一种刺玫果提取物及其应用

一种刺玫果提取物及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种刺玫果提取物。该刺玫果提取物包括刺玫果皂甙、刺玫果黄酮和葡萄吡喃糖基没食子酸甲酯中的任意一种或几种组合，这三种物质占总刺玫果提取物重量的20?80％。本发明还公开了刺玫果提取物的制备方法以及在化妆品中的应用。本发明提供的刺玫果提取物，除了具有显著的抗衰老性能，还能够明显促进I型胶原蛋白的分泌，还具有良好的保湿性能以及美白和抗炎能力，可以用于化妆品和/或护肤品中，是理想的综合性化妆品和/或护肤品添加剂。
【专利说明】
一种刺玫果提取物及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物化学领域，涉及一种提取物及其制备方法和包含该提取物的化妆 品，尤其涉及一种刺玫果提取物及其制备方法和在化妆品中的应用。
【背景技术】
[0002] 山刺玫（Rosa davurica Pall ·)和伞花蔷薇（Rosa maximowicziana Regel)，俗称 刺玫果，属蔷薇目，蔷薇科小灌木，是中国高等植物之一。被欧洲各国视为"治疗坏血病特效 药"；有"维生素记录保持者"之称。主要分布于我国东北地区，其果实又名刺玫果，野蔷薇 果，民间把它作为一种营养丰富的野果大量采食，制成果酒、泡茶等，刺玫果味微酸、性温。 天然刺玫果生长在大兴安岭和小兴安岭等北方原始森林之中，无任何工业、化学、农药污 染，且刺玫果不致畸、不致癌、不致突变，为安全无毒的原料。
[0003] 传统医学已经将刺玫果列为补药，现代医学也发现，刺玫果的主要功效有健脾消 食、活血调经、敛肺止咳的作用，能够增强人体免疫力，申请号201410301358.8,发明创造名 称为:一种刺玫果分散片及其制备方法的专利公开了刺玫果分散片及其制备方法，还公开 了将刺玫果分散片用于治疗冠心病、高脂血症等。
[0004] 远古时代起，化妆品配方已有本草成分。随着科学发展，目前已有很多新型技术可 用于治疗皮肤老化。然而，天然本草产品因其高效低毒等特点仍然具有很大的吸引力和广 阔的市场。研究已证实越来越多的本草化学物质对皮肤具有益处，很多提取物和化合物具 有显著的治疗皮肤老化的潜力，并已初步阐明其机制。针对皮肤老化，天然本草产品的应用 主要针对这些目标:修复细胞外基质(ECM);抗细胞氧化应激;抗皮肤细胞早衰等。万寿菊花 提取物通过抑制透明质酸酶弹性蛋白酶MMP-1的活性，抑制皱纹产生，具有光防护作用。
[0005] 越来越多的证据表明，抗氧化剂可以预防甚至改善部分的皮肤老化。海藻糖和深 海胶原蛋白两种海洋活性提取物可提高超氧化物歧化酶(S0D)和过氧化氢酶(CAT)的活力。 甜杏仁提取物可以通过影响谷胱甘肽和脂质过氧化物，从而降低皮肤紫外线照射后的损 伤。
[0006] 虽然现有技术中也有将刺玫果应用在化妆品中的相关记载，但是其并未公开刺玫 果在化妆品中的作用，而且一般将刺玫果粉末或颗粒直接加入到化妆品，这样就会增加化 妆品的粘稠度，不利于皮肤吸收其营养物质。

【发明内容】

[0007] 本发明针对现有技术存在的问题，提供一种利用刺玫果的果实制备的刺玫果提取 物，并研究了该提取物在化妆品领域中的应用，其中，所述刺玫果可以为山刺玫（Rosa davurica Pall.)和/或伞花蔷薇(Rosa maximowicziana Regel)。
[0008] 本发明的第一个方面在于提供一种刺玫果提取物，所述刺玫果提取物包括活性组 分，所述活性组分选自刺玫果皂苷、刺玫果黄酮、维生素 C和葡萄吡喃糖基没食子酸甲酯中 的任意一种或几种组合。
[0009] 作为本发明的一个优选实施例，所述刺玫果提取物中，所述活性组分的质量含量 为6.5%-80%，优选为 10%-60%，如 15%、50%，更优选为20%-40%，如 15%、25%等。
[0010] 作为本发明的一个优选实施例，所述刺玫果提取物中，所述刺玫果皂苷的含量大 于等于10%，如15%，优选为大于等于20%，如24%、30%等。
[0011] 作为本发明的一个优选实施例，所述刺玫果提取物中，所述刺玫果黄酮的质量含 量为10%-30%，优选为15-25%，更优选为20%-25%。
[0012] 作为本发明的一个优选实施例，所述刺玫果提取物中，维生素 C的质量含量为10-60%，优选为15-45%，更优选为20-40%，如25%、35%等。
[0013] 作为本发明的一个优选实施例，所述刺玫果提取物中重金属的含量小于等于 50ppm，如40ppm，优选为小于等于30ppm，如20ppm，更优选为小于等于lOppm，如5ppm。
[0014] 作为本发明的一个优选实施例，所述刺玫果提取物中铅的含量小于等于lOppm，如 8ppm，优选为小于等于5ppm，如3ppm。
[0015] 作为本发明的一个优选实施例，所述刺玫果提取物中砷的含量小于等于5ppm，如 4ppm，优选为小于等于3ppm，如2ppm、lppm等。
[0016] 作为本发明的一个优选实施例，所述刺玫果提取物中镉的含量小于等于3ppm，如 2ppm，优选为小于等于1 ppm，如0.5ppm。
[0017] 作为本发明的一个优选实施例，所述刺玫果提取物中汞的含量小于等于lppm，如 0.8ppm，优选为小于等于0.5ppm，如0.3ppm，更优选为小于等于0. lppm，如0.05ppm。
[0018] 作为本发明的一个优选实施例，所述刺玫果提取物中微生物的含量小于等于 5000cfu/g，优选为小于等于2500cfu/g，更优选为小于等于1000cfu/g。
[0019] 作为本发明的一个优选实施例，所述刺玫果提取物的干燥失重小于等于5%。
[0020] 作为本发明的一个优选实施例，所述刺玫果提取物可以粉末和/或浸膏。
[0021] 作为本发明的一个优选实施例，所述刺玫果提取物可以是水提物、醇提物、油提 物、超临界C〇2提取物中的任意一种或几种的组合。
[0022] 作为本发明的一个优选实施例，所述醇提物优选为乙醇提取物、水提取物、临界 C〇2提取物中的一种或几种组合。
[0023] 本发明的第二个方面在于提供一种刺玫果提取物的制备方法，所述方法包括如下 步骤：
[0024]步骤1、选取清洁刺玫果粉末，以30 % -75 %的乙醇水溶液作为溶媒，提取刺玫果粉 末，得到提取液和刺玫果粉渣；
[0025]步骤2、减压浓缩提取液，以除去所述提取液中的乙醇，得到浓缩液；
[0026] 步骤3、将所述浓缩液纯化得到所述刺玫果提取物。
[0027] 作为本发明的一个优选实施例，步骤1中提取所述刺玫果粉末的次数为3-10次，提 取温度为40-90°C ;优选为提取5-8次，提取温度为60-8(TC ;每次提取2-4h，混合每次的提取 物，得到混合提取液A。
[0028] 作为本发明的一个优选实施例，步骤1中提取所述刺玫果粉末的压力为0.8-1 · 5MPa，如0 · 9MPa、1 · 4MPa;优选为 1 · 0-1 · 2Mpa，如1 · OIMPa、1 · IMPa。
