甘草中一类异戊烯基异黄酮类化合物的医药新用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及甘草中一类异戊烯基异黄酮类化合物的药物新用途，具体涉及它们在 制备抗癌药物、PTP1B抑制剂和抗糖尿病药物、酪氨酸酶抑制剂、乙酰胆碱酯酶抑制剂中的 应用。
【背景技术】
[0002] 甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)是最常用的中药之一，在中国已经有2000 多年的应用历史，除了中国药典，它也被日本药典、欧洲药典以及美国药典所收录。甘草具 有清热解毒、祛痰止咳、调和诸药、补脾益气等多种功效，主要用于脾胃虚弱、咳嗽痰多、心 悸气短、痈肿疮毒等病症，在现代临床应用中主要用于治疗呼吸道感染、胃溃疡、糖尿病以 及病毒性肝炎等疾病。此外，甘草也被广泛应用于化妆品行业，具有显著的祛斑美白等效 果。甘草的化学成分众多，迄今已经从甘草属植物中分离报道约450个化合物，主要分为三 萜皂苷类、黄酮苷元类以及黄酮糖苷类化合物。其中，三萜皂苷的苷元主要为齐墩果烷型三 萜，而黄酮苷元类化合物种类很多，主要包括黄酮、黄酮醇、二氢黄酮、异黄酮、二氢异黄酮、 异黄烷、紫檀烷、查尔酮以及香豆素等。目前对于甘草中化学成分的药理活性研究主要集中 于甘草中的一些含量较高的化合物，比如甘草酸、甘草素、异甘草素、甘草苷以及异甘草苷 等，而对于其他成分的药理活性研究却很少有报道。
[0003] 甘草西定（英文名：licoricidin;CAS号：30508-27-1;分子式：C26H3205;分子量： 424)、Angus tone A(CAS号:90686-13-8;分子式:C25H26〇6;分子量:422)和粗毛甘草素 D (英文 名：glyasperin D; CAS号：142561-10-2;分子式:C22H26O5;分子量:370)是甘草的化学成分， 它们的化学结构相似，均属于异戊烯基化的异黄酮或异黄烷类化合物，在其C-5，C-7，C-2 ' 和C-4 '上均有羟基或甲氧基取代，在C-6上有异戊烯基取代，此外，在甘草西定和angustone A的C-3 '上有第二个异戊烯基取代。
[0004] 甘草西定曾被报道具有抑制c A Μ P磷酸二酯酶（K u s a η ο A等， Chem.Pharm. Bui 1 · 1991，39,930-933)、抑制溶血血小板活化因子乙酰转移酶(Nagumo S等， Biol .Pharm.Bull · 1999，22，1144-1146)、抗菌（Hatano T等，Chem.Pharm.Bull · 2000,48， 1286-1292;Tanaka Y等，J.Nutr.Sci .Vitaminol .2001,47,270-273 ;Fukai T等，Life Sci.2002,71，1449-1463;Tanabe S等，J Breath Res.2012,6,016006;Villinski JR等，J Nat Prod.2014,77,521-526;Eerdunbayaer等，Molecules 2014,19,13027-13041; Kirmizibekmez H等，Fitoterapia 2015，103,289_293)、抗肾炎和氧化（卩111^;[1'等， Fitoterapia 2003,74,720-724)、治疗牙周炎等口腔疾病（1^￥0等，1?640(101^01.2011， 82，122-128;Messier C等，Oral Dis.2012，18,32-39;Gafner S等，J Nat Prod.2011，74， 2514-2519)等活性，也曾有报道称含有甘草西定的甘草提取物可以抑制前列腺癌细胞 DU145的转移能力（Park SY等，Br J恥杜.2010，104，1272-1282)，但未见关于甘草西定直 接抑制肿瘤细胞增殖和PTP1B活性的报道。
