一种染色体异常核型质控细胞库及其构建方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于医疗领域的染色体异常核型质控细胞库及其构建方法，其主要特征是取自因临床诊治需要而作常规染色体病诊断后并已确诊为疑难染色体异常的剩余的呈贴壁生长的活细胞，经反复传代、大量扩增细胞后，收获细胞，作低渗、固定、悬浮于固定液、-20℃贮存，然后提取数例各自制备的贮存细胞，按质控要求的比例混合，由此制成的质控细胞数量多且具有在同一份质控细胞中同时含有多种不同比例和类型的易误诊染色体异常核型的特征，增加了鉴别诊断、染色体嵌合体诊断的难度和复杂性，标本易得且将废弃的多余细胞转化为质控细胞，用于室间质评、室内质控和技术考核，对及时发现误诊问题、提高诊断水平具有显著的效果。
【专利说明】一种染色体异常核型质控细胞库及其构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种染色体异常核型质控细胞库及其构建方法，主要应用于医学领域 的细胞遗传学诊断实验室作染色体核型分析的技术考核、室内质控和室间质评。
【背景技术】
[0002] 染色体是细胞核中的遗传物质，人类有23对染色体，其中22对为常染色体，1对为 决定男女性别的性染色体。染色体上载有遗传信息的基因，其中DNA占90%以上，RNA含量 随细胞周期及生长情况而有所变化，一般占1%?10%。
[0003] 染色体结构异常、数目异常及嵌合体，临床上表现为染色体病，属于常见的出生缺 陷，如先天愚型、原发性闭经、两性畸型等。染色体结构异常包括染色体易位、缺失、倒位、环 状等；染色体数目异常指多1条或数条染色体、多1条或数条染色体片段；嵌合体核型是指 同一病例个体并存数种染色体核型。目前分析染色体核型的常规方法是用被检的组织或 细胞，经过常规细胞培养、0. 02 μ Ι/ml秋水仙素终止细胞生长、分离中期细胞、0. 075mol/L KC1低渗、甲醇-冰乙酸（3 : 1)固定等染色体制片程序后，最后用胰酶消化、染色显带，从 而作出染色体结构和数目是否异常的判断。目前通过染色体分析来诊断染色体病已被各级 产前诊断中心或医院检验科普遍地开展，并广泛应用于产前、胚胎植入前染色体病的诊断 以及作为异常妊娠、血液病、肿瘤等临床诊断或发病机理研究的重要指标。
[0004] 作为所开展的各类实验诊断项目，均应有相应规范的质量控制措施。实验室的质 量控制是确保实验诊断结果准确性的前提，已成为政府行为。为了加强实验室的质量控制， 我国于1982年成立了卫生部临床检验中心，下设室间质评办公室，专职从事于实验诊断项 目的质量控制。卫生部[卫医发]1997第31号文件、《临床实验室管理办法》、《医院评审标 准实施细则》以及大量的文献均指出，实验室必须有规范的质量控制标准，所开展的实验诊 断项目必须参加卫生部临床检验中心组织的室间质评。自1982年以来，在临床检验学科先 后开展了临床实验的室内质控、室间质评。包括了对各检验项目的实验前、中、后以及仪器、 试剂和实验人员的质量控制。质量控制已渗透到临检、生化、微生物、免疫、基因、细胞形态 学诊断等各个实验项目。实验室的质量控制已成为开展实验诊断项目的准入制度、成为医 院等级评审的重要标准。
[0005] 产前诊断的质量控制已引起日益重视。随着我国对生殖健康和出生缺陷工作的 是益重视，近年来各省市均建立了产前诊断中心，开展了 21三体综合症、18三体综合征、 神经管畸形等重大出生缺陷的产前筛查和产前诊断，其中与重大出生缺陷相关的胎儿羊水 染色体异常的诊断已成为目前产前诊断的主要项目。由于产前诊断是新开展的学科，大多 专业人员的技术经验较为缺乏，特别是对于疑难、罕见病例、国内外首报病例以及如猫叫综 合症等染色体异常不明显但临床后果严重的病例，误诊现象时有发生。我国国家主席令 (1994年10月27日第三十三号）公布的"产前诊断法规标准"以及国务院办公厅[国发办 (1999) 15号]转发卫生部"关于做好提高出生人口素质工作意见"的通知中均强调指出， "各省、市产前诊断中心必须加强产前诊断的质量控制、严把质量关"。