[0029] 作为本发明的一个优选实施例，步骤1中所述溶媒还可以包括甲醇及其水溶液、丙 酮及其水溶液、乙醚等中的任意一种或几种组合。
[0030] 作为本发明的一个优选实施例，步骤3中所述纯化为大孔吸附树脂纯化、高效液相 色谱柱(HPLC)纯化、层析纯化、活性炭吸附和滤布过滤中的任意一种或几种组合。
[0031] 作为本发明的一个优选实施例，将提取液浓缩至原刺玫果粉末体积的3-5倍得到 浓缩液，将所述浓缩液流过层析柱进行吸附，所述层析为大孔吸附树脂吸附，吸附过程的温 度为25 °C -50 °C，优选为30 °C -40 °C，所述浓缩液的流速为2-3BV/h，大孔吸附树脂的型号为 AB-8型、D-10UADS-5中的任意一种或几种。
[0032] 作为本发明的一个优选实施例，所述浓缩液经纯化后还包括干燥步骤。
[0033] 作为本发明的一个优选实施例，所述干燥为热空气干燥、喷雾干燥、电加热干燥中 的任意一种或几种组合。
[0034]作为本发明的一个优选实施例，所述喷雾干燥过程中，高压栗在80_120MPa压力下 将所述过滤液通过雾化器形成100-200μπι的颗粒，与所述颗粒接触的热空气的温度为60-100°C，接触时间为5-50s。
[0035]作为本发明的一个优选实施例，所述刺玫果提取物为脂溶性刺玫果、水溶性刺玫 果中的任意一种或其组合，优选为脂溶性刺玫果。
[0036]本发明的第三个方面在于提供上述任意一种刺玫果提取物的应用。
[0037]所述刺玫果提取物优选为施用于皮肤外表面，更优选为应用于制备涂覆于皮肤外 表面的制品。
[0038]其中，本发明所述刺玫果提取物应用于制备日化用品，优选为应用于制备化妆品 和/或护肤品。
[0039] 其中，包含上述任意一种刺玫果提取物的日化用品，优选为包含上述任意一种刺 玫果提取物的化妆品和/或护肤品，更优选为所述化妆品和/或护肤品中，还可以包括营养 性添加剂。
[0040] 作为本发明的一个优选实施例，所述化妆品和/或护肤品中，所述刺玫果提取物的 含量为0.001%-60%，如0.003%，50%，优选为0.005%-40%，如20%、30%等。
[0041] 本发明的第四个方面在于提供一种包含上述任意一种刺玫果提取物的化妆品和/ 或护肤品，其中，所述刺玫果提取物的含量为0.001 %-60 %，如0.003 %，50 %，优选为 0.005%-40%，如20%、30%等。
[0042] 作为本发明的一个优选实施例，所述刺玫果提取物中，包括刺玫果皂苷、刺玫果黄 酮和葡萄吡喃糖基没食子酸甲酯。
[0043] 作为本发明的一个优选实施例，所述刺玫果皂苷、刺玫果黄酮和葡萄吡喃糖基没 食子酸甲酯的含量占所述刺玫果提取物总重量的20-80%。
[0044] 本发明提供的刺玫果提取物，重金属和微生物的含量均较低，且除了具有显著的 抗衰老性能，能够明显促进I型胶原蛋白的分泌，清除DPPH自由基。此外，本发明提供的刺玫 果提取物，还具有良好的保湿性能以及美白和抗炎能力，可以用于化妆品和/或护肤品中， 是理想的综合性化妆品和/或护肤品添加剂。
【附图说明】
[0045] 图1为自然状态下刺玫果提取物对HDF细胞I型胶原蛋白分泌的影响；
[0046] 图2为过氧化氢对细胞存活率的影响；
[0047] 图3为刺玫果提取物对过氧化氢损伤的HDF细胞存活率的影响；
[0048] 图4为刺玫果提取物对过氧化氢损伤的HDF细胞I型胶原蛋白分泌的影响；
[0049] 图5为刺玫果提取物对过氧化氢损伤的HDF细胞MMP-1分泌的影响；
[0050] 图6为刺玫果提取物对过氧化氢损伤的HDF细胞丙二醛含量的影响；
[00511图7为刺玫果提取物对DPPH自由基去除率的影响；
[0052]图8为刺玫果提取物对过氧化氢损伤的HaCat细胞L0R含量的影响；
[0053]图9为刺玫果提取物对酪氨酸酶的抑制作用；
[0054]图10为热灭活菌与细菌的比值对细胞中IL-Ιβ浓度的影响。
【具体实施方式】
[0055] 刺玫果提取物的制备 [0056] 实施例一
[0057]选取成熟山刺玫果实10kg，去离子水清洗2次后，使用破碎机将山刺玫果实破碎至 粒度为60目左右，加入10倍体积的去离子水，在80 °C水浴中、常压提取2h，提取结束后，再加 入60%乙醇溶液，于70°C水浴中、常压提取2h，提取结束后，混合2次的提取液，得到混合提 取液一。
[0058]选取成熟伞花蔷薇果实10kg，去离子水清洗2次后，使用破碎机将伞花蔷薇果实破 碎至粒度为60目，加入15倍体积的去离子水，在80°C水浴中、常压提取2h，提取结束后，再加 入60%乙醇溶液，于70°C水浴中、常压提取2h，提取结束后，混合2次的提取液，得到混合提 取液二。
[0059]混合提取液一和提取液二，得到总提取液，在5kPa、微沸条件下蒸发浓缩总提取液 至总提取液中不含有乙醇，得到浓缩液。使用1M盐酸调节浓缩液pH值=5,采用AB-8型大孔 吸附树脂25°C吸附浓缩液2h，然后分别采用去离子水、30%乙醇溶液和70%乙醇溶液洗脱 大孔吸附树脂，洗脱液的流速为3BV/h。混合三次洗脱得到的洗脱液并5kPa、微沸条件下减 压蒸发至3kg，得到的产物即为刺玫果提取物。分析该刺玫果提取物中各组分的含量，其中， 总黄酮采用紫外-可见分光光度法在500nm波长处检测，维生素采用液相色谱-共振瑞利散 射检测，C18色谱柱，柱温为30°C，以pH=2.0的6mM醋酸-醋酸钠：甲醇= 76:24(体积比)为流 动相，0.2mL/min的流速等度洗脱，焚光检测器以λθχ = λθχ = 330nm测定共振瑞利散射的信 号强度。结果如下：
[0060] 1、理化指标：
[0061 ] 色泽:浅黄色 [0062]形状:溶液
[0063] 灰分：3%
[0064] 皂苷：5%
[0065] 维生素 C: 20 %
[0066] 总黄酮：10%
[0067] 铅：彡0.0003 %
[0068] 砷：彡0.0001 %
[0069] 镉：彡0.0001 %
[0070] 汞：<0.00001 %
[0071] 2、微生物指标：
[0072] 总菌数：彡 l〇〇〇cfu/g
[0073] 酵母和霉菌量：<l〇〇cfu/g
[0074] 大肠杆菌:未检出 [0075]沙门氏菌:未检出
[0076]金黄色酿脓葡萄球菌:未检出 [0077] 实施例二
[0078] 选取成熟刺玫果10kg，去离子水清洗2次后，使用破碎机将刺玫果破碎至粒度为80 目左右，加入10倍体积的70%乙醇水溶液在65°C水浴中提取5次，将5次提取所得滤液混合， 得到混合滤液。减压蒸发浓缩混合滤液，以除去其中的乙醇。1M硫酸调节浓缩液pH值=5,采 用AB-8型大孔吸附树脂吸附浓缩液2h，然后分别采用去离子水、30%乙醇溶液和70%乙醇 溶液洗脱大孔吸附树脂，流速为2BV/h。混合洗脱液，减压蒸发浓缩，去除其中的乙醇，得到 浓缩液，采用ZTC-5大孔吸附树脂再次纯化，洗脱液分别为70%乙醇溶液、80%乙醇溶液和 95%乙醇溶液，25°C、以洗脱液的流速为2BV/h的条件下洗脱，每种洗脱液的用量为浓缩液 的3倍体积，混合三次洗脱液，并于5kPa、微沸条件下蒸发，除去其中的乙醇，剩余的溶液喷 雾干燥后制备得到刺玫果提取物，其中，喷雾干燥的条件为:高压栗在120MPa压力下将灭菌 的浓缩液经雾化器形成300μπι的颗粒，雾化后的小颗粒在80°C热空气条件下干燥20s。分析 该刺玫果提取物中各组分的含量，其中，总黄酮采用紫外-可见分光光度法在500nm波长处 检测，维生素采用液相色谱-共振瑞利散射检测，C18色谱柱，柱温为30°C，以pH = 2.0的6mM 醋酸-醋酸钠：甲醇=76:24(体积比）为流动相，0.2mL/min的流速等度洗脱，荧光检测器以λ ex = λθχ = 330nm测定共振瑞利散射的信号强度。分析结果如下：
