一种包含cxcr3 抗体的碳纳米管光声造影剂及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物领域，特别涉及一种包含CXCR3抗体的碳纳米管光声造影剂及其制备方法。
【背景技术】
[0002]光声成像是近年来发展起来的一种新型生物医学成像方法。当脉冲激光照射到生物组织中时，组织的光吸收域将产生光声信号，生物组织的光声信号携带了组织的光吸收特征信息，通过测量光声信号能重建出组织中的光吸收分布图象。光声成像结合了纯光学成像高对比度特性和纯超声成像高穿透深度特性的优点，从原理上避开了光散射的影响，突破了高分辨率光学成像深度“软极限”(?Imm)，可实现50mm的深层活体内分子成像。由于肿瘤组织和正常组织对光吸收的差异(在近红外激光的照射下，癌变组织和周围正常组织的光吸收差异至少5倍以上)和不同生理状态的生物组织对光的吸收不同，利用光声成像就可以反映了组织的结构特征，同时还可能反映组织的代谢状态、病变特征、甚至神经活动。因此，光声成像必将带来生物医学影像领域的一次革新。
[0003]碳纳米管(CNTs)独特的分子结构决定了它具有优异的力学、热学、光学以及电磁性能，近年来，碳纳米管在生物医学方向的潜在应用逐渐成为新的热点。CNTs在近红外光区能产生强烈的荧光，可以在复杂的生物体环境中被检测，但是要求碳管本身结构完整，同时需要呈单分散，这就在一定程度上限制了其应用，而且纯的碳纳米管在生物体有一定的毒性。
[0004]CXCR3蛋白在正常组织/细胞，原位胆囊癌组织/细胞及胆囊癌转移组织/细胞中的表达水平依次递增，且与临床预后密切相关，CXCR3在高转移潜能的胆囊癌细胞及胆囊癌转移灶中高表达，其在在多种肿瘤细胞中也表现出表达异常，并且其可能在肿瘤细胞的发生、演进、异质化、增殖、细胞周期、侵袭转移及耐药性等恶性生物学行为方面扮演重要角色
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题是为了克服现有的碳纳米管材料分散度不高，对生物体具有一定毒性的缺点，提供了一种包含CXCR3抗体的碳纳米管光声造影剂及其制备方法。
[0006]因此，本发明是通过下述技术方案来解决上述技术问题:
[0007]本发明采取的技术方案之一为:一种包含CXCR3抗体的碳纳米管光声造影剂的制备方法，所述制备方法包括以下步骤:
[0008](I)将氯金酸溶液与多胺基阳离子聚合物溶液混合避光搅拌0.5-1.5小时，之后于85°C _95°C保持0.5-1.5小时，制得纳米金溶液；
[0009](2)伴随超声、搅拌，将羧基化多壁碳纳米管溶液逐滴加入步骤(I)所得的纳米金溶液中，滴加完成后超声20-30分钟，搅拌30-60分钟使之充分混合，之后在55°C _65°C保持20-36小时，制得纳米金-支化聚乙稀亚胺-碳纳米管溶液，在所得纳米金-支化聚乙稀亚胺-碳纳米管溶液中逐滴加入巯基化聚乙二醇溶液，超声搅拌45-50小时，制得巯基化聚乙二醇-纳米金-支化聚乙烯亚胺-碳纳米管溶液；
[0010](3)在步骤⑵所得的巯基化聚乙二醇-纳米金-支化聚乙烯亚胺-碳纳米管溶液中加入氯金酸溶液搅拌0.5-1.小时，搅拌完毕后逐滴加入硼氢化钠溶液，充分反应之后加入2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液，搅拌20-30分钟，N-羟基琥珀酸亚胺溶液，搅拌15-20分钟，充分混合后加入1-乙基-(3- 二甲基氨基丙酸)碳二亚胺盐酸盐溶液，反应20-30分钟，加入CXCR3抗体溶液，2-3小时后离心，将所得下层溶液干燥即得。
