkat细胞的抑制作用
[0054] 采用CCK-8试剂盒检测布美他尼对化rkat细胞的抑制作用，具体步骤如下：
[00巧]1、取96孔板；将处于对数生长期的化rkat细胞制备成细胞悬液（细胞悬液中， 化rkat细胞的浓度为120个细胞/微升）接种至96孔板的试验孔和对照孔，每孔50微升； 将完全培养基加至96孔板的空白孔，每孔50微升。
[0056] 2、完成步骤1后，取96孔板；试验孔各孔分别加入不同体积的布美他尼母液和完 全培养基（使得试验孔各孔内培养体系的体积相等，均为50微升，布美他尼在培养体系中 的终浓度分别为1、2、4、8、16、32、64、128 U g/ml，每个浓度设置3个复孔）；对照孔各孔加入 完全培养基（使得对照孔各孔内的培养体系的体积与试验孔各孔内培养体系的体积相等， 均为50微升，设置3个对照孔）；空白孔各孔加入完全培养基（使得空白孔各孔内的培养 体系的体积与试验孔各孔内培养体系的体积相等，均为50微升，设置3个空白孔）；然后将 96孔板置于37 °C、5 % C〇2培养箱培养72h。
[0057] 3、完成步骤2后，取96孔板，每孔加入10微升CCK-8, 2小时后于波长450nm下测 定吸光度。
[0058] 用GraphPad PrismS软件作图，抑制率-log药物浓度曲线见图6。布美他尼对 化rkat细胞的IC50值见表1。
[0059] 实施例7、布美他尼对MCF7细胞的抑制作用
[0060] 采用CCK-8试剂盒检测布美他尼对MCF7细胞的抑制作用，具体步骤如下：
[0061] 1、取96孔板；将处于对数生长期的MC巧细胞制备成细胞悬液（细胞悬液中，MCF7 细胞的浓度为30个细胞/微升）接种至96孔板的试验孔和对照孔，每孔100微升；将完全 培养基加至96孔板的空白孔，每孔100微升；然后将96孔板置于37°C、5% 0)2培养箱中培 养2地。
[0062] 2、完成步骤1后，取96孔板，吸出孔内的培养液：试验孔各孔分别加入不同体积的 布美他尼母液和完全培养基（使得试验孔各孔内培养体系的体积相等，均为100微升，布美 他尼在培养体系中的终浓度分别为1、2、4、8、16、32、64或128U g/ml，每个浓度设置3个复 孔）；对照孔各孔加入完全培养基（使得对照孔各孔内的培养体系的体积与试验孔各孔内 培养体系的体积相等，均为100微升，设置3个对照孔）；空白孔各孔加入完全培养基（使 得空白孔各孔内的培养体系的体积与试验孔各孔内培养体系的体积相等，均为100微升， 设置3个空白孔）；然后将96孔板置于37°C、5% (?培养箱培养72h。
[0063] 3、完成步骤2后，取96孔板，吸出孔中的培养液，每孔加入10微升CCK-8和90微 升DMEM培养基，40分钟后于波长450nm下测定吸光度。
[0064] 用GraphPad PrismS软件作图，抑制率-log药物浓度曲线见图7。布美他尼对 MCF7细胞的IC50值见表1。
[0065] 表1布美他尼对各个肿瘤细胞的IC50值
[0067] 结果表明，布美他尼对W上各个肿瘤细胞均有抑制作用，对A549细胞、肥T116细 胞和K562细胞的抑制效果最明显。
【主权项】
1. 布美他尼在制备抑制肿瘤细胞的药物中的应用。2. 布美他尼在制备抑制肿瘤细胞增殖的药物中的应用。3. 如权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述肿瘤细胞为肺腺癌细胞、结肠癌细 胞、白血病细胞、食管癌细胞、宫颈癌细胞或乳腺癌细胞。4. 如权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述肿瘤细胞为A549细胞、HCT116细 胞、K562细胞、Ecal09细胞、Hela细胞、Jurkat细胞或MCF7细胞。5. 布美他尼在制备治疗癌症的药物中的应用。6. 如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述癌症为肺腺癌、结肠癌、白血病、食管 癌、Η颈癌或乳腺癌。7. 如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述癌症是由肿瘤细胞引起的；所述肿瘤细 胞为Α549细胞、HCT116细胞、Κ562细胞、Ecal09细胞、Hela细胞、Jurkat细胞或MCF7细 胞。8. -种药物，其活性成分为布美他尼；所述药物的功能为如下（a)和/或（b)和/或 (c) : (a)抑制肿瘤细胞；(b)抑制肿瘤细胞增殖；（c)治疗癌症。9. 如权利要求8所述的药物，其特征在于： 所述（a)中，所述肿瘤细胞为肺腺癌细胞、结肠癌细胞、白血病细胞、食管癌细胞、宫颈 癌细胞或乳腺癌细胞； 所述（b)中，所述肿瘤细胞为肺腺癌细胞、结肠癌细胞、白血病细胞、食管癌细胞、宫颈 癌细胞或乳腺癌细胞； 所述（c)中，所述癌症为肺腺癌、结肠癌、白血病、食管癌、宫颈癌或乳腺癌。10. 如权利要求8所述的药物，其特征在于： 所述（a)中，所述肿瘤细胞为A549细胞、HCT116细胞、K562细胞、Ecal09细胞、Hela 细胞、Jurkat细胞或MCF7细胞； 所述（b)中，所述肿瘤细胞为A549细胞、HCT116细胞、K562细胞、Ecal09细胞、Hela 细胞、Jurkat细胞或MCF7细胞； 所述（c)中，所述癌症是由肿瘤细胞引起的；所述肿瘤细胞为A549细胞、HCT116细胞、 K562细胞、Ecal09细胞、Hela细胞、Jurkat细胞或MCF7细胞。
【专利摘要】本发明公开了bumetanide在抑制肿瘤细胞增殖中的应用。本发明提供了布美他尼在制备抑制肿瘤细胞的药物中的应用。所述肿瘤细胞可为肺腺癌细胞、结肠癌细胞、白血病细胞、食管癌细胞、宫颈癌细胞或乳腺癌细胞。所述肿瘤细胞具体可为A549细胞、HCT116细胞、K562细胞、Eca109细胞、Hela细胞、Jurkat细胞或MCF7细胞。本发明对于肿瘤的治疗具有重大价值。
【IPC分类】A61K31/196, A61P35/02, A61P35/00
【公开号】CN105496995
【申请号】CN201410486082
【发明人】姜颖, 贺福初, 徐辰, 孙薇, 魏汉东
【申请人】北京蛋白质组研究中心
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2014年9月22日