[0079] 1、理化指标：
[0080] 色泽:棕黄色
[0081] 形状:粉末状
[0082] 干燥失重：4%
[0083] 粒度：100%穿过80目筛
[0084] 灰分：3%
[0085] 疯牛病或口蹄疫:未检出
[0086] 皂苷：30%
[0087] 维生素 C: 40 %
[0088] 总黄酮：20%
[0089] 铅：彡0.0003 %
[0090] 砷：彡0.0001 %
[0091] 镉：彡0.0001 %
[0092] 汞：<0.00001 %
[0093] 2、微生物指标：
[0094] 总菌数：彡 l〇〇〇cfu/g
[0095] 酵母和霉菌量：<l〇〇cfu/g
[0096] 大肠杆菌:未检出 [0097]沙门氏菌:未检出
[0098]金黄色酿脓葡萄球菌:未检出 [0099] 实施例三
[0100]选取成熟伞花蔷薇果实10kg，去离子水清洗2次后，使用破碎机将伞花蔷薇果实破 碎至粒度为60目，加入10倍体积的去离子水，在80°C水浴中、1.2MPa提取2h，提取结束后，再 加入50%甲醇溶液，于70°C水浴中、1.2MPa提取2h，提取结束后，混合2次的提取液，得到混 合提取液。
[0101] 在5kPa、微沸条件下蒸发浓缩提取液至提取液中不含有甲醇，得到浓缩液。1M盐酸 和1M硫酸等体积混合后，调节浓缩液pH值=5,采用AB-8型大孔吸附树脂25°C吸附浓缩液 2h，然后分别采用去离子水、30%乙醇溶液和70%乙醇溶液洗脱大孔吸附树脂，洗脱液的流 速为3BV/h。混合三次洗脱得到的洗脱液并5kPa、微沸条件下减压蒸发制备成浸膏，得到的 产物即为刺玫果提取物。分析该刺玫果提取物中各组分的含量，其中，总黄酮采用紫外-可 见分光光度法在500nm波长处检测，维生素采用液相色谱-共振瑞利散射检测，C18色谱柱， 柱温为30 °C，以pH = 2.0的6mM醋酸-醋酸钠：甲醇=76:24 (体积比）为流动相，0.2mL/min的 流速等度洗脱，焚光检测器以AeX = Aex = 330nm测定共振瑞利散射的信号强度。结果如下：
[0102] 1、理化指标：
[0103] 色泽:黄色 [0104]形状:膏状
[0105] 干燥失重：3%
[0106] 灰分：2%
[0107] 疯牛病或口蹄疫:未检出
[0108] 皂苷：10%
[0109] 维生素 C: 40 %
[0110]总黄酮：25%
[0111] 铅：彡0.0003%
[0112] 砷：彡0.0001%
[0113] 镉：彡0.0001%
[0114] 汞：<0.00001%
[0115] 2、微生物指标：
[0116] 总菌数:彡 l〇〇〇cfu/g
[0117] 酵母和霉菌量:<l〇〇cfu/g [0118]大肠杆菌:未检出
[0119] 沙门氏菌:未检出
[0120] 金黄色酿脓葡萄球菌:未检出
[0121] 实施例四
[0122] 选取成熟山刺玫的果实10kg，去离子水清洗2次后，使用破碎机将刺玫果破碎至粒 度为80目左右，加入8倍体积的60 %乙醇水溶液和8倍体积的60 %甲醇水溶液，在70°C水浴、 1. IMPa压力下提取4次，将4次提取所得提取液液混合，得到混合提取液。减压蒸发混合提取 液，得到浓缩液，以除去其中的有机溶剂。1M硫酸调节浓缩液pH值=4,采用ADS-5型大孔吸 附树脂吸附浓缩液2h，然后分别采用去离子水、30%乙醇溶液和70%乙醇溶液洗脱大孔吸 附树脂，流速为3BV/h。混合三种洗脱液并减压蒸发浓缩，去除其中的乙醇，依次采用去离子 水、30 %乙醇溶液和60 %乙醇溶液在大孔吸附树脂上纯化，在10kPa、30°C旋转蒸发30min， 去除其中的乙醇，得得到的浓缩液在60°C下喷雾干燥至恒重，得到刺玫果提取物。其中，喷 雾干燥的条件为：高压栗在80MPa压力下将浓缩液经雾化器形成150μπι的颗粒，雾化后的小 颗粒在80°C热空气条件下干燥50s。分析该刺玫果提取物中各组分的含量，其中，总黄酮采 用紫外-可见分光光度法在500nm波长处检测，维生素采用液相色谱-共振瑞利散射检测， C18色谱柱，柱温为30°C，以pH= 2.0的6mM醋酸-醋酸钠：甲醇=76 :24(体积比）为流动相， 0.2mL/min的流速等度洗脱，焚光检测器以λθχ = λθχ = 330ηηι测定共振瑞利散射的信号强 度。结果如下：
[0123] 1、理化指标：
[0124] 色泽:棕黄色
[0125] 形状:粉末状
[0126] 干燥失重:3%
[0127] 粒度:100%穿过100目筛
[0128] 灰分:2%
[0129] 疯牛病或口蹄疫:未检出
[0130] 皂苷：20%
[0131] 维生素 C:20%
[0132] 总黄酮：20 %
[0133] 葡萄吡喃糖基没食子酸甲酯:30%
[0134] 铅：彡0.0003%
[0135] 砷：彡0.0001%
[0136] 镉：彡0.0001 %
[0137] 汞：<0.00001%
[0138] 2、微生物指标：
[0139] 总菌数：彡 l〇〇〇cfu/g
[0140] 酵母和霉菌量：<l〇〇cfu/g
[0141] 大肠杆菌:未检出
[0142] 沙门氏菌:未检出
[0143] 金黄色酿脓葡萄球菌:未检出
[0144] 实施例五
[0145] 选取伞花蔷薇的成熟果实10kg，去离子水清洗2次后，使用破碎机将刺玫果破碎至 粒度为80目左右，加入8倍体积的60 %乙醇水溶液在70°C水浴、1.5MPa压力下提取4次，得到 提取液和刺玫果渣，然后向刺玫果渣中加入8倍体积的60 %甲醇水溶液，在70 °C水浴、 1.5MPa压力下提取4次，将8次提取所得提取液混合，得到混合提取液。减压蒸发混合提取 液，得到浓缩液，以除去其中的有机溶剂。1M盐酸调节浓缩液pH值=4,采用D-101型大孔吸 附树脂吸附浓缩液2h，然后分别采用去离子水、30%乙醇溶液和50%乙醇溶液洗脱大孔吸 附树脂，流速为3BV/h。混合三种洗脱液并减压蒸发浓缩，去除其中的乙醇，得到的浓缩液在 80°C下喷雾干燥至恒重，制备得到刺玫果提取物。其中，喷雾干燥的条件为：高压栗在 lOOMPa压力下将浓缩液经雾化器形成200μπι的颗粒，雾化后的小颗粒在70°C热空气条件下 干燥30s。分析该刺玫果提取物中各组分的含量，其中，总黄酮采用紫外-可见分光光度法在 500nm波长处检测，维生素采用液相色谱-共振瑞利散射检测，C18色谱柱，柱温为30°C，以pH =2.0的6mM醋酸-醋酸钠：甲醇=76:24(体积比）为流动相，0.2mL/min的流速等度洗脱，荧 光检测器以A ex = Aex = 330nm测定共振瑞利散射的信号强度。结果如下：
