专利名称：盐酸阿比朵尔在制备抗肠道病毒药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种抗病毒药物，具体盐酸阿比多尔在制备治疗手足口病药物中的用途。
背景技术：
手足口病(hand-foot-mouth disease, HFMD)是由多种肠道病毒引起的常见传染病，以肠道病毒71型(EV71)及柯萨奇病毒16型(CoxAie)最常见，以婴幼儿和儿童发病为主。大多数患者症状轻微，以发热和手、足、口腔、臀等部位出现皮疹或疱疹为主要特征。少数患者可发生脑炎、脑膜炎、脊髓炎、周围神经炎、急性弛缓性麻痹、心肌炎等，个别重症患儿病情进展快，可因神经源性肺水肿、心肺功能衰竭而死亡。手足口病流行期间，可发生幼儿园、托儿所、学校集体感染和家庭聚集发病现象。其传染性强、隐性感染比例大、传播途径复杂、传播速度快，短期即可造成较大范围的流行，疫情控制难度大。带毒者和轻型散发病例是流行间歇和流行期的主要传染源。手足口病是全球性传染病，世界大部分地区均有此病流行的报道。近年来，东南亚地区手足口病发病率升高，并呈现季节性流行和全年散发趋势。我国于1981年上海首次报道本病，此后，北京、河北、天津、福建、吉林、山东、湖北、青海和广东等10几个省(市)均有报道。2006年，全国共报告手足口病13 637例。2009 年，中国多地爆发手足口病疫情，并有353名婴幼儿死亡。发病率较2008年递增135. 13%， 死亡率增加180%。2010年时下，河南、山东、北京、云南、内蒙古等地又出现手足口病疫情， 且已有数例患儿死亡。卫生部公布2010年3月全国法定传染病疫情，手足口病发病数共报道77756例，死亡数为40例，占丙类传染病的90. 91%。报告病例仍以5岁及以下儿童为主 (占93. 96%);在实验室确诊的病例中，EV71型占75. 0%。根据手足口病病原学特点、2009年和2010年全国手足口病疫情数据分析认为，我国手足口病防控形势比较严峻。手足口病疫情主要流行于农村地区，表现为分布广、疫点多，幼儿比例大、持续时间长。手足口病传染性强，传播速度快，短时间内可在托幼机构、学校等人口密集的地区引起大流行，至今尚无疫苗预防也没有特效药物治疗。因此，寻找抗该病病毒的药物是开展手足口病防治研究的有效干预措施。盐酸阿比朵尔(Arbidol Hydrochloride)，其化学名为6-溴-4- (二甲氨甲基)-5_羟基-1-甲基-2-(苯硫甲基)-1Η-吲哚-3-羟酸乙酯盐酸盐-水合物，结构式为
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盐酸阿比朵尔是非核苷类抗病毒药物，可用于防治流行性感冒和其它急性呼吸道病毒感染，它对甲、乙型流感病毒的抗病毒活性最为显著，该药能抑制甲、乙型流感病毒复制的早期阶段，能抑制病毒细胞浆膜的融合以及病毒与内吞囊泡之间的膜融合。同时阿比朵尔在体内还可诱导产生干扰素，对巨噬细胞的吞噬功能有显著的活化作用，具有免疫调节作用。然而到目前为止，还没有将盐酸阿比多尔应用于手足口病的防治。
发明内容
本发明的目的在于提供盐酸阿比多尔在制备抗肠道病毒药物中的应用。本发明研究发现，盐酸阿比多尔对肠道病毒具有明显的抗病毒活性，尤其是引起手足口病的肠道病毒71型。进而本发明提供一种抗病毒药物，其包括上述盐酸阿比朵尔以及药学上可接受的载体，其剂型可以是丸剂、片剂、胶囊或者是口服液等形式。盐酸阿比朵尔在体外具有明显抑制肠道病毒71型的作用。具体体现在在对病毒直接杀灭作用、抗病毒吸附作用和抑制病毒增殖作用上，其治疗指数(treatment index, Tl)分别为3. 08 (直接杀伤病毒)、23.55 (阻断病毒侵入)和2. 5 (抑制病毒增殖)。
图1为盐酸阿比朵尔对RD细胞的毒性实验，左正常RD细胞；右阿比朵尔对细胞的毒性作用(lOyg/ml)。
具体实施例方式以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的生化试剂为市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1盐酸阿比朵尔对RD细胞的毒性作用
(1)根据Mosmarm建立MTT法检测药物的细胞毒性作用。用含有0.02% EDTA的胰酶将生长良好的细胞分散成单个细胞悬液，后用含10%小牛血清的细胞培养液将细胞调整至1 Xio5Ail的浓度分种于96孔板，每孔0.加1。置37°C， 5%C02培养箱中培养Mh。待细胞长成单层后，弃培养液上清，换含不同浓度的含药维持液， 每孔200 μ 1。药物的终浓度分别为62. 50、31. 25、15. 63、7. 81、3. 91 μ g/ml。每种浓度重复 4孔，实验同时设正常细胞对照组。继续培养4 后，用MTT法检测细胞存活率。结果盐酸阿比朵尔对RD细胞的毒性作用表现为细胞变圆，胞内颗粒增多，折光性变差，部分产生空泡(图1右)等。正常RD细胞没有这些特征(图1左)。由于细胞代谢活性降低或死亡，MTT 法检测到的活细胞数减少，故A值下降。且药物对细胞的毒性作用在一定范围内随着药物浓度的增加，细胞存活率降低。通过显微镜观察细胞形态和MTT法测定A值，确定盐酸阿比朵尔的 TC5tl 为 25. 86 μ g/ml。实施例2盐酸阿比朵尔抗肠道病毒71型药效学研究 1、盐酸阿比朵尔对肠道病毒71型的直接杀伤作用
