专利名称：用于微生物分析的装置的制作方法
用于微生物分析的装置 本发明涉及一种用于对可能含有微生物的载体进行微生物分析的装置，以便检测
是否存在那些微生物。 —种分析这样的载体的方法由如下操作构成在用所谓的荧光团(flurogen)或 荧光团标记物标记了微生物之后，通过分析那些微生物发出的荧光来检测微生物的存在。
这些标记物仅在它们事先被微生物中包含的化学酶激活时才具有发荧光的特性。
这些标记物一般包括荧光团基团以及能够隐蔽或防止荧光团基团的荧光显示出 来的基团。在微生物存在时，其酶的效果是使该第二基团改性，从而可以检测到第一基团的 荧光。 于是，如图7的光谱53和54所示，当被这样标记的微生物受到适当的激发光作用
时，荧光基团可以以吸收光谱53吸收光能并以特征荧光发射光谱54释放能量，其中所述光
谱53的顶点53'在波长A 2处，所述光谱54的顶点54'在波长A 3处，不同于入2。 为了观察到具有这种标记物的微生物发射的荧光，已知的用于微生物分析的装置
(与显微镜一体，例如在美国申请US 2007/0153372中)包括为了借助荧光检测由荧光试剂
标记的微生物的存在而适于照明分析载体的照明装置，和用于观察对照明装置发射的光响
应的来自载体的光的窗口。 本发明涉及提供用于检测荧光的装置，相对于现有技术的装置，具有更好的性能 并且更实用。 为此，提供一种用于载体的微生物分析的装置，载体适于含有由荧光试剂标记的
微生物，其包括为了通过荧光检测所述标记的微生物的存在而适于照明所述载体的照明设
备以及用于观察响应于由所述照明设备产生的激发光而由所述载体发射的光的窗口 ；其特
征在于所述照明设备包括两个基板，每个基板上安装至少一组光源，该组中的所述光源彼
此规则地间隔开从而形成照明所述载体的阵列，所述基板被固定到所述装置的框架上，所
述框架中形成的开口的每边上各有一个以便允许由所述载体发射的光透过所述观察窗，所
述基板在所述装置中用于接收所述载体的预定位置的方向上向彼此倾斜。 根据本发明的具有装置的光源的两个基板，相对彼此倾斜并朝着分析载体指向
(当它被放置于装置上时)，这使得有可能在被照明载体的整个表面上获得对称和均匀的
照明，因为光源产生的激发光从开口的两边都发射，其中提供开口是为了观测响应激发光
而发射的光。 那两个基板每一个都具有以规则阵列排列的光源组，这个事实有助于在载体的整 个表面形成特别均匀的照明。 由此，这种结构使得能够照明比对于现有技术中与显微镜成为一体的装置的更大 尺寸的载体，同时以这样的对比度维持均匀照明，即能很容易地用肉眼或其它图像传感器 确定微生物的存在。 特别地，这使得当保持在可以观察到对光源产生的激发光响应而发射的光的开口 的最佳和中央位置时照明例如微孔膜成为可能。 根据对于制造和使用来说由于简化和方便而优选的特征
3
_每个所述光源具有在以预定波长为中心的相同光谱；和/或
_所述光源是发光二极管。 根据其它优选特征，每个所述基板相对于用于接收所述载体的所述预定位置倾斜 40° -50°的角度。 意外地，这证明了一个事实，即板相对于载体倾斜[40° -50° ]的值的范围导致 对于微生物检测中读取便利性而言的最佳性能。 更特别的，在这个值的范围中，屏蔽效应现象(来自通过观察窗的外部光线的散 射)和反射现象(来自分析载体上的光的反射)明显被最小化。 换句话说，就对比度、均一性和明亮度而言，在这个值的范围中得到最佳图象绘 制。 根据另一个优选特征，每个阵列中心和在所述装置中用来接收所述载体的所述预 定位置之间的高度随所述载体而变。 根据另一个优选特征，每个所述阵列的中心位于距离用来接收所述载体的所述预 定位置39. 75mm-69. 75mm的高度处。 这证明了一个事实，假定特别是对试剂分析载体中理想的尺寸即这个高度范围提 供了很好的平衡，使得在微生物简易检测读取的对比度和便利性方面保持良好的性能的同 时，还获得了紧凑装置。