[0146] 1、理化指标：
[0147] 色泽:棕黄色
[0148] 形状:粉末状
[0149] 干燥失重：3%
[0150] 粒度:100%穿过100目筛
[0151] 灰分:2%
[0152] 疯牛病或口蹄疫:未检出
[0153] 皂苷:20%
[0154] 维生素 C: 50 %
[0155] 总黄酮：20%
[0156] 葡萄吡喃糖基没食子酸甲酯:30%
[0157] 铅：彡0.0003%
[0158] 砷：彡0.0001%
[0159] 镉：彡0.0001 %
[0160] 汞：彡0.00001%
[0161] 2、微生物指标：
[0162] 总菌数：彡 l〇〇〇cfu/g
[0163] 酵母和霉菌量：<l〇〇cfu/g
[0164] 大肠杆菌:未检出
[0165] 沙门氏菌:未检出
[0166] 金黄色酿脓葡萄球菌:未检出
[0167] 其中，本发明中使用山刺玫、伞花蔷薇的果实均能提取得到本发明所述的刺玫果 提取物，可以根据具体要求，选择两种原料中的任意一种或两种作为原料制备刺玫果提取 物。
[0168] 对比实施例
[0169] 取成熟刺玫果5kg，向其中加入10倍量水提取2次，每次2h，合并提取液，浓缩、干 燥，制备得到刺玫果水提取物。
[0170] 取成熟刺玫果5kg，向其中加入10倍量水提取2次，每次2h，合并提取液，浓缩至提 取液约为10L，放凉，加入乙酸乙酯提取3次，每次5L，合并乙酸乙酯提取液，55°C减压蒸发回 收乙酸乙酯至干，加入适量70%乙醇溶解后，加入糊精拌样，干燥，制成1:15(8卩lkg提取物 相当于15kg成熟刺玫果）的乙酸乙酯提取物。
[0171]将水提取物和乙酸乙酯提取物混合后用水饱和正丁醇萃取3次，每次5L，合并正丁 醇提取液，70°C、0.7MPa蒸发正丁醇提取液至恒重，加入70%乙醇溶解后，加入糊精拌样，干 燥，制成1:15 (即lkg提取物相当于15kg成熟刺玫果）的正丁醇提取物0.53kg。分析该刺玫果 提取物中各组分的含量，其中，总黄酮采用紫外-可见分光光度法在500nm波长处检测，维生 素采用液相色谱-共振瑞利散射检测，C18色谱柱，柱温为30°C，以pH = 2.0的6mM醋酸-醋酸 钠：甲醇=76:24 (体积比)为流动相，0.2mL/min的流速等度洗脱，焚光检测器以λθχ = λθχ = 330nm测定共振瑞利散射的信号强度。结果如下：
[0172] 1、理化指标：
[0173] 色泽:棕黄色
[0174] 形状:粉末状
[0175] 干燥失重:3%
[0176] 粒度：100%穿过80目筛
[0177] 灰分:3%
[0178] 疯牛病或口蹄疫:未检出
[0179] 皂苷：20%
[0180] 维生素 C: 15%
[0181] 总黄酮：20%
[0182] 葡萄吡喃糖基没食子酸甲酯:20%
[0183] 铅：彡0.0003%
[0184] 砷：彡0.0001 %
[0185] 镉：彡0.0001 %
[0186] 汞：<0.00001%
[0187] 2、微生物指标：
[0188] 总菌数：彡 l〇〇〇cfu/g
[0189] 酵母和霉菌量：<l〇〇cfu/g
[0190] 大肠杆菌:未检出
[0191] 沙门氏菌:未检出
[0192] 金黄色酿脓葡萄球菌:未检出
[0193] 刺玫果提取物对HDF细胞和Hacat细胞存活率的影响
[0194] 取对数生长期、浓度为105个/mL的人HDF细胞，将细胞接种于96孔细胞培养板中， 每孔细胞液i〇〇yL。最终所铺的细胞孔数取决于样品数，每孔设3个复孔。
[0195] 将96孔板置于37 °C的细胞培养箱中贴壁培养6h。
[0196] 将终浓度为lmg/mL、0.1mg/mL和0.01mg/mL的本发明提供的刺玫果提取物加入到 实验组的细胞培养板中，向对照组加入等体积的细胞培养液。于37°C、包含5%C02的细胞培 养箱中孵育48h。
[0197] 然后向每孔中加入0 · 5mg/mL的MTTlOOyL，于37°C、包含5 %⑶2的细胞培养箱中黑 暗条件下孵育4h。去除上清液，加入150yL DMS0，震荡以570nm为实验波长，630nm为参照波 长，检测吸光度。
[0198] 计算细胞存活率，结果如表1所示：
[0199] 表1，刺玫果提取物对人HDF细胞和人HaCat细胞存活率的影响
[0200]
[0201]以细胞存活率高于80%为对人HDF细胞和Hacat细胞无毒的标准，由表1可知，本发 明提供的刺玫果提取物对人HDF细胞无毒的最高浓度为0.01mg/mL，对人Hacat细胞无毒的 最高浓度为〇. 01mg/mL，因此，确定刺玫果提取物的浓度0.0 lmg/mL为后续的试验浓度。 [0202] 刺玫果提取物的抗衰老性能 [0203]自然状态下刺玫果提取物对HDF胶原蛋白分泌的影响
[0204]为了考察本发明提供的刺玫果提取物对HDF胶原蛋白分泌的影响，本实施例分为 空白组、实验组1、实验组2、对照实验组和标准组。
[0205]取对数生长期、浓度为105个/mL细胞，每孔100yL，于37°C、含有C02的细胞培养箱中 培养24h，之后取出上清液，以3000rpm的速度离心10min，取上清液。
[0206] 向标准组中加入50yL标准液，向实验组1中加入10yL上清液和40yL本发明实施例 一提供的刺玫果提取物的稀释液，向实验组2中加入10yL上清液和40yL本发明实施例五提 供的刺玫果提取物的稀释液，向对照实验组中加入l〇yL上清液和40yL采用对比实施例提供 的刺玫果提取物的稀释液，空白组中不加样品，分别于37°C孵育lh，并洗板5次，每组样品设 3个复孔。
[0207]向五组样品中分别加入生物素标记的抗-lgG抗体50yL，于37°C温育30min，洗涤5 次。
[0208]向五组样品中分别加入50yL的链霉素和素-HRP，轻轻震荡混匀，于37 °C温育 30min，洗涤5次。
[0209] 向五组样品中分别加入显色剂A和显色剂B各50yL，轻轻震荡混匀，于37°C避光孵 育30min，向五组样品中加入终止液50yL。
[0210]以空白组调零，在终止反应后15min内，在450nm波长测量各组的吸光度，结果如表 2和图1所示。
[0211]表2,刺玫果提取物对I型胶原蛋白分泌的影响 [0212]
[0213] 胶原蛋白主要包括I型胶原和III型胶原，外界诱导促使真皮细胞中氧化水平提高 是细胞损伤的主要因素，氧化水平提高的直接结果是降低了 I型胶原蛋白的表达及I型胶原 蛋白被基质金属蛋白酶MPP-1降解，两种情况造成的结果均为I型胶原蛋白在皮肤中的含量 减少，而I型胶原蛋白含量减少是皮肤形成皱纹的主要原因。
[0214] 由表2可知，向HDF细胞中加入本发明提供的刺玫果提取物后，皮肤中的I型胶原蛋 白含量近似为不加刺玫果时的1.3倍，为加入采用现有技术制备的刺玫果时的1.2倍，说明 本发明提供的刺玫果提取物相对于现有技术，能够更加促进I型胶原蛋白的表达，并进而起 到抗老化的效果，可以作为潜在的抗老化添加剂添加到化妆品中。