分别将50TCID5Q EV71与盐酸阿比朵尔药液不同浓度混合，终浓度分别为8、4、2、1、0. 5 μ g/ml，4 °C作用6h后加至已长成单层的RD细胞上，吸附2h后，弃去上清，加入细胞维持液，37°C、5%C02培养箱中继续培养。每日观察CPE，当病毒对照病变达+++ ++++时， 用MTT法检测病毒抑制率。采用治疗指数作为评价指标来衡量药物对病毒的抑制效力。同时设病毒对照和细胞对照。以TI作为药物对EV71抑制效力的评价指标，TI=TC50/IC50, TI 值越大，药物抑制EV71的作用越强。结果病毒对照组EV71所致RD细胞的CPE表现为 细胞形态皱缩，变圆，折光性减弱，胞核圆缩和破裂，细胞最终脱落坏死。与病毒对照组相比，细胞对照组细胞形态较为正常，呈扁圆形，排列整齐且紧密。光镜下观察阿比朵尔抑制 EV71的CPE情况与病毒对照组相比，盐酸阿比朵尔作用孔细胞病变随药物浓度大小呈梯度变化，药物浓度最大孔CPE : +。经Probit线性回归分析，盐酸阿比朵尔类似物的EC 50为 12. 55士2.52 μ g/ml，治疗指数TI为19. 40士2. 04 μ g/ml，TI为3. 08，表明其也具有直接灭活EV71作用。(2)盐酸阿比朵尔对肠道病毒71型侵入阻断作用
根据细胞毒性实验结果，在药物无毒范围内，将已长成单层的RD细胞预先用100μ 1不同浓度药液处理。药液浓度分别为16、8、4、2、1μ g/ml，37°C，5%C02孵育2h后弃去药液，每孔加入50μ1 IOOTCID5ci的RV，吸附2h，弃病毒上清，加细胞维持液，同上法培养与观察。光镜下观察，药物作用孔细胞病变效应与病毒对照组相比较轻，多数的细胞形态较为正常，阿比朵尔在一定程度上抑制了 EV71病毒感染细胞所致CPE，提示该药对EV71感染有一定的预防作用。阿比朵尔在不同药物浓度(μ g/ml)和病毒抑制率呈一定的剂量依赖关系，阿比朵尔EC50为16. 97士2. 4，TI为23. 55，说明阿比朵尔能够阻断肠道病毒71型入侵细胞。(3)盐酸阿比朵尔对肠道病毒71型生物合成抑制作用
于已长成单层细胞的96孔板上，每孔接种50 μ 1 IOOTCID5ci的EV71，吸附2h，弃病毒上清，根据细胞毒性实验的结果，在药物无毒浓度范围内，依次加入同上5个浓度梯度的含药维持液每孔0. 2mL,同上法培养与检查。通过光镜下观察，药物作用孔细胞病变效应与病毒对照组相比很轻，多数的细胞形态正常，阿比朵尔在一定程度上抑制了 EV71病毒感染细胞所致CPE，药物最高浓度的CPE :+，最低浓度CPE :+++。阿比朵尔类似物的EC50为 18. 28 士 1. 70，TI为2. 5。这些结果提示该药对EV71感染细胞有抑制作用。实施例3 阿比朵尔体内抗EV71的实验研究
40只雌性BALB/c小鼠(7-9 g)随机分成4组①正常动物对照组，灌服生理盐水 ’② 病毒感染模型组，病毒感染后，灌服生理盐水；③高剂量治疗组(0. Ig · kg—1 · Cf1);④低剂量治疗组(0. 05g · kg—1 · cf1)。小鼠经乙醚麻醉，以15LD5Q病毒液口服感染，每只0. 05mL,正常动物对照组用生理盐水代替病毒液口服感染。感染后2h开始灌胃给药，每天给药2次，每次0. lmL，连续给药 5d。观察15天。小鼠处死前禁食8h，摘除眼球放血脱颈椎处死动物，取肠组织置勻浆器中， 加生理盐水，在冰浴中研磨制成勻浆，反复冻融两次释放病毒，离心后取上清按常规方法进行病毒滴定。观察动物的一般表现，正常对照动物未见死亡，病毒对照动物在感染后5天开始死亡，死亡率80%，高、低剂量组动物死亡率分别为25%和50%。体内实验结果显示该药对 EV-71感染小鼠有保护作用。
权利要求
1.盐酸阿比多尔在制备抗肠道病毒药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肠道病毒为肠道病毒71型。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述药物盐酸阿比多尔和药学上可接受的载体。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为丸剂、片剂、胶囊剂或口服液。
全文摘要
本发明公开了盐酸阿比朵尔在制备抗肠道病毒药物中的新用途。本发明研究表明盐酸阿比朵尔在细胞内和动物体内具有抗手足口病病毒(即肠道病毒71型)的作用，且其在病毒感染前、感染后的给药方式抗病毒均有效。由该化合物作为抗病毒药物在对病毒直接杀伤作用和对病毒感染细胞的阻断预防作用上，其治疗指数(treatmentindex，TI)分别为3.08(直接杀伤病毒)、23.55(阻断病毒侵入)和2.5(抑制病毒增殖)。本发明为治疗手足口病病毒感染提供了新的有效途径，具有实际应用价值。
文档编号A61K31/4045GK102440988SQ20111044516
公开日2012年5月9日 申请日期2011年12月28日 优先权日2011年12月28日
发明者侯炜, 凌佳馨, 刘媛媛, 刘强, 杨占秋, 熊海蓉, 王雨, 罗凡, 肖红 申请人:武汉大学