[0006] 产前诊断的质量控制是许多学者致力于研究的重要课题。国外有较多的文献报 道了产前诊断质量控制的重要性，Sikkema-Raddatz B等对产前细胞遗传学诊断的细胞培 养及制片过程的影响因素作了深入的研究，提出了室内质量控制的方法；Fries N和Merz E等提出了影像学产前诊断的质量控制方法；Pihlk等认为必须加强产前筛查的质量控制； 在2002?2004年期间，Bastien P等对法国23家实验室作了弓形虫产前分子诊断的室间 质量评价，认为室间质评对促进实验室间的技术交流、发现问题、提高实验诊断质量起到重 要的作用。
[0007] 研制可行的质控物，是开展产前细胞遗传学诊断室间质评和室内质控的关键环 节。虽然我国行政主管部门以及学术界十分重视产前诊断的质量控制（包括室内质控和室 间质评），但因没有可行的质控物，所以无法开展实质性的质量控制。也就是说，要开展产前 细胞遗传学诊断的室间质评，首先必须要有质控物。这是质量管理人员以及本专业的技术 人员长期以来想方设法解决但始终没有解决的难题。
【发明内容】
[0008] 为了解决在产前细胞遗传学诊断中无质控物的问题，本发明人提出了本发明。
[0009] 本发明的目的是要提供一种应用于医学领域的细胞遗传学诊断实验室作染色体 核型分析的技术考核、室内质控和室间质评的染色体异常核型质控细胞库及其构建方法。 [0010] 本发明的目的是这样实现的：取自因临床诊治需要而作常规染色体病实验诊断后 并已确诊为疑难、罕见染色体异常的剩余的呈贴壁生长的原代或传代活细胞，经反复传代、 大量扩增细胞数量后，或边传代扩增边收获贴壁细胞，经低渗和固定后，将细胞悬浮于3份 甲醇和1份冰乙酸配制的固定液中，作为原液质控细胞贮存于-20°C备用，然后根据待制 作的质控细胞的要求，提取数例各自制备的不同病例的疑难染色体异常的原液质控细胞， 按所需要的比例混合使之成为应用质控细胞，从而使原先一般每份只有一种染色体异常核 型的原液质控细胞转变为含有不同比例的、易于误诊的多种染色体异常核型的应用质控细 胞，继续保存于_20°C的固定液中，备作染色体核型分析的质量控制之用。
[0011] 本发明取自因临床诊治需要而作常规染色体病实验诊断后并已确诊为疑难、罕见 染色体异常的剩余的呈贴壁生长的原代或传代活细胞，经反复传代、大量扩增细胞数量后 收获贴壁细胞，制备原液质控细胞，然后将各自制备的不同例次的原液质控细胞按质控需 要比例混合，使之成为应用质控细胞，所制备的质控细胞不但数量足够的多，而且使原先一 般每份原液质控细胞中只有一种染色体异常核型转变为具有在同一份应用质控细胞中同 时含有多种不同比例的、不同类型的易误诊染色体异常核型的特征，从而在本来就易误诊 的基础上更加增加了鉴别诊断、染色体嵌合体诊断的难度和复杂性，标本易得且将废弃的 多余细胞转化为可用于染色体核型分析的技术考核、室内质控及室间质评，在室内质量控 制、室间质量评价、提高诊断水平的应用中具有意想不到的效果。
【具体实施方式】
[0012] 1、常规标本采集与培养：按常规取因临床诊治或产前诊断需要而作常规染色体病 实验诊断的胎儿羊水、绒毛组织等标本，按常规处理标本，将细胞接种于25cm2细胞培养瓶 中，每例接种2?3瓶，加 RPMI-1640细胞培养液3ml，37°C、5% C02中培养，羊水细胞培养 7天左右换液，上层液倒入另一培养瓶中，加入新鲜培养液3ml，继续培养至细胞汇合率达 85%左右；绒毛组织接种后第2天显微镜下观察生长情况，有梭形细胞生长时换新鲜培养 液，继续培养至细胞汇合率达85 %左右。