[0005] 关于Angustone A的活性尚未见任何报道，而其C-6上的异戊烯基与C-7上的羟基 脱氢环化而生成的衍生物Angustone C具有抗菌和胃肠道保护（Quesada L等，Nat Prod Commun. 2012，7,1187-1188)作用。
[0006] 粗毛甘草素 D曾被报道具有较弱的抗幽门螺杆菌活性（Fukai T等，Life Sci . 2002，71，1449-1463)，此外未见其它活性报道。
[0007] 蛋白酪氨酸磷酸酶ΙΒ(ΡΤΡΙΒ)在体内专一水解芳香族磷酸，通过对胰岛素受体或 其底物上的酪氨酸残基去磷酸化作用，对胰岛素信号转导进行负调节，PTP1B抑制剂可用于 治疗II型糖尿病。近年来的研究表明PTP1B也参与了癌症发生发展，而其抑制剂在抗癌方面 具有巨大潜力（Lessard L等，Biochim Biophys 六(^&.2010，1804,613-619)。乙醜胆喊酯酶 (AChE)在体内选择性地水解乙酰胆碱生成胆碱和乙酸，降低胆碱能神经的生理效应，AChE 抑制剂可用于治疗神经系统退行性疾病如阿尔兹海默病等。酪氨酸酶是皮肤中黑色素合成 的关键酶，酪氨酸酶抑制剂能够抑制体内黑色素的合成，具有祛斑美白的作用。这些靶点和 甘草的药理作用密切相关，也有报道一些来源于甘草和化合物或提取物可以抑制这些靶 点，但本发明所公开的三种化合物相关活性均未见报道。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是提供甘草中三种异戊烯基异黄酮类化合物（即甘草西定、 angustone A和粗毛甘草素 D)的药物新用途。此三种化合物的结构式如下：
[0009]
(1.)甘草西定（Iicoricidin) (2)粗毛甘草素 (glyasperin.D:) (3) angustone A 〇
[0010] 本发明所提供的三种化合物的药物新用途指这些化合物本身或其药学上可接受 的盐、酯、溶剂化物、立体异构体、互变异构体、前药中的至少一种，以及它们的混合物在制 备具有如下（1)-(5)中至少一种功能的药物中的应用：（1)抗癌药物；（2)抗糖尿病药物；（3) PTP1B抑制剂；（4)乙酰胆碱酯酶抑制剂;或(5)酪氨酸酶抑制剂。
[0011] 本发明人通过对甘草化学成分的系统分离纯化和多种活性筛选验证，发现了若干 个具有显著活性的化合物。其中本发明所公开三种化合物，即甘草西定、angustone A和粗 毛甘草素 D，为结构相近的异戊烯基异黄酮类化合物，具有突出的抑制肿瘤细胞存活和抑制 PTP1B的活性以及抑制乙酰胆碱酯酶的活性，粗毛甘草素 D还具有抑制酪氨酸酶的显著活 性。进一步研究发现，甘草西定能够有效地抑制肿瘤细胞的增殖，诱导肿瘤细胞的凋亡。 Angustone A可以通过诱导细胞凋亡和自途径抑制多种肿瘤细胞活力，其活性与其抑制 肿瘤细胞糖酵解能力相关。
[0012]根据本发明，甘草西定、angustone A和粗毛甘草素 D可用于制备抗癌药物或PTP1B 抑制剂和抗糖尿病药物，甘草西定和粗毛甘草素 D可用于制备乙酰胆碱酯酶抑制剂，粗毛甘 草素 D还可用于制备酪氨酸酶抑制剂和祛斑美白产品。
[0013]以上述活性化合物或其药学上可接受的盐、酯、溶剂化物、立体异构体、互变异构 体、前药以及它们的混合物为有效成分制备的药物也属于本发明的保护范围。
[0014] 需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体或辅料。 所述载体或辅料包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸 收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。
[0015] 利用上述活性化合物或其药学上可接受的盐、酯、溶剂化物、立体异构体、互变异 构体以及前药作为活性成分，单独或组合使用，或与其它药物、辅料等配合制备成各种剂 型，包括但不限于片剂、散剂、丸剂、注射剂、胶囊剂、膜剂、栓剂、膏剂、冲剂等多种形式。上 述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
【附图说明】