[0215] 过氧化氢对HDF细胞存活率的影响
[0216] 选取不同浓度的过氧化氢，如 50μΜ、100μΜ、200μΜ、400μΜ、600μΜ、800μ]\^Ρ1000μΜ， 与HDF细胞共同孵育不同时间，如3h、6h和9h等，采用ΜΤΤ法检测不同浓度的过氧化氢对HDF 细胞存活率的影响。
[0217] 取培养至浓度为1〇5个/mL的HDF细胞，接种于96孔细胞培养板，每孔100yL。于37 °C、含有C〇2的培养箱中贴壁培养6h，每板做复孔3个。
[0218]使用不同浓度的过氧化氢分别孵育造模3h、6h和9h;向每个样品孔中加入浓度为 0.5mg/mL的MTT 100yL，于37°C、含有C02的培养箱中，黑暗条件下孵育4h。
[0219] 去除上清液，向样品中加入150yL DMS0,震荡，以570nm为实验波长，630nm为参照 波长，检测每个样品的吸光度，计算细胞存活率。
[0220] 测试结果如图1所示，人HDF细胞于浓度为50-800μΜ的过氧化氢共孵育3-9h后，人 HDF细胞的存活率明显下降，当孵育浓度超过400μΜ时，细胞存活率低于50% dOOyM过氧化 氢作用6h后，细胞存活率降到70 %。
[0221] 刺玫果提取物对过氧化氢损伤的HDF细胞存活率的影响
[0222] 本测试分为实验组1、实验组2、对照实验组和空白组。
[0223] 取培养至密度为105个/mL的HDF细胞接种于96孔板，每孔100yL。于37°C，含有C0 2的 培养箱中贴壁培养6h。
[0224] 向实验组1中加入本发明实施例一提供的刺玫果提取物，向实验组2中加入本发明 实施例五提供的刺玫果提取物，向对照实验组中加入采用对比实施例所述方法制备的刺玫 果提取物，空白组不加样品。
[0225] 利用过氧化氢损伤建模，向每孔中加入0.5mg/mL的MTT 100yL，于37 °C、5 %⑶2的 黑暗条件下孵育4h。去除上清液，加入DMS0 150yL，震荡检测吸光度，计算细胞存活率。
[0226] 如图3所示，经过过氧化氢孵育后，HDF细胞的存活率降低至70 %以下，而向经过氧 化氢损伤过的HDF细胞中加入本发明实施例一提供的刺玫果提取物后，人HDF细胞的存活率 达到89.22%，向经过氧化氢损伤过的HDF细胞中加入实施例五提供的刺玫果提取物后，人 HDF细胞的存活率达到91.53%，向经过氧化氢损伤过的HDF细胞中加入现有技术制备的刺 玫果提取物后，人HDF细胞的存活率为82.16%，即本发明提供的刺玫果提取物相对于现有 技术制备的刺玫果提取物能够显著减轻过氧化氢对HDF细胞的损伤，起到修复人体受损细 胞的作用。
[0227] 刺玫果提取物对过氧化氢损伤的HDF细胞胶原蛋白分泌的影响
[0228] 本试验分为空白组、实验组1、实验组2、对照试验组、阴性对照组和阳性对照组。
[0229] 取培养至密度为105个/mL的HDF细胞接种于24孔细胞培养板中，每孔lmL，每孔设3 个复孔。于37 °C，含有C02的培养箱中贴壁培养6h。
[0230] 空白组、阴性对照组中不加入样品，实验组1中加入本发明实施例一提供的刺玫果 提取物，实验组2中加入本发明实施例五提供的刺玫果提取物，对照实验组加入采用对比实 施例制备的刺玫果提取物，向阳性对照组中加入维甲酸。
[0231] 实验组1、实验组2、阳性对照组和对照实验组利用过氧化氢损伤建模。
[0232] 向五组试验中的每孔加入0.5mg/mL的MTT 100yL，于37°C、5 % C02的黑暗条件下孵 育4h。去除上清液，加入DMSO 150yL，震荡检测吸光度，计算胶原蛋白含量，结果如表3和图4 所示：
[0233] 表3,刺玫果提取物对过氧化氢损伤的HDF细胞胶原蛋白分泌的影响
[0234]
[0235]
[0236] 由表3和图4可知，经过过氧化氢损伤后，HDF细胞I型胶原蛋白分泌量变为未损伤 时的73.67 %，如阴性对照组所示。向经过氧化氢损伤过的HDF细胞中加入维甲酸后，HDF细 胞中I型胶原蛋白的分泌量提高至94%，如阳性对照组所述。向经过过氧化氢损伤的HDF细 胞中加入本发明实施例一提供的刺玫果提取物后，人HDF细胞中I型胶原蛋白的含量达到 97.11%，超过阳性对照组中的I型胶原蛋白含量，加入本发明实施例二提供的刺玫果提取 物后，I型胶原蛋白的含量上升至87.11 %。而向经过氧化氢损伤过的HDF细胞中加入现有技 术制备的刺玫果提取物后，人HDF细胞中I型胶原蛋白的含量为80.27%，低于阳性对照组和 实验组1、实验组2中I型胶原蛋白的含量，即本发明提供的刺玫果提取物相对于现有技术制 备的刺玫果提取物，具有超强的修复细胞损伤的能力，能够显著修复过氧化氢对HDF细胞造 成的损伤，是优良的抗衰老化妆品添加剂。
[0237] 刺玫果提取物对过氧化氢损伤的HDF细胞MMP-1的影响
[0238] 材料与试剂
[0239]细胞培养液 24孔细胞培养板
[0240]细胞培养箱 过氧化氢
[0241] 离心机 ELISA试剂盒
[0242] 测试步骤
[0243] 本测试分为标准组、空白组、实验组1、实验组2和对照实验组。
[0244] 取对数生长期的浓度为105个/mL的HDF细胞接种于24孔培养板中，每孔lmL，于37 °C，含有C0 2的细胞培养箱中培养6h。
[0245] 向实验组1加入本发明实施例一提供的刺玫果提取物，向实验组2加入本发明实施 例五提供的刺玫果提取物，向对照实验组中加入采用对比实施例所述方法制备的刺玫果提 取物，向标准组加入标准物，空白组不添加样品。
[0246] 诱导建立过氧化氢损伤模型。小心吸取上清液培养基，离心，按照试剂盒说明书， 取10yL细胞悬液进行实验。以空白孔调零，在反应终止后15min内，用450nm波长测量各孔的 吸光度。根据标准品对应的MMP-1的浓度及对应的吸光度值，计算出标准曲线的直线回归方 程，再根据样本的吸光度值，在回归方程上计算出实验组中MMP-1的浓度，结果如表4和图5 所示。
[0247] 表4，刺玫果提取物对过氧化氢损伤HDF细胞MMP-1浓度的影响
[0248]
[0249] 经过过氧化氢刺激后，HDF细胞中的MMP-1水平显著上升至正常细胞MMP-1含量的 167.21 %。向经过过氧化氢刺激的HDF细胞中加入维甲酸后，MMP-1的值降低到了 125.1 %。 加入本发明实施例一提供的刺玫果提取物后，MMP-1的含量降低至156%。加入本发明实施 例五提供的刺玫果提取物后，MMP-1的含量降低至102 %，接近HDF细胞的正常水平，而加入 采用现有技术制备的刺玫果提取物后，MMP-1的含量降低至160%。这说明，在氧化应激条件 下，本发明提供的刺玫果提取物与现有技术制备的刺玫果提取物相比，具有更优异的抑制 MMP-1表达的性能。
[0250] 刺玫果提取物对过氧化氢损伤的HDF细胞中丙二醛(MDA)的影响
[0251] MDA在酸性条件下加热时，可与硫代巴比妥酸(TBA)缩合，形成红色产物3，5，5-三 甲基恶唑-2，4-二酮，在532nm处有最大吸收峰。因底物为硫代巴比妥酸(TBA)，故称此法为 TBA 法。