根据其它优选特征-除了所述光源组，被指定为第一组，以外，每个基板上还安装了另一组光源，被指 定为第二组，所述第二组的所述光源同样彼此规则地间隔开，以形成用于照明所述载体的 第二阵列。-对于每个基板，所述第一和第二阵列的中心重合；
-所述第一和第二阵列在彼此内部交错；-对于每个基板，所述照明设备包括用于所述光源发射的光的漫射体。
-每个漫射体都是其上一个面被喷砂的玻璃板；
-所述观察窗包括适于允许最长波长通过的滤波器；
-所述观察窗包括多个滤波器；-所述滤波器属于滑动地安装在所述框架上的滑块；-所述照明设备适于照明整个用于接收所述载体的所述预定位置；和/或
-所述分析载体是微孔薄膜。 参考附图，从通过优选但非限制性范例的方式给出的以下描述中将明了本发明的 特征和优点，附图中 _
图1是根据本发明的装置的图示；-图2是该装置的透视图，在其旁边示出了装置中用于分析的滤波器单元；
-图3和4分别是从下方获得的透视图以及从该装置的对称正中平面截取的正截 面图；-图5是该装置两个印刷电路板之一的透视图，其上固定了两组发光二极管，每组 发光二极管都以预定波长发射光；-图6是根据本发明的装置的另一个实施例的透视-图7示出了根据本发明的装置的不同光学构件的光谱图以及该装置用于标记微生物的荧光团试剂的光谱图，沿x轴线为共同比例的波长，沿y轴线为共同比例的相对光强； 在借助图7所示光谱图详述其工作模式之前，现在将借助图1到5给出根据本发明的装置的优选实施例的描述。 图1到5所示的装置1包括外壳2、由两个照明构件4形成的照明设备3、滑动牵引器5和观察窗口 7。 外壳是大致平行六面体形状，具有上壁10和四个侧壁11到14，故意没有示出壁14的一部分，以便示出装置的内部。 在这里，观察窗口 7由低通滤波器6构成(即，其允许最低频率，即最长的波长通过)，外壳2的上壁10中形成开口 9，以在其中接收滤波器6。 在下面将会看到，由壁10到14和30界定的该外壳2的内部形成分析室，分析室与环境光隔离，其中容纳要分析的载体。 这里，要分析的载体是属于滤波器单元40的微孔滤膜41，这里是由Millipore。以Milliflex⑨为商标出售的单元。这个膜41直径为55mm，被滤波器单元的主体42所围绕。 这里使用的膜41是纤维素酯，其孔径尺寸适于维持期望检测其存在的微生物，大
部分常常在0. 10和100微米之间。 牵引器5具有主体30、轴环31和握柄32。 在主体30中，形成柱形腔33，用于接收滤波器单元40。 现在将借助图3到5描述照明设备3 。 这些设备3包括两个独立的照明构件4。 每个构件4包括梯形截面的底座20、其上设置有两组27和28 二极管22和23的印刷电路板21 、覆盖那些二极管的漫射体24以及在电路板21的边缘和漫射体24边缘之间的两个黑屏26。 底座20固定于外壳2内部的外壳壁10上，而电路板21固定到底座20远离靠着壁10设置的那些面的其倾斜面上，使得那些电路板沿着载体41的接收区域33的方向朝向彼此倾斜。 于是这样提供了每个底座20，使得当单元40处于装置外壳33中时(图1)，每个
板21相对于壁10和膜41所占据的预定位置具有45°的倾角A(图1)。 电路板21的上边缘25彼此相距100mm的距离，而那些边缘25距壁1023mm的距离。 发光二极管22和23的顶点位于距漫射体24为15mm的距离处。 这里，这些漫射体24是由玻璃板制成的，玻璃板的一面(转向二极管的面)经喷