[0013] 2、常规细胞收获与染色体制备：（1)终止培养前2?3h，加入浓度为20 μ g/ml的 秋水仙素，每5ml培养基中用7号针头，加3?4滴使最终浓度为0. 1 μ g/ml。轻轻摇匀 后，再放入恒温箱内，继续培养2?3h，以积累较多停止在中期的分裂象。（2)收获细胞：由 恒温箱取出培养瓶，以〇. 25%胰蛋白酶消化贴壁细胞5分钟，每次收获1瓶，用吸管充分吹 打培养瓶瓶壁，使细胞全部脱离瓶壁，然后将细胞液移至锥形离心管内，1500转/min，离心 lOmin，去上清液。（3)低渗处理：加入37°C预温的0· 075mol/L KC18ml，反复吹打（约一百 次）后，置37°C水浴箱中低渗处理25min左右。（4)预固定：加入新鲜制备固定液lml (甲 醇：冰醋酸=3 : 1)，轻轻混勻。（5)离心：2000转/min,离心lOmin，吸弃上清液。（6)固 定：沿离心管壁慢慢加入固定液8ml，轻轻混匀，固定lOmin。（7)离心：同上，吸去上清液。 (8)再固定：力_定液8ml，混勻，固定lOmin。（9)离心：同上，吸去上清液。（10)制细胞悬 液：根据细胞量多少，加入适量固定液，充分混匀，制成细胞悬液，保存备用。
[0014] 3、常规制片与显带：（1)滴片：取出预先经冰水浸泡的载玻片，用吸管吸取混匀的 细胞悬液在离冰片约30cm距离进行滴片，每片约滴2?3滴细胞悬液，使细胞较好分散。一 般每一培养瓶可制3?5张标本片。（2)染色：标本凉干后，即可用染液（Giemsa液原液1 份，ρΗ6· 8的磷酸缓冲液9份）染色15min，自来水冲洗后（从背面冲洗）晾干备用。
[0015] 4、常规染色体核型分析：以 Automated Cytogenetics Platform Cytovision(Leica Microsystems)摄下良好的分裂相作染色体结构分析，作出确诊。除 了自动分析以外，染色体核型分析还可以在光学显微镜下计数30个染色体核型，以发现染 色体数目是否异常，如有嵌合体等特殊情况，计数至100个染色体核型；在油镜下分析3-5 个染色体核型，以发现有无染色体易位、缺失、倒位、环状等各类结构异常，最后作出诊断报 生 1=1 〇
[0016] 5、质控细胞制备前的扩增培养：将已经上述方法确诊为疑难、罕见染色体异常病 例的剩余的呈贴壁生长的原代或传代活细胞，每7天左右更换适量的新鲜培养液，继续培 养至细胞汇合率达85%左右，以0. 25%胰蛋白酶消化贴壁细胞，以无菌生理盐水洗净胰蛋 白酶，加适量培养基混悬细胞，转入数个较大的培养瓶再次继续传代培养，如此反复，传代 至50?100代或更多，直至细胞大量扩增后，作细胞收获与染色体制备，或在传代过程中边 传代边收获适量的传代细胞。
[0017] 6、原液质控细胞的制备：在"常规细胞收获与染色体制备"的基础上制备原液质控 细胞，即：（1)终止培养、收获细胞前2?3h，加入浓度为2〇μ8/πι1的秋水仙素，每5ml培养 基中用7号针头，加3?4滴使最终浓度为0. 1 μ g/ml。轻轻摇匀后，再放入恒温箱内，继 续培养2?3h，以积累较多停止在中期的分裂象。（2)收获细胞：由恒温箱取出培养瓶，以 0. 25%胰蛋白酶消化贴壁细胞5分钟，每次收获1瓶，用吸管充分吹打培养瓶瓶壁，使细胞 全部脱离瓶壁，然后将细胞液移至锥形离心管内，1500转/min，离心10min，去上清液。（3) 低渗处理：加入37°C预温的0· 075mol/L KC18ml，反复吹打（约一百次）后，置37°C水浴箱 中低渗处理25min左右。（4)预固定：加入新鲜制备固定液lml (甲醇：冰醋酸=3 : 1)， 轻轻混匀。（5)离心：2000转/min，离心10min，吸弃上清液。（6)固定：沿离心管壁慢慢加 入固定液8ml，轻轻混勻，固定lOmin。（7)离心：同上，吸去上清液。（8)再固定：加固定液 8ml，混匀，固定lOmin。（9)离心：同上，吸去上清液。（10)制备原液质控细胞悬液：根据细 胞量多少，加入适量固定液，充分混匀，制成浓度为l〇 5/ml的细胞悬液，保存备用。
