如表1所示，三种化合物在ΙΟμΜ浓度下均能显著抑制HepG2人肝癌细胞、SW480人结 肠癌细胞、A549人肺癌细胞、MCF7人乳腺癌细胞的活力。进一步的量效关系研究结果显示， 除了粗毛甘草素 D对A549细胞的IC5Q值为12.9μΜ外，其余所有测试得到的IC5Q值均低于10μ Μ，其中甘草西定对HepG2细胞的IC 5Q值甚至低于ΙμΜ，达到了 300ηΜ。这些结果显示，甘草西 定、angustone Α和粗毛甘草素 D具有显著抑制多种癌细胞活力的活性，可用于制备抗癌药 物。
[0041] 表1、甘草西定、angustone A和粗毛甘草素 D抑制HepG2人肝癌细胞、SW480人结肠 癌细胞、A549人肺癌细胞、MCF7人乳腺癌细胞活力。
[0042]
[0043] 实施例3、甘草西定和angustone A抑制SW480细胞增殖、诱导SW480细胞凋亡。
[0044] 一、实验材料和方法。
[0045] (1)SW480细胞接种于6孔板12小时后，分别加入甘草西定或angustone A至指定浓 度，继续培养24小时，收集所有漂浮和贴壁的细胞，加入lmL 70%的乙醇，-20°C固定过夜。 将固定好的细胞200g离心5分钟，弃去上清，加入lmL的PBS(中科迈晨科技有限公司），吹打 均勾，再次离心。然后加入含有5yg/mL的碘化丙啶(PI)和100yg/mL的RNase(北京博雅创新 科技发展有限公司），37°C孵育30分钟，采用FASCAN流式细胞仪(Beckon Dickenson公司，美 国）测定，激发波长为488nm，发射波长为630nm〇
[0046] (2)SW480细胞接种于6孔板12小时后，分别加入甘草西定或angustone A至指定浓 度，继续培养6小时，收集所有漂浮和贴壁的细胞，加入lmL的PBS(中科迈晨科技有限公司）， 吹打均匀，再次离心。然后加入400此Annexin V(北京欣生科科技有限公司）结合液将细胞 混悬，再加入5yL Annexin V-FITC(北京欣生科科技有限公司），室温避光孵育15分钟后，再 加入10yL碘化丙啶(PI，北京欣生科科技有限公司），冰上避光孵育10分钟。采用FASCAN流式 细胞仪(Beckon Dickenson公司，美国）测定红色和绿色的焚光情况。
[0047] 二、实验结果。
[0048] (l)MTS法检测细胞活力下降的原因主要分为两类:细胞增殖减少或细胞死亡增 加。首先，我们通过流式细胞术碘化丙啶(PI)染色的方法测定了甘草西定对SW480周期的作 用。如图7所示，甘草西定可以明显的阻滞SW480细胞分裂的G1/S期，且呈剂量依赖性。在10μ Μ时，基本上已经没有处于G2分裂期的细胞了。这些数据表明甘草西定可以抑制肿瘤细胞的 增殖。angustone Α则主要是诱导凋亡而不影响细胞周期分布。
[0049] (2)然后，我们采用一种常用的可以追踪细胞凋亡的方法即Annexin V/PI双染色 的方法来评价甘草西定对S W 4 8 0细胞凋亡的影响。如图8所示，对照组的S W 4 8 0细胞被 Annexin V和PI高染的比例很低，当给予浓度梯度的甘草西定处理6小时后，高染细胞的比 例浓度依赖性的升高。其中，Annexin V高染的部分指示了凋亡初始阶段细胞膜上磷酯酰丝 氨酸的外翻，而对于双高染的部分，则指示细胞通透性的变化，一般认为是晚期凋亡的标 志。这些数据表明甘草西定和angustone A均可以诱导肿瘤细胞的凋亡。
[0050] 实施例4、angustone A抑制SW480细胞体外克隆形成。
[00511 一、实验材料和方法。
[0052] 对数生长期的SW480稀释到浓度为20~40个/ml，六孔板每孔接种2.5ml。待细胞贴 壁后，分别使用0,0.1，0.5，1，2.5,5以1&1^118切1^八处理4811后，换成正常的完全培养基继 续培养10天左右至Control组的克隆增殖到大约50个细胞时，固定并用结晶紫染色后对每 孔的克隆数进行计数。得到的克隆数经过拟合计算出angustone A抑制克隆形成的IC5Q值。 [0053] 二、实验结果。