沙处理。 在每个印刷电路板上，如图5所示，设置由十六个二极管22构成的第一组二极管27以及由四个二极管23构成的第二组二极管28。 二极管22彼此规则地间隔并设置成四个二极管一排等间距的四排，使得每个二极管22距与其直接相邻的二极管22为16mm的距离。于是这一组27形成二极管阵列，使得在将其置于外壳2中其预定位置时能够均匀地对膜41进行照明，阵列的中心29位于距离该预定位置54. 75mm的高度H处(图1)。 二极管23分布于在二极管22的阵列中心交错的正方形的四个角中，每个二极管23位于距与其相邻的两个二极管23为32mm的距离处并处于正方形的中心处，在正方形的角部有四个二极管22(图5)。这个阵列的中心与二极管22构成的阵列中心29重合。
二极管22是来自LUMILED"公司以LXHL-PB01作为参考销售的二极管，图7中示出了其发射谱55，该高斯分布形式的光谱在470nm的波长A工处具有顶点55'，于是发射蓝光。 二极管23是来自同一公司以参考LXHL-PD01销售的二极管，图中未示出其发射光谱，其发射光谱也是高斯分布形式，在625nm的波长处具有峰值，于是发射红光。
对于25%的相对强度值而言，这些二极管具有140°的发射立体角，对于60%的相对强度值，具有90。的发射立体角。 二极管23具有基本为二极管22四倍的发射功率，从而它们的数量是二极管22的1/4。 交错设置二极管22和23的阵列(即彼此嵌套)，从而在要照明的滤波器单元那里获得可能最均匀的光，无论光是来自二极管22还是来自二极管23 。 每组二极管都产生以预定波长为中心的光谱，以便能够激发不同预定类型的荧光团。 每个电路板21上的导电迹线电连接到用于装置的命令和控制单元(未示出)。
现在将简要介绍要分析样本的制备。 在实际检测步骤之前，操作员通过单元40的膜41进行过滤，以采集要分析的样品(可能含有微生物)。 —旦微生物被过滤并保留在膜上，可以包括任选步骤，S卩，使与适当生长培养基接
触的微生物生长。生长培养基优选为凝胶介质，在过滤之后在其上沉积膜。该步骤是任选
的，使得能够获得最初过滤的每种微生物菌落，这增大了要检测的细胞数量。 然后使膜及其包含的微生物与使微生物细胞壁可渗透的成分接触，随后将荧光团
标记物加入实现可渗透的成分中，以便进入要检测的微生物内部。 现在将介绍基于根据本发明的装置判断如此制备的样品上是否存在微生物的实施方式。 在第一阶段中，拉出牵引器5，操作员在该牵引器的腔33中放入滤波器单元40(其可能被未示出的透明盖板覆盖以保护膜不受外部污染物影响)。然后推入牵引器5，直到轴环31抵靠壁13为止，使得膜41置于外壳2中其预定位置，以便被照明。
根据用于标记微生物的荧光团，操作员接下来选择(例如通过图中未示出的开关)对应的二极管22或23以将其导通(在图示的范例中为二极管22)，以便均匀地照明膜41的整个表面，并以合适的波长激发用于进行标记的荧光团。 漫射体24以及二极管在电路板21上的空间分布使得无论使用哪组二极管，都能够对膜41的整个表面进行特别均匀的照明。 由于电路板21置于接收滤波器6的开口 9的每个边上，因此响应于来自二极管的激发光而从滤波器单元40发射的光如图1所示通过该滤波器，从而能够用肉眼或经由摄像机通过滤波器6观察膜41的光响应。 现在将描述利用图7所示不同光谱图在存在微生物的情况下获得的光响应。
在图7中，光谱55是高斯形式的，对应于激发光的光谱(这里为二极管22产生的光谱)，并具有一峰，其对应于最大光强值的峰值55'处于等于470nm的波长A工处。
光谱53和54分别对应于这里选择用于标记膜上存在的微生物的荧光团的吸收光谱和发射光谱。 这里描述的荧光团是5-6CFDA(羧基-荧光素-二 -醋酸盐)。 吸收光谱53在大于A工的波长A 2处具有峰值53'，发射光谱54在大于A 2的波
