夫西地酸或其药用盐在制备抗手足口病药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药新用途领域。更具体地，涉及一系列夫西地酸或其药用盐在制备 抗手足口病药物中的新用途。
【背景技术】
[0002] 手足口病(hand-foot-and-mouth disease，HFMD)是由肠道病毒引起的急性传染 病，主要在5岁以下儿童中发病。HFMD主要临床症状为手、足、口腔等部位斑丘疹、疱疹，重症 患者可出现严重的神经系统疾病，甚至死亡。引发HFMD的肠道病毒有20多种（型），其中以柯 萨奇病毒A16型(CVA16)和肠道病毒71型(EV71)最为常见，其它不同型的肠道病毒和柯萨奇 病毒也可致病。EV71和CVA16具有高度传染性，感染呈全球性分布，特别是在亚太地区，所引 起的手足口病已成为一种严重危害社会公众健康的疾病。由于缺乏特异、高效的抗病毒药 物，根据手足口病诊疗指南(2013年版），目前主要采取隔离和对症治疗。因此，急需抗EV71 和CVA16等肠病毒药物的研制与开发。
[0003] 新药研发时间长、研发成本高昂，从现有药物中筛选抗病毒药物则是一种快速、经 济的有效策略。夫西地酸由梭链孢酸脂球菌产生，属于梭链孢酸类抗生素，临床上用其钠盐 (夫西地酸钠)进行抗感染治疗。夫西地酸是一类窄谱抗生素，主要用于G+菌感染治疗，包括 金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、梭状芽孢菌属、棒状杆菌等，尤其在控制耐药金黄色葡萄 球菌感染方面起了重要的作用；同时，该药也可抗多种厌氧菌。夫西地酸是通过抑制细菌延 长因子G(FE-G)的功能而影响核糖体转位、阻碍细菌蛋白合成而发挥抗菌机制的。此外，研 究表明夫西地酸还具有抗HIV和JCV病毒活性，但抗病毒作用机制并不清楚。除此之外，未见 夫西地酸抗其它病毒活性的报道。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种夫西地酸或其药用盐的新用途，即抗肠病毒EV71和柯萨 奇病毒CVA16等病毒，从而用于制备治疗手足口病的药物。同时为手足口病药物研发提供可 能的作用靶位和先导化合物，为进一步结构改造、获得更强的抗病毒化合物提供工作基础。
[0005] 为达到上述目的，本发明采取的技术方案为：
[0006] 本发明涉及夫西地酸或其药用盐在制备抗手足口病药物中的新用途。夫西地酸又 称梭链孢酸、褐霉素或留酸霉素。由真菌中的球形梭链孢菌(Fusidium coccineum)或某些 头孢霉(Cephalosporium spp)产生。临床实践表明夫西地酸的毒副反应小，儿童亦适合使 用。其药用盐多选用钠盐，即夫西地酸钠。对夫西地酸或其药用盐进行结构改造，生成衍生 物，这些衍生物只要具有抗肠病毒EV71和柯萨奇病毒CAV16等病毒的能力，也都属于本发明 的保护范围。
[0007] 本发明所述药物是以夫西地酸或其药用盐为有效成分与药学可接受的辅料组合 制成。所述药学可接受的辅料包括:淀粉、微晶纤维素、蔗糖、糊精、乳糖、糖粉、葡萄糖、氯化 钠、羧甲基纤维素钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、硬脂酸镁、微粉硅胶、维生素 C、半胱氨酸、柠檬 酸和亚硫酸钠、木糖醇、麦芽糖、聚乙二醇、单糖浆、乙醇、丙二醇、植物油、甘露糖中的一种 或几种。
[0008] 进一步地，所述药物可以是口服制剂、注射制剂或局部施用制剂。剂型的选择和辅 料的用量均为本领域的常规选择。为了达到更好的疗效，针对婴幼儿患者，优先采用注射制 剂。
[0009] 本发明的有益效果：
[0010] 本发明表明夫西地酸具有显著的体外抗EV71和CVA16的活性，当Μ0Ι为0.01时，抑 制EV71和CVA16产毒量的EC50分别为3.56μΜ和5.41μΜ。进一步的作用机制研究提示，夫西地 酸可能通过阻断病毒RNA合成或病毒蛋白的合成或加工而发挥抗肠病毒作用的。目前临床 表明夫西地酸的临床副反应少、毒性低、安全性高，是一类可用于儿童的抗感染用药。鉴于 手足口病患者群主要为婴幼儿，因此，夫西地酸具有开发为治疗手足口病的药物或先导化 合物的潜在应用价值。
【附图说明】
