粉末(纯度为97% )溶于50mL去离子水中，搅拌使之充分溶解。
[0158](10)逐滴将上述配制的硼氢化钠溶液加入到步骤(8)所得混合溶液中，充分反应。
[0159](11)在10000r/min转速下离心洗涤，以除去多余的硼氢化钠。
[0160](12)将离心所得下层溶液真空干燥24小时，即得纳米金增强的碳纳米管光声造影剂。
[0161 ] 实施例11制备包含CXCR3抗体的碳纳米管声光造影剂
[0162]称取0.5mg实施例1制备的mPEG-SH-Au-PE1-CNT加入到烧杯中，加入Iml的2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液(MES缓冲液，其浓度为2mg/mL)，pH = 4.5，磁力搅拌分散30分钟后加入0.2ml lmg/mL N-羟基琥珀酰亚胺溶液(NHS溶液)，继续搅拌15分钟，加入
0.5ml lmg/mL 1-乙基_ (3- 二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液(EDC溶液)，反应30分钟后，加入CXCR3抗体0.5mg，反应2h，反应结束后在1000r/分钟转速下离心洗涤，以除去多余的NHS，EDC和CXCR3抗体；将离心所得下层溶液真空干燥24小时，最终得到包含CXCR3抗体的碳纳米管声光造影剂。所得包含CXCR3抗体的碳纳米管光声造影剂的结构示意图如图1所示。所得包含CXCR3抗体的碳纳米管光声造影剂的透射电镜观察结果如图2所示。根据TEM图谱可以判断，所得光声造影剂中碳纳米管均匀分散，并且表面分散着纳米金颗粒。
[0163]利用所得包含CXCR3抗体的碳纳米管光声造影剂进行光声检测，所述光声检测的方法包括以下步骤:采用光声检测专用OPO脉冲激光器(美国OPOTEK公司生产)，以纯水作为对照组，并以200 — 100nm波段的连续波长激光辐照试样，通过对透射光的光谱分析，获得试样的光吸收谱。栗浦波长532nm，脉宽<2ns，重复频率1Hz ;采用的聚焦式超声传感器中心频率为15MHz，带宽80%，所得包含CXCR3抗体的碳纳米管光声造影剂的光声响应图如图3所示，结果显示本发明所得包含CXCR3抗体的碳纳米管光声造影剂具有良好的光声相应性能。
[0164]实施例12包含CXCR3抗体的碳纳米管声光造影剂的制备
[0165]称取0.5mg实施例1制备的mPEG-SH-Au-PE1-CNT加入到烧杯中，加入Iml的2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液(MES缓冲液，其浓度为lmg/mL)，pH = 4.5，磁力搅拌分散30分钟后加入0.2ml 0.5mg/mL N-羟基琥珀酰亚胺溶液(NHS溶液)，继续搅拌20分钟，加入
0.5ml 0.5mg/mL 1-乙基_ (3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液(EDC溶液)，反应30分钟后，加入CXCR3抗体0.25mg，反应3h，反应结束后在1000r/分钟转速下离心洗涤，以除去多余的NHS，EDC和CXCR3抗体；将离心所得下层溶液真空干燥24小时，最终得到包含CXCR3抗体的碳纳米管声光造影剂。
[0166]实施例13包含CXCR3抗体的碳纳米管声光造影剂的制备
[0167]称取0.5mg实施例1制备的mPEG-SH-Au-PE1-CNT加入到烧杯中，加入Iml的2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液(MES缓冲液，其浓度为lmg/mL)，pH = 4.5，磁力搅拌分散30分钟后加入0.2ml 2mg/mL N-羟基琥珀酰亚胺溶液(NHS溶液)，继续搅拌15分钟，加入
0.5ml 2mg/mL 1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液(EDC溶液)，反应30分钟后，加入CXCR3抗体lmg，反应2.5h，反应结束后在1000r/分钟转速下离心洗涤，以除去多余的NHS，EDC和CXCR3抗体；将离心所得下层溶液真空干燥24小时，最终得到包含CXCR3抗体的碳纳米管声光造影剂。
[0168]效果实施例1包含CXCR3抗体的碳纳米管声光造影剂效果体内检测
[0169](I)饲养5-6周龄裸鼠(购买自中科院上海实验动物中心)，胆囊癌NOZ细胞株(该细胞系购株买自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心)以I X 106细胞/只(PBS稀释成0.2ml)接种于裸鼠前腋皮下。
[0170](2) 4周后，取腋下肿瘤剪碎研磨，以I X 106细胞/只(PBS稀释成0.2ml)接种于裸鼠前腋皮下，建立肿瘤模型。
[0171 ] (3)接种后每天观察有无肿瘤形成及注射点有无破溃红肿，经过3?7天可见接种部位皮下出现灰白色结节，并逐渐长大，形或椭圆形，突于体表。
[0172](4)肿瘤接种两周后，采用尾部静脉方式将实施例9制备所得包含CXCR3抗体的碳纳米管声光造影剂注入裸鼠体内，碳纳米管声光造影剂的注射量为0.2ml，对照组注射实施例I制备所得未连接CXCR3的碳纳米管基造影剂。