[0016] 图1为甘草西定的核磁共振氢谱(? NMR)。
[0017] 图2为甘草西定的核磁共振碳谱(13C NMR)。
[0018]图3为angustone A的核磁共振氢谱（? NMR)〇
[0019] 图4为angustone A的核磁共振碳谱（13C NMR)。
[0020] 图5为粗毛甘草素 D的核磁共振氢谱(? NMR)。
[0021] 图6为粗毛甘草素 D的核磁共振碳谱(13C NMR)。
[0022] 图7为甘草西定对SW480人结肠癌细胞周期的作用。
[0023] 图8为甘草西定对SW480人结肠癌细胞凋亡的作用。
[0024] 图9为angustone A对SW480人结肠癌细胞凋亡的作用。
[0025] 图10为angustone A抑制SW480人结肠癌细胞克隆形成的作用。
【具体实施方式】
[0026] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0027] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0028]实施例1、甘草西定、angustone A和粗毛甘草素 D的分离纯化。
[0029] 一、实验材料和方法。
[0030] 本方法中提及的所有化学试剂均购自北京化工厂。
[0031] 取35kg甘草药材（内蒙古伊利科技实业股份有限公司甘草分公司），粉碎，以10倍 量95%乙醇和70%乙醇各提取两次，每次2~3小时，减压回收乙醇，将得到的浸膏（10L)混 悬于水中，用乙酸乙酯萃取5次，得到乙酸乙酯部位2500g。取1280g乙酸乙酯部位，经硅胶柱 色谱(200~300目，青岛海洋化工有限公司）分离，石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱（1:0~1:1)， 得到流分A~J。流分E经MCI柱色谱(成都科普生物有限公司)分离，乙醇-水梯度洗脱(0:1~ 1:0)，得到流分EA~EG。流分EC经聚酰胺柱色谱(浙江台州路桥四甲生化塑料厂)分离，二氯 甲烷-甲醇梯度先脱（1 :〇~1:1)，得到流分ECA~ECN。流分ECC、ECD和ECH分别经0DS C18柱色 谱(DAIS0公司，日本)分离，甲醇-水梯度洗脱(0:1~1:0)，再经半制备HPLC(Agilent公司， 美国）纯化，得到angustone A 70mg，粗毛甘草素 D 14mg，甘草西定900mg。
[0032] 二、实验结果。
[0033] 将得到的三个化合物的核磁共振谱图与文献对比，分别鉴定为甘草西定(杨莉等， 天然产物研究与开发。2009, 448, 438-440)、angustone A(Lane GA 等， Phytochemistry · 1987，26，295-300)和粗毛甘草素 D(Zeng L等，Heterocycles · 1992，34， 375-387)，它们的核磁共振氢谱(? NMR)和碳谱(13C NMR)如图1~6所示。
[0034]实施例2、甘草西定、angustone A和粗毛甘草素 D抑制多种癌细胞活力。
[0035] 一、实验材料和方法。
[0036] HepG2人肝癌细胞、SW480人结肠癌细胞、A549人肺癌细胞、MCF7人乳腺癌细胞均购 自美国菌种保存中心(ATCC)，所有实验均采用处于对数生长期的细胞。
[0037] (1)细胞接种于96孔板12小时后，分别加入指定甘草化合物至终浓度为ΙΟμΜ，继续 培养24小时，再向每孔加入MTS溶液至终浓度为0.5mg/mL，继续培养2~4个小时，然后用自 动酶标仪于490nm测定各孔吸光度，计算其相对于对照组的抑制率。
[0038] (2)细胞接种于96孔板12小时后，分别加入指定甘草化合物至指定浓度，继续培养 24小时，再向每孔加入MTS溶液至终浓度为0.5mg/mL，继续培养2~4个小时，然后用自动酶 标仪于490nm测定各孔吸光度，根据各化合物在指定浓度下相对于对照组的抑制率计算其 半数抑制浓度(IC 5Q)值。
[0039] 二、实验结果。
[0040]