[0011]步骤(I)为:将氯金酸溶液与多胺基阳离子聚合物溶液混合避光搅拌0.5-1.5小时，之后于85°C _95°C保持0.5-1.5小时，制得纳米金溶液。本发明所述多胺基阳离子聚合物为本领域常规的多胺基阳离子聚合物，较佳地为支化聚乙烯亚胺(Branched-PEI)、支化聚丙烯酰胺(PAM)、四乙烯五胺(TEPA)或三乙烯四胺(TETA)，更佳地为支化聚乙烯亚胺，其分子量为Mnl0000-Mnl800。所述多胺基阳离子聚合物的制备方法为本领域常规制备方，或市售可得。其中步骤(I)所述搅拌的速度为常规，较佳地为150rpm。搅拌的温度为850C _95°C，较佳地为90°C。搅拌的时间为0.5-1.5小时，较佳地为I小时。其中所述氯金酸溶液的浓度较佳地为0.1-0.4mg/mL，更佳地为0.2mg/mL，所述多胺基阳离子聚合物溶液的浓度较佳地为5-20mg/mL，更佳地为10mg/mL。其中所述加热的方式为本领域常规加热方式，较佳地为油浴加热。其中所述多胺基化合物和氯金酸的质量比较佳地为50:1-300:1，更佳地为200:1，其中所得纳米金溶液中的纳米金颗粒平均直径为5-30nm，更佳地为10nm。
[0012]步骤⑵为:伴随超声、搅拌，将羧基化碳纳米管溶液逐滴加入步骤⑴所得的纳米金溶液中，滴加完成后超声20-30min，搅拌30-60min使之充分混合，之后在55°C _65°C保持20-36小时，制得纳米金-支化聚乙稀亚胺-碳纳米管溶液，在所得纳米金-支化聚乙稀亚胺-碳纳米管溶液中逐滴加入巯基化聚乙二醇溶液，超声搅拌45-50小时，制得巯基化聚乙二醇-纳米金-支化聚乙烯亚胺-碳纳米管溶液。其中所述碳纳米管较佳地为羧基化多壁碳纳米管，该羧基化多壁碳纳米管的长度较佳地为0.5-2 μ m，直径较佳地为20-30nm，羧基含量较佳地为0.5-3%，更佳地为1.23%，所述百分比为质量百分比。所述羧基化多壁碳纳米管溶液的浓度较佳地为0.3-1.2mg/mL，更佳地为0.6mg/mL，所述巯基化聚乙二醇溶液的浓度较佳地为0.5-2mg/mL，更佳地为lmg/mL。其中所述巯基化聚乙二醇为本领域常规的巯基化聚乙二醇，所述巯基化聚乙二醇的分子量较佳地为0.5-20kDa。其中所述超声的方法为本领域常规的超声分散方法，所述超声分散中的超声强度为常规的超声强度度，较佳地为 200w。
[0013]步骤(3)为:步骤(2)所得的巯基化聚乙二醇-纳米金-支化聚乙烯亚胺-碳纳米管溶液中加入氯金酸溶液搅拌0.5-1.小时，搅拌完毕后逐滴加入硼氢化钠溶液，充分反应之后加入2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液，搅拌20-30分钟，N-羟基琥珀酸亚胺溶液，搅拌15-20分钟，充分混合后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙酸)碳二亚胺盐酸盐溶液，反应20-30分钟，加入CXCR3抗体溶液，2-3小时后离心，将所得下层溶液干燥即得。其中所述硼氢化钠的纯度较佳地为95-98%，更佳地为97%，所述百分比为质量百分比。其中所述加入氯金酸与步骤(I)加入的氯金酸质量比较佳地为1:3-2:3，更佳地为2:3。其中所述搅拌的时间为本领域常规的搅拌时间，更佳地为I小时，所述搅拌的速度为常规搅拌速度，更佳地为150rpm。其中所述离心为本领域常规的离心方法，所述离心的速度较佳地为8000rpm-12000rpm，更佳地为lOOOOrpm。