长、处具有峰值54'。 在图示的范例中，、等于492nm，、等于517nm，这里、和、之间的差小于入2和、之间的差。 有意识地选择激发波长A工，使其小于A 2，使得光谱55的峰值55'相对于光谱53的峰值53'在光谱54的相对侧上偏移。选择这一偏移，以便使来自照明设备的光具有足够高能量来激发荧光团，而光不会与由荧光团响应于激发光而发射的光产生严重的寄生干扰。 光谱56是观察窗口的滤波器6的光谱，选择其截止频率(这里大约为550nm)以使荧光团发射的光(光谱54)基本通过，并阻挡更短波长的光，尤其是来自二极管22的在单元40上反射之后的光。 这一输出滤波器(滤色镜)有弱选择性，以允许充分多的光返回用户眼睛，给出大致明亮的景色，于是观察起来让人舒适，同时确保对比度水平适于用肉眼观察。
当来自照明设备3的激发光照射滤波器单元40的膜41时，使得具有被荧光团标记的微生物的该膜的每个位置以小尺寸(几百微米)亮斑的形式变得可见，亮斑可以直接由滤波器6之外的肉眼观察到。 角度A和高度H的值为无论用肉眼或通过摄像机读取膜41上的亮斑提供了最佳表现。 这些值是通过以下操作确定的向控制膜施加黑色标记和荧光黄标记，并针对角度A和高度H的不同值寻找荧光频带亮度最大同时使黑色标记上的寄生亮度最小的配置A、H。 这样做已经令人惊讶地证实，范围[40° -50° ]的角度A给出了荧光标记的最大光强度并且几乎没有对于黑色标记的寄生光，从而对应于阅读舒适度方面的最佳值。
因此，为了相对于安装装置的间隙具有特定安全余量，从而在此选择了平均值45° 。 至于高度值H，这是被照明对象尺寸的函数，已测试的不同配置表明，对于直径为55mm的膜以及角度A的值范围在40。到50°而言，在39. 75mm和69. 75mm的高度范围上获得了最佳结果。在此，类似地，在该范例中选择的是平均值54. 75mm。 通过调节高度H，该装置还适于照明除膜之外的其他类型样品以及基本任何适于(无论是在表面上或是在体积中)包含微生物且希望通过荧光性检测其存在的载体。
图6中示出了该装置的另一个实施例。
—般而言，将增加了 100的相同附图标记用于类似部分。
7
装置101与装置1具有相同特征，只是其缺少牵引器5 (例如这里，滤波器单元40直接放在例如台上)，并且这里观察窗口 107是由靠着外壳102的壁110设置的矩形形式滑块108以及四个滤波器106到106"'形成的，每个滤波器都容纳在滑块108的对应开口中。
每个光学滤波器都是低通滤波器，从而允许低频(最长的波长)通过，其截止频率与其他截止频率不同。 滑块108接合在该装置的导轨(未示出)中，从而能够将四个滤波器106到106"'中任何选定的一个放置成与壁110的开口 109对准。 于是，根据所选的荧光团以及导通的二极管，能够从四个可用滤波器中选择具有最适合截止频率的一个(例如，以获得最佳对比度)。 在一个未示出的实施例中，滤波器6不是低通滤波器，而是带通滤波器，其中通带以波长人2为中心。 在另一个未示出的实施例中，印刷电路板21具有单个规则间隔二极管组，或者多于两个的二极管组，每组二极管适于以不同波长照明载体41，每个二极管组阵列具有规则形状，例如正方形，菱形，三角形，等等。 在另一个未示出的实施例中，二极管以任意其它类型的局部和单一光源，例如化学发光光斑代替，和/或印刷电路板由任意其它类型的可以支撑光源的基板例如玻璃或陶瓷板代替。 最后，要指出的是，也可以针对很多其他应用按照不同版本生产这种照明系统，其他应用例如是通过显微镜分析、生物芯片扫描、借助荧光的板的读取、血细胞计数、透照器、PCR实时读取，对于这些应用的每一个，装置的几何构型成为讨论的应用的特殊方案。基座21固定于其上的装置框架未必是像图示外壳2的外壳；例如它可以是围绕显微镜光学装置的箍状物。 本发明不限于所述和图示的实施例，而是涵盖其任何变体。
8
权利要求