[0252] 本测试分为实验组、对照实验组和空白组。
[0253] 取对数生长期、浓度为105个/mL的HDF细胞，接种于6孔细胞培养板，每孔2mL，培养 6h〇
[0254] 向实验组加入经新鲜培养基稀释的本发明实施例五制备的刺玫果提取物，向向对 照实验组加入经新鲜培养基稀释的采用对比实施例所述方法制备的刺玫果提取物，空白组 不加样品。
[0255] 诱导建立过氧化氢损伤模型。以lOOOrpm离心10min，收集培养基上清液中的细胞 及贴壁细胞，在细胞沉淀中加入500yL PBS，轻轻颠倒混匀，于4°C下，以2000rpm离心10min， 弃除上清液留存底部沉淀。向沉淀中加入500yL roS，超声破碎细胞(400A，5s/次，间隙10s 反复3~5次），制备细胞匀浆；
[0256] 按照试剂盒说明书进行实验。将试剂混匀，用保鲜膜将试管口扎紧，用针头刺孔透 气，用锅开盖煮沸40min，取出后流水冷却，以4000rpm离心10min，使沉淀完全。取上清液，采 用分光光度法测定532nm波长处的吸光度;利用BCA蛋白检测试剂盒，按照说明书方法将本 发明制备的刺玫果提取物稀释适当倍数，测定细胞中的蛋白质含量。
[0257] 表4，刺玫果提取物对过氧化氢损伤的HDF细胞MDA含量的影响
[0258]
[0259] 由表4和图6可知，标准物对应的MDA含量为100%，过氧化氢损伤后，MDA浓度快速 上升，6h时MDA含量增加至原来的326%，而向过氧化氢损伤后的细胞中加入维甲酸后，MDA 的增加得到抑制。向经过过氧化氢损伤的HDF细胞中加入本发明提供的刺玫果提取物后， MDA含量明显降低至151.85%，而加入采用现有技术制备的刺玫果提取物后，经过氧化氢损 伤的HDF细胞中MDA的含量为272%，说明本发明提供的刺玫果提取物能够显著降低受损细 胞中MDA含量，修复受损细胞。
[0260] 刺玫果提取物对DPPH自由基的影响
[0261] 1，1_二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)是一种很稳定的氮中心的自由基，它的稳定性 主要来自3个苯环的共振稳定作用及空间障碍，使夹在中间的氮原子上不成对的电子不能 发挥其应有的电子成对作用。作为一种稳定的自由基，其可以清除其他的自由基。目前广泛 用于定量测定生物试样和食品的抗氧化能力。此法是根据DPPH自由基有单电子，在517nm处 有一强吸收，其醇溶液呈紫色的特性。当有自由基清除剂存在时，由于与其单电子配对而使 其吸收逐渐消失，其褪色程度与其接受的电子数量成定量关系，因而可用分光光度计进行 快速的定量分析。
[0262] 材料与试剂
[0263] DPPH 无水乙醇
[0264] dd 水 200yL 吸头
[0265] 96孔板 8通道加样枪
[0266] 酶标仪
[0267] 测试步骤
[0268] 用无水乙醇配置0.2mmol/L的DPPH溶液，避光保存，配置0.01mg/mL的表没食子儿 茶素没食子酸酯(EGCG)溶液，。
[0269] 向实验组添加20uL浓度为0.01mg/mL本发明实施例一提供的刺玫果提取物溶液和 0.2mmo 1 /L的DPPH乙醇溶液180uL至96孔板中，向空白组1中添加180uL无水乙醇与20uL本发 明提供的刺玫果提取物溶液，向标准组中添加180uL DPPH溶液与20uL蒸馏水，每孔设置至 少3个复孔，分别摇匀，室温下暗处静置30min，测定各组的吸光度。
[0270]向对照试验组添加20uL浓度为0.01mg/mL采用现有技术制备的刺玫果提取物溶液 和0.2mmol/L的DPPH乙醇溶液180uL至96孔板中，向空白组2中添加180uL无水乙醇与20uL采 用现有技术制备的刺玫果提取物溶液，每孔设置至少3个复孔，分别摇匀，室温下暗处静置 30min，测定各组的吸光度。
[0271] DPPH自由基的清除能力按下式表示：
[0272]
[0273] 其中，计算实验组的DPPH清除率时，测试样吸光度为实验组的吸光度，空白组吸光 度分别为空白组1的吸光度；
[0274] 计算对照实验组的DPPH清除率时，测试样吸光度为对照实验组的吸光度，空白组 吸光度为空白组2的吸光度；
[0275] 清除率越大表明抗氧化能力越强，结果如图7所示，当溶液中不存在DPPH自由基 时，空白组的DPPH清除率为0，EGCG对DPPH自由基的去除率为47.23%，本发明提供的刺玫果 提取物对DPPH自由基的去除率为90.45%，采用现有技术制备的刺玫果提取物对DPPH自由 基的去除率仅为12.27%，说明本发明制备的刺玫果提取物相对于现有技术，具有更优异的 DPPH清除率。
[0276] 综上，本发明提供的刺玫果提取物具有优异的抗衰老和修复受损细胞的能力，可 以作为抗衰老添加剂加入到化妆品中。
[0277] 刺玫果提取物的保湿性能
[0278] 皮肤内水分的含量的多少，直接影响皮肤的弹性、光泽度等，皮肤的表皮、真皮、皮 下组织均对皮肤维持水分起着不同的作用。在皮肤保湿过程中，主要有两种机制影响皮肤 对水的维持作用：
[0279] 1)皮肤作为天然屏障，避免水分流失；
[0280] 皮肤表皮是人的天然屏障，其中透明层、颗粒层和角质层对皮肤锁水能力起到重 要作用。透明层含有磷脂类物质和角质蛋白，能够防止水分及电解质等透过皮肤。颗粒层的 细胞排列致密，对贮存水分、防止水分渗透具有重要的作用。角质层是由角质形成细的坚 韧、有弹性的板层结构，细胞内充满了角蛋白。
[0281] 2)皮肤中存在许多保湿因子，吸收和锁住水分。
[0282]在皮肤真皮层中，透明质酸(HA)是含量较多的氨基多糖，HA粘稠度极高且能高比 例地结合水分子，HA的含量直接影响皮肤中水分的含量。作为皮肤内重要的保湿成分，它对 皮肤细胞的增殖、分化有显著作用，对维持皮肤细胞的正常新陈代谢至关重要。
[0283] 角质层是由角质形成细胞构成的坚韧有弹性的板层结构，细胞内充满了角蛋白。 角蛋白是非水溶性的硬蛋白，有阻止化学物质内渗和体液外渗的作用，其中含量最高的角 蛋白叫做兜甲蛋白，约占角蛋白的80 %，兜甲蛋白的含量会直接影响皮肤水分的流失状况。
[0284] 本试验通过考察HaCat细胞兜甲蛋白（L0R)的表达来考察本发明提供的刺玫果提 取物的保湿性能。本测试分为空白组、实验组1、实验组2、对照试验组和标准组。
[0285] 取对数生长期的浓度为105个/mL的Hacat细胞，将培养的细胞接种于24孔板中，每 孔细胞液lmL，于37°C、含有C0 2的细胞培养箱中培养6h。
[0286] 向实验组1细胞液中加入一定量本发明实施例一提供的刺玫果提取物，向实验组2 细胞液中加入一定量本发明实施例五提供的刺玫果提取物，向对照实验组中加入一定量对 比实施例制备的刺玫果提取物，置于37°C、含有5%C0 2及饱和湿度的细胞培养箱中分别培 养 24h;
[0287] 弃除上清液，用预冷roS冲洗细胞两次，在培养孔中加入100yL裂解液，冰上裂解细 胞lOmin，收集细胞裂解液，以13000rpm离心10min，取上清液备用。
[0288] 按照ELISA试剂盒说明书，取细胞裂解液进行试验；