其中所述2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液(MES缓冲液)为本领域常规的MES缓冲液，其浓度较佳地为l_2mg/mL，更佳地为lmg/mL。所述N-轻基琥珀酸亚胺溶液(NHS溶液)为本领域常规的NHS溶液，其浓度较佳地为0.5-2mg/mL，更佳地为lmg/mL。所述1-乙基-(3- 二甲基氨基丙酸)碳二亚胺盐酸盐溶液(EDC溶液)为本领域常规的EDC溶液，其浓度较佳地为0.5-2mg/mL，更佳地为lmg/mL。所述CXCR3抗体溶液的浓度较佳地为2.5-10mg/mL，更佳地为5mg/mL。
[0014]其中巯基化聚乙二醇-纳米金-支化聚乙烯亚胺-碳纳米管与NHS的质量比较佳地为200:1-300:1，更佳地为250:1 ;巯基化聚乙二醇-纳米金-支化聚乙稀亚胺-碳纳米管与H)C的质量比较佳地为0.8:1-1.2:1，更佳地为1: 1，巯基化聚乙二醇-纳米金-支化聚乙烯亚胺-碳纳米管与CXCR3抗体的质量比较佳地为0.8:1-1.2: 1，更佳地为1:1。其中所述干燥为本领域常规的干燥方法，较佳地为真空冷冻干燥。
[0015]本发明采取的技术方案之二为:一种包含CXCR3抗体的碳纳米管光声造影剂，所述碳纳米管光声造影剂是由碳纳米管、多胺基阳离子聚合物、纳米金颗粒、巯基化聚乙二醇和CXCR3抗体通过共价结合而成。
[0016]其中所述多胺基阳离子聚合物较佳地为支化聚乙烯亚胺、支化聚丙烯酰胺、四乙烯五胺或三乙烯四胺，更佳地为支化聚乙烯亚胺。其中所述纳米金颗粒的平均直径较佳地为5-30nm，更佳地为25nm，其中所述碳纳米管较佳地是羧基化多壁碳纳米管，所述羧基化多壁碳纳米管的长度较佳地为0.5-2 μ m，直径较佳地为20-30nm，羧基含量较佳地为1.23%,所述百分比为质量百分比。其中所述CXCR3为本领域常规的CXCR3抗体，该抗体的制备方法为本领域常规制备方法或市售可得。
[0017]在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
[0018]本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0019]本发明的积极进步效果在于:本发明公开的包含CXCR3抗体的光声造影剂的制备方法是以碳纳米管、聚乙烯亚胺等多胺基阳离子聚合物、纳米金、巯基化聚乙二醇、硼氢化钠和CXCR3抗体作为原料，采用两步法合成纳米复合材料，该制备方法不仅操作简便，而且具有绿色环保等优点。本发明所述包含CXCR3抗体的碳纳米管光声造影剂在水中的分散性好，稳定性强，具有良好的生物相容性。本发明所述包含CXCR3抗体的碳纳米管光声造影剂用于光声成像技术中，不仅能产生较强的光声信号，而且还具有高度的肿瘤细胞靶向性。
【附图说明】
[0020]图1为本发明所述碳纳米管光声造影剂结构示意图。
[0021]图2为本发明所述碳纳米管光声造影剂的透射电镜图。
[0022]图3为本发明所述包含CXCR3抗体的碳纳米管光声造影剂的光声响应图。
[0023]图4为本发明所述包含CXCR3抗体的碳纳米管光声造影剂在PBS缓冲液(pH =7.4)中稳定性检测结果。
【具体实施方式】
[0024]下面通过实施例并结合附图的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。其中所述室温为常规，若无特别说明为15?35°C