[0018] 7、应用质控细胞的制备：提取数例在不同时间制备的不同病例的疑难染色体异常 核型的原液质控细胞，按1例原液质控细胞悬液分别与另外1例、2例、3例、4例、5例、6例、 7例、8例、9例、10例、11例、12例、14例、15例、16例、17例、18例、19例、20例、1?50例原 液质控细胞悬液以 1 : 1、1 : 2、1 : 3、1 : 4、1 : 5、1 : 6、1 : 7、1 : 8、1 : 9、1 : 10、 1 : 1?20的体积比例或细胞数比例进行混合，混合后的应用质控细胞悬液含有不同类型 和比例的染色体异常细胞，但作为同一例次的质控细胞。如此经传代扩增细胞、收获细胞、 混合不同病例的染色体异常细胞所制备的质控细胞，不但数量足够的多，而且使原先一般 每份原液质控细胞中只有一种染色体异常核型转变为具有在同一份应用质控细胞中同时 含有多种不同比例的、不同类型的易误诊染色体异常核型的特征，从而在本来就易误诊的 基础上更加增加了鉴别诊断、染色体嵌合体诊断的难度和复杂性，标本易得且将废弃的多 余细胞转化为可用于染色体核型分析的技术考核、室内质控及室间质评，在室内质量控制、 室间质量评价、提高诊断水平的应用中具有意想不到的效果。
[0019] 8、质控细胞库的建立：将上述在不同时间制备的应用质控细胞以（甲醇：冰醋酸 =3 : 1的）固定液配成浓度为105/ml的细胞悬液，经分装、加满固定液至管口和封口后， 按年、月、日的制备日期及标本来源地址的大写英文字母编号，集中保存于_20°C，备作染色 体核型分析的质量控制之用。同时将相应的各种染色体异常核型的标准描述、按照年、月、 日的制备日期以及标本来源地址的大写英文字母编号录入计算机管理系统，使用时从计算 机中抽取待用质控细胞编号，然后从质控细胞库中找出相应的质控细胞作质量评价。
[0020] 9、室间质评中的应用：从计算机中抽取待用质控细胞编号，然后从质控细胞库中 找出相应的质控细胞，发送到各实验室或相关专业技术人员，在收到质控细胞后，各室按常 规作染色体制片、烤片干燥、胰蛋白酶消化分带、染色G显带、常规染色体核型分析、按时反 馈染色体核型诊断结果，组织者或考核者评价各受试对象所汇总的诊断结果的准确性、误 诊情况，分析原因、定期讨论、改正存在问题，以增加技术人员的见识和经验，提高诊断质 量。也可取质控细胞送交被考核者，作染色体制备和核型分析后，以书面、口头、当场考核被 考核者诊断技术水平。
[0021] 10、室间质评调查实例：我们按上述方法自制了 1个组合单位的染色体异常质控 细胞并建立了质控细胞库，每个组合单位含有6种染色体异常核型，其核型分别为46, X， t(Y ;5) (ql2 ;q21)、46, ΧΥ，15P+、46, XX，t(13 ;18) (ql2 ;q21)、46, X，r(Xp)、46, X，t(Y ;Y) 和46, XX，t(9 ;20) (P13 ;pl3)，均属较为疑难、罕见的异常核型，并作了细胞遗传学诊断的 室间质评试验。我们向35个实验室各发放了 1个组合单位的染色体异常质控细胞，共计 35个组合单位，各受试者作染色体核型分析后所回报的结果，相对应于46, X，t (Y ;5) (ql2 ; q21)、46, XY，15P+、46, XX，t(13 ;18) (ql2 ;q21)、46, X，r(Xp)、46, X，t(Y ;Y)和 46, XX，t(9 ; 20) (P13 ;pl3)的6种染色体异常核型排序的结果，其完全正确率分别为81. 