[0011]图1流式分析夫西地酸对EV71-GFP所携带报告基因 GFP表达的影响及抗病毒活性。 将EV71-GFP按Μ0Ι = lPFU/cel 1感染Vero细胞后，去除感染液，加入含有不同浓度夫西地酸 的培养基。37°C培养18-20h后用流式细胞仪分析细胞的GFP荧光表达情况，以未加药物的 GFP阳性细胞率作为100%，计算经药物处理后的细胞GFP相对阳性率，数值为三次重复实验 的平均值土 SD。流式图为三次独立重复实验中的一次。
[0012] 图2通过产毒量减少(virus titer reduction assay)分析夫西地酸的抗病毒活 性。将 EV71-MZ201405 和 CVA16-MZ201509(M0I = 0.01PFU/cell)分别与 RD 细胞孵育 lh 后去除 病毒上清，添加含有不同浓度夫西地酸的培养基，药物浓度呈倍比稀释；以未加药物的感染 细胞为对照。感染后48h后收集上清，采用空斑法测定病毒滴度。将对照细胞上清测得的病 毒滴度设定为100%，经药物处理的细胞上清中的相对病毒滴度（％ )=(对照组病毒滴度-药物处理组病毒滴度)/对照组病毒滴度X 100%。每种药物浓度下的相对病毒滴度百分比 为三次重复实验的平均值土SD。
[0013]图3夫西地酸加入时间对产毒量的影响。将EV71-MZ感染RD细胞(M0I = 5)，分别在 感染前lh(-lh)及感染后他、111、211、411、611及811加入10(^1夫西地酸，以未加药物的感染细胞 为对照，于感染后l〇h收集上清并通过空斑法测定病毒滴度，将对照组上清的病毒滴度设定 为100%，计算药物处理组的相对产毒量。每种加药时间下的相对病毒量百分比为三次重复 实验的平均值土SD。
[0014] 图4夫西地酸对肠病毒RNA合成的影响。将EV71-MZ201405感染RD细胞(M0I = 5)后 立即加入100μΜ夫西地酸，以未加药物的细胞作为对照，分别于感染后2h、4h、6h及8h提取总 RNA，通过反转录-定量PCR(RT-QPCR)测定病毒RNA水平。以GAPDH mRNA水平为内参，将2h时 对照细胞的病毒RNA相对丰度设定为1。实验重复三次。
【具体实施方式】
[0015]为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领 域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本 发明的保护范围。
[0016]药品与试剂
[0017]本发明所测试的夫西地酸购自大连美仑生物技术有限公司；用DMS0配制成浓度为 25.6mM的药物贮存液;使用时用含10 %血清的DMEM培养基依次进行2倍稀释，使用终浓度分 别为256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5和0.25以]?。试剂包括 ：1\?85(似(：188/1，1((：10.28/ L，Na2HP042.72g/L，NaH 2P〇424g/L，pH 7.2)，DMEM(Gibco)，胎牛血清（Sigma)，0.05% Trypsin-EDTA(GIbC〇)，多聚甲醛(生工生物），结晶紫(珠海贝索生物技术有限公司），MTT (Sigma)，DMS0(Sigma)，Trizol reagent(Invitrogen)，PrimeScript RT reagent Kit (Takara),TransStart Tip Green qPCR SuperMix(全式金）。
[0018] 细胞及病毒株
[0019] 293A-SCARB2细胞稳定组成型表达EV71的天然受体SCARB2(human scavenger receptor class B,member 2,清道夫受体B2);横纹肌肉瘤RD细胞和非洲绿猴肾Vero细胞 对EV71高度敏感，广泛用来分离、扩增EV71和CVA16AV71-GFP为携带报告基因 GFP的从北京 地区分离的毒株;EV71-MZ210405是从广东地区重症手足口病患儿分离得到的高致病性肠 病毒EV71毒株;CAV16-MZ210509是从广东地区重症手足口病患儿分离得到的高致病性柯萨 奇病毒16毒株。
[0020]仪器
[0021] 细胞培养箱(Thermo)，倒置显微镜(Leica)，倒置荧光显微镜(Leica)，流式细胞仪 (BD Accuri?C6)，定量PCR仪（BioRad)。
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