[0054]克隆形成实验可以反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状，因此常被用作 为在体外评价抗肿瘤药物的细胞毒活性的金标准。我们也采用克隆形成实验来评价 angustone A抑制肿瘤生长的作用。
[0055] 实验结果如图10所示。通过计数，得到angustone A浓度为0，0.1，0.5,1，2.5,5μΜ 的时候，克隆数为97，78，52，32，12，0。通过拟合后得到的IC5Q为0.50±0.06μΜ。上述结果显 示angustone Α具有良好的抗肿瘤活性和成药前景。
[0056] 实施例5、甘草西定、angustone A和粗毛甘草素 D抑制PTP1B活性。
[0057] -、实验材料和方法。
[0058] 本方法中所提及的酶或试剂，除特殊说明外，均购自Sigma-Aldrich公司（美国）。
[0059] 我们参考文献建立了PTP1B活性的检测方法(Elchebly M，Science.l999,283， 1544-1548) WTP1B可催化对硝基苯磷酸二钠（pNPP)脱磷酸产生对硝基苯酚，该产物在 405nm有光吸收，可用于监测PTP1B酶活性。具体的反应缓冲液组成为50mM的HETOS(pH = 7.2)，ImM的EDTA以及5mM的二硫苏糖醇(DTT)。反应在96孔板中进行，每个反应体系总体积 为200yL，包含O.lyg的PTPlB，2mM的pNPP以及指定浓度的甘草化合物。反应体系在37°C下孵 育30分钟，然后加入10yL 10M的NaOH溶液终止反应，用自动酶标仪于405nm测定各孔吸光 度，并计算其相对于对照组的抑制率。
[0060] 二、实验结果。
[0061] 如表2所示，上述三种化合物在25μΜ浓度下对PTP1B的抑制率均接近100%，其中 angustone Α对ΡΤΡ1Β的IC5Q值为0.4μΜ。上述结果说明这些化合物对ΡΤΡ1Β活性有显著的抑 制作用，可用于制备ΡΤΡ1Β抑制剂。由于ΡΤΡ1Β在体内可通过对胰岛素受体或其底物上的酪 氨酸残基去磷酸化作用对胰岛素信号转导进行负调节，因此是抗糖尿病药物的重要靶点， 而上述活性化合物则可用于制备抗糖尿病药物。此外，ΡΤΡ1Β也参与了癌症发生发展，其抑 制剂在抗癌方面具有巨大潜力，因此上述化合物抑制ΡΤΡ1Β的活性也进一步支持了它们用 于制备抗癌药物的用途。
[0062] 实施例6、粗毛甘草素 D抑制酪氨酸酶活性。
[0063] 一、实验材料和方法。
[0064]本方法中所提及的酶或试剂，除特殊说明外，均购自Sigma-Aldrich公司（美国）。 [0065]我们参考文献建立了酪氨酸酶的活性检测方法（N e r y a 0等， Phytochemistry. 2004,65，1389-1395)。具体的反应缓冲液为45mM的磷酸钠缓冲液(pH = 6.6)，反应在96孔板中进行。每个反应体系的总体积为200yL，包含9.99U的酪氨酸酶，ImM的 L-酪氨酸以及指定浓度的甘草化合物。反应体系在37°C下孵育15分钟，然后用自动酶标仪 于492nm测定各孔吸光度，计算其相对于对照组的其抑制率;进一步的，根据不同浓度的粗 毛甘草素 D抑制酪氨酸酶活性的量效关系计算其IC5〇值。
[0066] 二、实验结果。
[0067]如表2所示，粗毛甘草素 D在20μΜ浓度下对酪氨酸酶的抑制率为100 %，其IC5Q值仅 为Ο.ΙμΜ，说明粗毛甘草素 D对酪氨酸酶有非常强的抑制作用，可用于制备酪氨酸酶的抑制 剂。酪氨酸酶是皮肤中黑色素合成的关键酶，酪氨酸酶抑制剂能够抑制体内黑色素的合成， 具有祛斑美白的作用。因此，粗毛甘草素 D也可用于制备祛斑美白的药物或护肤品。