[0173](5)利用光声成像实验方法检测所得光声造影剂的光声响应信号。利用光声检测专用OPO脉冲激光器(美国OPOTEK公司生产)，以纯水作为对照组，并以200 — 100nm波段的连续波长激光辐照试样，通过对透射光的光谱分析，获得试样的光吸收谱。栗浦波长532nm，脉宽<2ns，重复频率1Hz ;采用的聚焦式超声传感器中心频率为15MHz，带宽80%。
[0174]光声成像实验结果表明，未连接CXCR3抗体的碳纳米管基造影剂，在小鼠体内信号分布较平均，少量光声信号集中在肝、肾区域，连接CXCR3抗体的碳纳米管基造影剂可以识别肿瘤，并能使肿瘤成像，从而在接种的肿瘤部位形成明显的光声信号影像。
[0175]效果实施例2包含CXCR3抗体的碳纳米管光声造影剂稳定性检测
[0176]将羧基化多壁碳纳米管(购自成都有机化学有限公司)和本发明实施例7制备所得包含CXCR3抗体的碳纳米管光声造影剂，分散到溶剂中，其浓度分别是0.3mg/mL和
0.5mg/mL，室温储存96小时，羧基化多壁碳纳米管在储存24小时后即产生沉淀，而本发明所述包含CXCR3抗体的碳纳米管光声造影剂在同样条件下储存24小时，48小时，72小时和96小时后状态仍然十分稳定，其性状均匀，未产生任何沉淀。本发明所述包含CXCR3抗体的碳纳米管光声造影剂在PBS缓冲液(pH = 7.4)中稳定性检测结果如图4所示。从所得实验数据可见，本发明所得包含CXCR3抗体的碳纳米管光声造影剂有很好的稳定性。
[0177]应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
【主权项】
1.一种包含CXCR3抗体的碳纳米管光声造影剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤: (1)将氯金酸溶液与多胺基阳离子聚合物溶液混合避光搅拌0.5-1.5小时，之后于850C _95°C保持0.5-1.5小时，制得纳米金溶液； (2)伴随超声、搅拌，将羧基化多壁碳纳米管溶液逐滴加入步骤(I)所得的纳米金溶液中，滴加完成后超声20-30分钟，搅拌30-60分钟使之充分混合，之后在55°C _65°C保持20-36小时，制得纳米金-支化聚乙烯亚胺-碳纳米管溶液，在所得纳米金-支化聚乙烯亚胺-碳纳米管溶液中逐滴加入巯基化聚乙二醇溶液，超声搅拌45-50小时，制得巯基化聚乙二醇-纳米金-支化聚乙烯亚胺-碳纳米管溶液； (3)在步骤(2)所得的巯基化聚乙二醇-纳米金-支化聚乙烯亚胺-碳纳米管溶液中加入氯金酸溶液搅拌0.5-1.5小时，搅拌完毕后逐滴加入硼氢化钠溶液，充分反应之后加入2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液，搅拌20-30分钟，N-羟基琥珀酸亚胺溶液，搅拌15-20分钟，充分混合后加入1-乙基-(3- 二甲基氨基丙酸)碳二亚胺盐酸盐溶液，反应20-30分钟，加入CXCR3抗体溶液，2-3小时后离心，将所得下层溶液干燥即得。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(I)所述多胺基阳离子聚合物为:支化聚乙烯亚胺、支化聚丙烯酰胺、四乙烯五胺或三乙烯四胺。3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(I)所述多胺基化合物和氯金酸的质量之比为50:1-300:104.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(I)所述纳米金溶液中的纳米金颗粒平均直径为5-30nm。5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述羧基化多壁碳纳米管的长度为0.5-2 μm，直径为20-30nm，羧基含量为0.5-3%，所述百分比为质量百分比。6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述巯基化聚乙二醇的分子量为 0.5-20kDa。7.一种包含CXCR3抗体的碳纳米管光声造影剂，其特征在于，所述碳纳米管光声造影剂是由羧基化多壁碳纳米管、多胺基阳离子聚合物、纳米金颗粒、巯基化聚乙二醇和CXCR3抗体通过共价结合而成。8.如权利要求7所述的碳纳米管光声造影剂，其特征在于，所述多胺基阳离子聚合物为:支化聚乙烯亚胺、支化聚丙烯酰胺、四乙烯五胺或三乙烯四胺。9.如权利要求7所述的碳纳米管光声造影剂，其特征在于，所述纳米金颗粒的平均直径为 5_30nm。10.如权利要求7所述的碳纳米管光声造影剂，其特征在于，所羧基化多壁碳纳米管的长度为0.5-2 μm，直径为20-30nm，羧基含量为0.5-3%，所述百分比为质量百分比。
【专利摘要】本发明公开了一种包含CXCR3抗体的碳纳米管光声造影剂及其制备方法。本发明制备的造影剂是一种纳米复合材料，由碳纳米管(CNTs)、多胺基化合物、纳米金、巯基化聚乙二醇(mPEG-SH)以及CXCR3抗体共价结合形成，该制备方法具备操作简便，绿色环保等优点。本发明所述包含CXCR3抗体的碳纳米管光声造影剂在水中的分散性好，稳定性强，具有良好的生物相容性，该包含CXCR3抗体的碳纳米管光声造影剂能够产生较强的光声信号，并且具有肿瘤细胞靶向性。
【IPC分类】A61K49/00
【公开号】CN105582552
【申请号】CN201410563540
【发明人】刘颖斌, 谭庆刚, 陆巍, 谈竹君, 张一鉴, 王许安, 曹阳, 张飞, 李怀峰
【申请人】上海交通大学医学院附属新华医院
【公开日】2016年5月18日
【申请日】2014年10月21日