82%、78. 13%、 86. 67 %、78· 79 %、78· 13 %、90· 32 %，完全错误率分别为 15. 15 %、21· 88 %、10· 00 %、 18. 18%、21.88%、6.45%，总的完全正确率、部分正确率、部分错误率和完全错误率分别为 82. 20%、0. 52%、1. 57%和15. 71%。表明各受试者的细胞遗传学诊断结果存在较高的误
【权利要求】
1. 一种用于医疗领域的染色体异常核型质控细胞库及其构建方法，其主要特征是取自 因临床诊治需要而作常规染色体病诊断后并已确诊为疑难染色体异常的剩余的呈贴壁生 长的活细胞，经反复传代、大量扩增细胞后，收获细胞，作低渗、固定、悬浮于固定液、作为原 液质控细胞，-20°c贮存，然后提取数例各自制备的原液质控细胞，按质控要求的比例混合， 制成应用质控细胞，-20°C贮存备用，由此经传代扩增细胞、收获细胞、混合不同病例的染色 体异常细胞所制备的质控细胞，不但细胞数量足够的多，而且使原先一般每份原液质控细 胞中只有一种染色体异常核型转变为具有在同一份质控细胞中同时含有多种不同比例的、 不同类型的易误诊染色体异常核型的特征，从而增加了鉴别诊断、染色体嵌合体诊断的难 度和复杂性，标本易得且将废弃的多余细胞转化为可用于染色体核型分析的技术考核、室 内质控及室间质评的质控细胞，在室内质量控制、室间质量评价、提高诊断水平的应用中具 有意想不到的效果。
2. 根据权利要求1所述的一种用于医疗领域的染色体异常核型质控细胞库及其构建 方法，其特征是提取数例在不同时间制备的不同病例的疑难染色体异常核型的原液质控细 胞，按1例原液质控细胞悬液分别与另外1例、2例、3例、4例、5例、6例、7例、8例、9例、10 例、11例、12例、14例、15例、16例、17例、18例、19例、20例、1?50例原液质控细胞悬液 以1 : 1、1 : 2、1 : 3、1 : 4、1 : 5、1 : 6、1 : 7、1 : 8、1 : 9、1 : 10、1 : 1 ?20 的体 积比例或细胞数比例进行混合，混合后的质控细胞悬液含有不同类型和比例的染色体异常 细胞，但作为同一例次的质控细胞。
3. 根据权利要求1所述的一种用于医疗领域的染色体异常核型质控细胞库及其构建 方法，其特征是将上述在不同时间制备的质控细胞以（甲醇：冰醋酸=3 : 1的）固定液 配成浓度为l〇5/ml的细胞悬液，经分装、加满固定液至管口和封口后，按年、月、日的制备日 期及标本来源地址的大写英文字母编号，集中保存于_2〇°C，建立质控细胞库。
4. 根据权利要求1、3所述的一种用于医疗领域的染色体异常核型质控细胞库及其构 建方法，其特征在于，质控细胞库包含 以固定液（甲醇：冰醋酸=3 : 1的）为媒介的、-20°C保存的、按年、月、日的制备日 期及标本来源地址的大写英文字母编号的原液质控细胞； 以固定液（甲醇：冰醋酸=3 : 1的）为媒介的、-20°C保存的、按年、月、日的制备日 期及标本来源地址的大写英文字母编号的、以固定液配成细胞浓度为l〇5/ml的应用质控细 胞； 与质控细胞相对应的各种染色体异常核型的标准描述、按照年、月、日的制备日期以及 标本来源地址的大写英文字母编号录入计算机管理系统，使用时从计算机中抽取待用质控 细胞编号，然后从质控细胞库中找出相应的质控细胞作质量评价。
【文档编号】C40B40/02GK104060328SQ201310109732
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2013年3月19日 优先权日:2013年3月19日
【发明者】翁炳焕 申请人:翁炳焕