[0068] 实施例7、甘草西定、angustone Α和粗毛甘草素 D抑制AChE活性。
[0069] 一、实验材料和方法。
[0070]本方法中所提及的酶或试剂，除特殊说明外，均购自Sigma-Aldrich公司（美国）。 [0071] 我们参考文献建立了 AChE的活性检测方法(Rhee IK等，Phy tochem. Anal. 2003， 14，145-149)。具体的反应缓冲液为3〇11^的1^8-!1(：1缓冲液(？!1 = 8.0)，反应在96孔板中进 行。每个反应体系的总体积为200yL，包含6.25 X 10-5U的AChE，0.1 mM的5，5 ' -二硫代双(2-硝 基苯甲酸）（DTNB)，0.02mM的碘化硫代乙酰胆碱(ATCI)以及一定浓度的甘草化合物。反应体 系在室温下孵育10分钟，然后用自动酶标仪于405nm测定各孔吸光度，计算其相对于对照组 的抑制率;进一步的，根据不同浓度的指定化合物抑制AChE活性的量效关系计算其IC 5〇值。 [0072] 二、实验结果。
[0073] 如表2所示，上述三种化合物在25μΜ浓度下均能显著抑制AChE活性，抑制率均超过 50%;其中甘草西定的抑制率最高(82%)，其IC5Q值为15.5μΜ。上述结果说明这三种化合物 可用于制备AChE抑制剂。AChE在体内选择性地水解乙酰胆碱生成胆碱和乙酸，降低胆碱能 神经的生理效应，AChE抑制剂可作为抗胆碱酯酶药物用于治疗神经系统退行性疾病如阿尔 兹海默病等疾病;因此，上述三种化合物可用于制备抗胆碱酯酶药物用于治疗相关疾病。 [0074] 表2、甘草西定、angustone A和粗毛甘草素 D抑制PTP1B、酪氨酸酶和AChE的活性。
[0075]
【主权项】
1. 式I至3所示的化合物或其药学上可接受的盐、醋、溶剂化物、立体异构体、互变异构 体、前药中的至少一种或混合物在制备抗癌药物或抗糖尿病药物中的应用：2. 权利要求1中所述应用，其特征在于所述抗癌为抗肝癌、肺癌、肠癌和/或乳腺癌。3. 式1至3所示的化合物或其药学上可接受的盐、醋、溶剂化物、立体异构体、互变异构 体、前药中的至少一种或混合物在制备PTPlB抑制剂中的应用。4. 式1至3所示化合物或其药学上可接受的盐、醋、溶剂化物、立体异构体、互变异构体、 前药中的至少一种或混合物在制备乙酷胆碱醋酶抑制剂或抗胆碱醋酶药物中的应用。5. 式2所示化合物或其药学上可接受的盐、醋、溶剂化物、立体异构体、互变异构体、前 药中的至少一种或混合物在制备酪氨酸酶抑制剂及桂斑美白产品中的应用。
【专利摘要】本发明公开了甘草中一类异戊烯基异黄酮类化合物的医药新用途。发明人通过对甘草化学成分和活性筛选的系统研究，从中发现了一类结构相近的异戊烯基异黄酮类化合物，包括甘草西定（licoricidin）、angustone？A和粗毛甘草素D（glyasperin？D），具有抑制癌细胞增殖和抑制酪氨酸蛋白磷酸酶1B（protein？tyrosine？phosphatase？1B，PTP1B）的显著活性，同时甘草西定和粗毛甘草素D具有抑制乙酰胆碱酯酶（acetylcholine？esterase，AChE）的显著活性，粗毛甘草素D还具有抑制酪氨酸酶（tyrosinase）的显著活性。基于以上发现，这些活性化合物或其药学上可接受的盐、酯、溶剂化物、立体异构体、互变异构体、前药以及其混合物可用于制备抗癌药物、PTP1B抑制剂和抗糖尿病药物、酪氨酸酶抑制剂和祛斑美白产品、AChE抑制剂和抗胆碱酯酶药物等。
【IPC分类】A61K31/353, A61K31/352, A61P35/00, A61Q19/02, A61P25/28, A61P3/10, A61K8/49
【公开号】CN105582005
【申请号】CN201510918824
【发明人】叶敏, 余四旺, 季帅, 李紫薇, 王永瑞, 唐叔南, 乔雪
【申请人】北京大学
【公开日】2016年5月18日
【申请日】2015年12月11日