[0289] 利用BCA试剂盒检测不同组别蛋白质含量，各组L0R表达量采用蛋白量矫正，结果 如表5和图7所不。
[0290] 表5，刺玫果提取物对过氧化氢损伤的HaCat细胞L0R表达的影响
[0291]
[0292]由表5和图7可知，添加本发明提供的刺玫果提取物后，人HaCat细胞中L0R含量能 比不添加本发明提供的刺玫果提取物和添加现有技术制备的刺玫果提取物均有增高，且比 未添加刺玫果时的HaCat细胞中L0R含量高75 %左右，而现有技术制备的刺玫果提取物对应 的HaCat细胞中L0R含量比未添加刺玫果时的高26%。说明本发明提供的刺玫果提取物保湿 性比现有技术制备的刺玫果提取物的保湿性能更好。
[0293] 刺玫果提取物的美白作用
[0294] 酪氨酸酶是黑素合成的主要限速酶，通过抑制酪氨酸酶的活性，可以减少黑素的 生成，酪氨酸酶活性检测方法有:放射性同位素法、免疫学法和生化酶学法，以生化酶学法 较为简单成熟。生化酶学法测定酪氨酸酶活性抑制的原理是:酪氨酸或多巴酸在酪氨酸酶 的作用下转化为多巴醌，通过比色法测定判断酪氨酸酶活性的抑制率，该方法通过体外测 定酪氨酸酶的活性，简单快捷。
[0295] 材料与试剂
[0296] 蘑菇酪氨酸酶 PH值=6.8的磷酸盐缓冲液
[0297] 左旋多巴（L-DOPA) 200yL 吸头
[0298] 96孔板 8通道加样枪
[0299] 酶标仪
[0300] 操作步骤
[0301] 测定本发明实施例一提供的刺玫果提取物的酪氨酸酶抑制作用
[0302] 本测试分为空白组、空白参照组、实验组和实验参照组。
[0303]配制质量浓度为0.1 %的L-D0PA水溶液，配制pH值=6.8的磷酸盐缓冲溶液。
[0304]向实验组中加入5yL浓度为0. lmg/mL的本发明实施例一提供的刺玫果提取物，向 实验参照组中加入5yL浓度为0.1mg/mL的本发明实施例一提供的刺玫果提取物和45yL pH 值=6.8的磷酸盐缓冲溶液，向空白参照组加入5yL蘑菇酪氨酸酶的磷酸盐溶液，和45yL pH 值=6.8的磷酸盐缓冲溶液，向空白组加入50yL pH值=6.8的磷酸盐缓冲溶液。
[0305] 置于37 °C空气浴中20min，向每孔加入50yL、质量浓度为0.1 %的L-D0PA水溶液，于 37°C空气浴中静置20min，于475nm下测定每组的吸光度值，并计算本发明实施例一提供的 刺玫果提取物对蘑菇酪氨酸酶的活性抑制率。
[0306]
[0307]采用相同的测试方法计算本发明实施例五提供的刺玫果提取物、采用对比实施例 (现有技术)制备的刺玫果提取物以及阳性对照组曲酸对酪氨酸酶的抑制率。
[0308]结果如图9所示，本发明提供的刺玫果提取物对蘑菇酪氨酸酶的抑制率分别为 90.45%和80.63%，抑制率均在80%以上，甚至超过90%，实施例一制备的刺玫果提取物对 蘑菇酪氨酸酶的抑制率未92.86%，而具有较高美白活性的曲酸，其对酪氨酸酶的抑制率为 69%，采用现有技术制备的刺玫果提取物对蘑菇酪氨酸酶的抑制率为58.23%，说明本发明 提供的刺玫果提取物具有优异的美白作用，可以作为添加剂添加到化妆品中。
[0309] 刺玫果提取物的抗炎作用
[0310]性激素紊乱、皮脂腺痤疮丙酸杆菌的大量繁殖、皮脂腺导管的异常角化、皮脂的大 量分泌、炎症等反应会导致痤疮的发生。祛痘化妆品也一般以抑制痤疮的发病为因素为目 标。
[0311] IL-Ιβ是一种促炎性细胞因子，由单核-巨噬细胞在摄取抗原抗体复合物或者抗原 呈递过程中产生。大量分泌时，主要通过刺激使T细胞和B细胞活化，同时诱导环氧化酶2、磷 脂酶A2、一氧化氮合成酶、粘附分子等效应蛋白的表达，参与炎性反应。同时，在多种细胞 中，IL-8和TNF-α皆可由外源IL-Ιβ诱导产生。
[0312]痤疮丙酸杆菌在毛囊内定植及侵袭后，机体的免疫细胞，如单核细胞，可能通过其 模式识别受体，如Toll样受体等，对痤疮丙酸杆菌识别后，通过激活多种信号途径，诱导一 系列天然及获得性免疫应答来抵抗其入侵。通过释放多种促炎因子及趋化因子，如IL-Ιβ、 IL-8、TNF_a等，招募各种免疫细胞，如中性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞等，聚集于入侵的 局部，来杀灭致病性的痤疮丙酸杆菌，导致受累毛囊炎症的发生。
[0313] 建立抗炎祛痘模型
[0314]将人单核细胞THP-1细胞培养于含10%胎牛血清、100单位/mL青霉素和100yg/mL 链霉素的RPMI-1640培养基中，置于37 °C、含有5 %C02及饱和湿度的培养箱培养，每2-3天传 代一次。
[0315]取指数生长期的细胞，用培养液调节细胞密度约为1 X 1〇6个/mL，接种于96孔培养 板中，取厌氧条件下培养72h的痤疮丙酸杆菌，离心，用PBS溶液清洗3-4次，在80°C水浴条件 下加热30min制成活菌悬液或热灭活菌悬液。按细菌:细胞分别为1:1、10:1和100:1的比例 将制备的活菌悬液或热灭活菌悬液加入96孔板中，以不加药物孵育为阴性对照，以只加 PBS 溶液为空白对照。置于37 °C恒温，5 % C02及饱和湿度的培养箱培养24h。采用ELI SA法测细胞 上清中IL-1邱勺含量变化。
[0316] ELISA法检测IL-Ιβ含量的步骤如下：
[0317] (1)确定本次检测所需的已包被抗体的酶标板孔数目，并增加1孔作为TMB空白显 色孔。
[0318] (2)将1000pg/mL、100pg/mL、50pg/mL、25pg/mL、12·5pg/mL、6·25pg/mL、3·12pg/mL 和1.56pg/mL的标准品各0. lmL依次加入一排7孔中，1孔只加刺玫果提取物稀释液的作为零 孔。向培养孔中加入l〇〇yL已用刺玫果提取物稀释液稀释的刺玫果提取物，于37°C反应 90min〇
[0319] (3)除去酶标板内的液体，将准备好的抗人IL-Ιβ抗体工作液按每孔O.lmL依次加 入，TMB空白显色孔除外，于37°C反应60min。
[0320] (4)除去酶标板内的液体，使用PBS洗涤3次，每次浸泡lmin左右。
[0321] (5)将准备好的ABC工作液按每孔O.lmL依次加入，TMB空白显色孔内不加 ABC工作 液，于37°C反应30min。
[0322] (6)除去酶标板内液体，PBS洗涤5次，每次浸泡1 -2min左右。
[0323] (7)按每孔90yL依次加入已在37°C平衡30min的TMB显色液，37°C避光反应25min。
[0324] (8)按每孔0· lmL依次加入TMB终止液。
[0325] (9)用酶标仪在450nm测定0D值。
[0326] (10)根据各孔的吸光度值在标准曲线上找出对应的IL-1邱勺浓度。
[0327] 采用不同浓度的P.acnes(热灭活菌和活菌)刺激THP-1细胞不同时间时，测得细胞 上清液中IL-1邱勺含量如图10所示，当细菌浓度较低或是热灭活时，IL-W的分泌量较少，当 选择活菌，菌浓度较高时，细胞上清液中IL-Ιβ含量较多，变化显著。因此，后续实验中选用 活细菌:细胞= 100:1，孵育24h。