一种用于载体(41)的微生物分析的装置，该载体适于含有由荧光试剂标记的微生物，其包括为了通过荧光来检测所述标记的微生物的存在而适于照明所述载体(41)的照明设备(3)，以及用于观察响应于由所述照明设备(3)产生的激发光而由所述载体(41)发射的光的窗口(7；107)；其特征在于所述照明设备(3)包括两个基板(21)，每个基板上安装至少一组(27)光源(22)，该组(27)中的所述光源(22)彼此规则地间隔开从而形成照明所述载体(41)的阵列，所述基板(21)被固定到所述装置的框架(2；102)上，在所述框架(2；102)中形成的开口(9；109)的每边上各有一个，以便允许由所述载体(41)发射的光透过所述观察窗(7；107)，所述基板(21)在所述装置中用于接收所述载体(41)的预定位置的方向上向彼此倾斜。
2. 如权利要求l所述的装置，其特征在于每个所述光源(22)具有以预定波长(A》为中心的相同的光谱(55)。
3. 如权利要求2所述的装置，其特征在于所述光源是发光二极管(22)。
4. 如权利要求l-3任一项所述的装置，其特征在于每个所述基板(21)相对于用于接收所述载体(41)的所述预定位置倾斜40。
-50°的角度(A)。
5. 如权利要求l-4任一项所述的装置，其特征在于在每个阵列(27)的中心(29)和在所述装置中用于接收所述载体(41)的所述预定位置之间的高度(H)随所述载体(41)变化。
6. 如权利要求5所述的装置，其特征在于每个所述阵列(27,28)的中心(29)位于距离用于接收所述载体(41)的所述预定位置39. 75mm-69. 75mm的高度(H)处。
7. 如权利要求l-6任一项所述的装置，其特征在于除了被指定为第一组(27)的所述光源(22)的组(27)以外，在每个基板(21)上还有被指定为第二组的另一组(28)光源(23)，所述第二组的所述光源(23)也是彼此规则地间隔开以形成照明所述载体(41)的第二阵列。
8. 如权利要求7所述的装置，其特征在于对于每个基板(21)，所述第一和第二阵列(27,28)的中心(29)重合。
9. 如权利要求8所述的装置，其特征在于所述第一和第二阵列(27,28)在彼此内部交错。
10. 如权利要求l-9任一项所述的装置，其特征在于对于每个基板(21)，所述照明设备(3)包括用于由所述光源(22,23)发射的光的漫射体(24)。
11. 如权利要求10所述的装置，其特征在于每个漫射体(24)是其上一个面被喷砂的玻璃板。
12. 如权利要求l-ll任一项所述的装置，其特征在于所述观察窗(7 ;107)包括适于允许最长波长通过的滤波器(6 ;106)。
13. 如权利要求12所述的装置，其特征在于所述观察窗(107)包括多个滤波器(106，106'， 106"， 106"')。
14. 如权利要求13所述的装置，其特征在于所述滤波器(106， 106， ，106"， 106"，)属于滑动地安装在所述框架(102)上的滑块(108)。
15. 如权利要求l-14任一项所述的装置，其特征在于所述照明设备(3)适于照明整个用于接收所述载体(41)的预定位置。
16. 如权利要求15所述的装置，其特征在于所述分析载体是微孔薄膜(41)。
全文摘要
一种用于载体(41)的微生物分析的装置，该载体适于含有由荧光试剂标记的微生物，其包括具有两个基板(21)的适于照明所述载体(41)的照明设备，每个基板上安装至少一组光源(22)，该组中的所述光源(22)彼此规则地间隔开从而形成照明所述载体(41)的阵列，所述基板(21)被固定到所述装置的框架上，所述框架上形成的开口(9)的每边各有一个，所述基板(21)在所述装置上用于接纳所述载体(41)的预定位置的方向上向彼此倾斜。
文档编号G02B7/00GK101724683SQ20091025307
公开日2010年6月9日 申请日期2009年9月23日 优先权日2008年9月23日
发明者G·魏茨, S·里博 申请人:米利波尔公司