[0328] 刺玫果提取物对THP-1细胞存活率的影响
[0329 ] 本发明采用噻唑兰(MTT)法检测刺玫果提取物对THP-1细胞增殖的影响。
[0330]将本发明提供的刺玫果提取物用DMS0配制成100mg/mL的母液冻存，备用。
[0331] 测试开始前，取配制好的母液20yL，向母液中加入980yL细胞培养液，配制成2mg/ mL的储备加药浓度。
[0332] 取指数生长期的细胞，用培养液调节细胞密度至2 X104个/mL，将培养后的细胞接 种于96孔细胞培养板中，每孔设3个复孔。
[0333] 向检测组的培养孔中加入不同终浓度的本发明提供的刺玫果提取物，使每孔中刺 玫果提取物的终浓度分别为lmg/mL、0. lmg/mL和0.Olmg/mL，孵育48h，对照组的培养孔中不 加样品，孵育48h。
[0334] 向每孔中加入20yL浓度为5mg/mL的MTT，保证每孔内MTT的终浓度为0.5mg/mL，将 培养板置于含有C02的培养箱中继续培养4h，以3000rpm/min转速离心后，小心吸除培养孔 内的上清液，向每孔中加入lOOyLDMSO，震荡lOmin，使结晶物完全溶解后，放置于酶标仪上， 选取570nm为测量波长，630nm为参照波长测量每孔样品的吸光度值，并计算细胞存活率，细 胞存活率的计算公式如下：
[0335]
[0336] 采用MTT法测试了药物对细胞的毒性作用，其目的在于找出一个合适的安全剂量 范围，测试结果如表6所示。
[0337] 表6,不同浓度刺玫果提取物下人THP-1细胞的存活率
[0338]
[0339] 以THP-1细胞存活率高于80%为对人THP-1细胞无毒的标准，由表6可知，本发明提 供的刺玫果提取物对人THP-1细胞无毒的最高浓度为lmg/mL。
[0340] 刺玫果提取物对炎症因子IL-W的影响
[0341] 当THP-1细胞发生炎症反应时，会特异性产生IL-Ιβ，因此，可以用IL-Ιβ的含量间 接反映 THP-1细胞发生炎症的程度。
[0342] 具体测试方法如下：
[0343] 将THP-1细胞培养于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100yg/mL链霉素的RPMI-1640培养基中，置于37°C、含5%C0 2及饱和湿度的培养箱中培养，每2-3天传代一次。
[0344] 取指数生长期的THP-1细胞，用培养液调节细胞密度至1 X 106/mL，接种于96孔细 胞培养板中，向实验组1的细胞培养板中加入本发明实施例一提供的刺玫果提取物，向实验 组2的细胞培养板中加入本发明实施例五提供的刺玫果提取物，向对照实验组的细胞培养 板中加入对比实施例中制备的刺玫果提取物，孵育4h。
[0345] 取厌氧培养72h的痤疮丙酸杆菌，离心，用PBS溶液清洗3-4次，制成活菌悬液，按细 菌:细胞= 100:1的比例加入96孔板中，以不加药物孵育为阴性对照组，以只加 ros溶液为空 白组。置于37°C、5%⑶2及饱和湿度的培养箱中培养24h。采用ELISA法测细胞上清中IL-Ιβ 的含量变化，IL-W的抑制率采用如下公式计算：
[0346]
[0347] 结果如表7所示：
[0348] 表7，刺玫果提取物对IL-Ιβ分泌抑制率的影响
[0349]
[0350]~以对IL-Ιβ的抑制率在60%以上作为抗炎效果明显的标准，此时抗炎药物可以有_ 效降低由痤疮丙酸杆菌诱导上调的炎症因子的释放，减弱痤疮周围T、B细胞等的活化以及 中性粒细胞等的聚集，减少由于抗原入侵导致的局部发热、肿胀，从而达到减轻炎症甚至消 炎的目的。由表7可知，本发明提供的刺玫果提取物对IL-Ιβ分泌的抑制率均接近70%或高 于70%，说明本发明提供的刺玫果提取物对IL-1邱勺分泌具有明显的抑制作用。而采用现有 技术提取的刺玫果提取物，对IL-Ιβ分泌的抑制率为58.26%，明显低于本发明提供的刺玫 果提取物的抗炎效果。
[0351]综上所述，本发明提供的刺玫果提取物具有明显的抗氧化性、保湿性和抗炎性，可 以作为添加剂应用到化妆品中，此外，该刺玫果提取物还可以作为保健品、药品等应用在相 应领域。
[0352]以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限 制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和 替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和 修改，都应涵盖在本发明的范围内。
【主权项】
1. 一种护肤用品，其特征在于，所述护肤用品中包括刺玫果提取物，所述护肤用品中所 述刺玫果提取物的含量为0.001 %-60 %。2. 根据权利要求1所述的护肤用品，其特征在于，所述刺玫果提取物包括活性组分，所 述活性组分选自刺玫果皂苷、刺玫果黄酮、维生素 C和葡萄吡喃糖基没食子酸甲酯中的任意 一种或几种组合;所述刺玫果提取物中，所述活性组分的质量含量为6.5 % -80 %。3. -种刺玫果提取物，其特征在于，所述刺玫果提取物包括活性组分，所述活性组分选 自刺玫果皂苷、刺玫果黄酮、维生素 C和葡萄吡喃糖基没食子酸甲酯中的任意一种或几种组 合。4. 根据权利要求3所述的刺玫果提取物，其特征在于，所述刺玫果提取物中，所述活性 组分的质量含量为6.5%_80%。5. -种如权利要求3或4所述刺玫果提取物的制备方法，其特征在于，所述方法包括如 下步骤： 步骤1、选取清洁刺玫果粉末，以30 %-75 %的乙醇水溶液作为溶媒，提取刺玫果粉末， 得到提取液和刺玫果粉渣； 步骤2、减压浓缩提取液，以除去所述提取液中的乙醇，得到浓缩液； 步骤3、将所述浓缩液纯化得到所述刺玫果提取物。6. 根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤1中提取所述刺玫果粉末的压力 为0.8-1.5MPa。7. 根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤3为，将所述浓缩液纯化、干燥，得 到所述刺玫果提取物。8. 根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤1中所述溶媒还包括甲醇及其水 溶液、丙酮及其水溶液、乙醚等中的任意一种或几种组合。9. 一种如权利要求3或4所述刺玫果提取物的应用，其特征在于，将所述刺玫果提取物 制备成施用于皮肤外表面的制品。10. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述制品中所述刺玫果提取物的含量为 0.001%-60%〇
【文档编号】A61Q19/02GK105997702SQ201610520559
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月5日
【发明人】洪民华, 刘丹, 洪奇, 吕智, 卢艳花, 何浩, 郭苗苗, 朱理
【申请人】上海相宜本草化妆品股份有限公司, 华东理工大学