本发明属于生物材料技术领域，特别适用于医用金属材料领域，具体为一种具有抗菌功能的医用钽铜合金及其制备。
背景技术：
金属钽以其优良的化学稳定性、优异的生物学特性和独特的结构性质已经引起生物医学界的广泛关注。与现有医用金属材料相比，钽主要具有两方面的明显优势：(1)钽具有更为优异的化学稳定性和耐蚀性能，常温下，钽与盐酸、浓硝酸甚至“王水”都不发生化学反应，一般的无机盐对钽均没有腐蚀作用；(2)钽的生物相容性极佳，植入一段时间后，生物组织易在钽表面上生长，所以钽又有“亲生物金属”之称。金属钽的诸多优势为其在医疗领域的应用提供了广阔的发展空间。目前金属钽在医疗领域中有如下应用：由于钽的延展性佳，可制成与头发丝相当甚至更细的细丝。钽丝作为手术缝合线具备灭菌简易、刺激较小、抗张力大等优点，主要用于缝合骨、肌腱、筋膜及牙齿固定，或用于内脏手术的缝合。
然而，随着医用金属材料越来越广泛的应用，随之带来的一系列问题，包括以医用金属材料植入为中心引发的术后感染(BCI)越来越频繁，已经成为临床医疗的一个重要的亟待解决的问题。世界卫生组织发布的数据表明，每年医院内有超过1400万人正在饱受细菌感染诱发的炎症等带来的痛苦，其中60％的细菌感染与植入物的使用有关。在骨科领域，在无菌操作 以及全身预防性抗炎治疗前提下，第一次全髋关节置换术后的细菌感染发生率在0.5-3.0％，肿瘤切除后大量骨缺损的体内假肢置换的感染率在5-35％，2-30％的行外固定支架手术的病例存在术后感染。有统计数据表明：表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌是引发骨科植入器械感染的主要细菌，比例分别为34％和32％，其它球菌比例13％。因此，医用金属材料引发的细菌感染已经成为制约其发展的重要因素之一。此外，良好的生物相容性也是医用金属材料必须具备的性能之一。生物相容性是指生命体组织对材料产生反应的一种性能，包括组织相容性和血液相容性。良好的生物相容性是对植入物材料的首要要求。材料的生物相容性包括组织相容性与血液相容性，是评价新型生物材料必须考虑的问题。
因此，现有技术的不足在于：目前还没有自身具有抗细菌感染，并兼具优异生物相容性的医用金属植入材料。
技术实现要素：
本发明针对上述问题，提出了一种具有优异的生物相容性能的抗菌功能的新型医用钽铜合金，以解决现有金属植入材料自身不具有抗细菌感染功能的问题。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：在医用钽金属中添加适量的铜元素(Cu)，其化学成分为重量百分比：铜(Cu)：5-20％，余量为钽(Ta)。该合金中其它杂质元素含量应符合医用钽基合金国家标准中的相应要求。其中Cu元素的重量百分比优选为：Cu：10-15％。该合金具有显著的抗菌性能，且兼具优异的生物相容性，不仅有望降低钽金属植入器件在临床使用中周围组织的感染发生率，还能显著提高组织与钽金属器 件的生物相容性，进而提升了钽金属植入器件的医疗功效与成功率。
在本发明的具有抗菌功能的医用钽铜合金的成分设计中，Cu是本发明所述医用钽铜合金中最重要的合金元素，这是保证钽铜合金具有抗菌功能并兼具优异生物相容性的必要条件，也是本发明的主要创新点之一。本发明是在医用钽金属中加入适量的铜元素，以保证微量铜离子能够从钽合金表面持久释放，从而赋予钽金属抗菌功能。如果铜含量相对较低，钽合金不能释放足量的铜离子，会降低钽合金的抗菌功能。如果铜含量相对过高，则会导致钽合金释放过多的铜离子，进而影响钽合金的耐蚀性能及生物安全性，过高的铜含量对钽合金的力学性能和加工性能也会产生负面影响。只有在本发明提供的Cu含量的范围内，钽铜合金才能同时保证优异的抗菌性能与生物相容性能。
在本发明还提供了所述医用钽铜合金的制备方法，其特征在于：制备过程包括混粉和热等静压成型两个步骤。
混粉：以平均粒度均小于200um的纯钽粉末和纯铜粉末为原料，将原料粉末放入混料机进行干式机械混合20-30小时。
热等静压成型：将真空封装的装有合金粉末的包套在热等静压机中成型，热等静压工艺参数优选范围为1200℃-1400℃/200MPa-300MPa/4h-10h，在高温下利用各向均等的静压力进行压制得到致密化的钽铜合金。
采用传统火法冶金工艺无法制备钽铜合金，过程存在较大困难。原因在于金属钽的熔点为3020℃，而铜的沸点为2563℃，用火法冶金方法冶炼钽铜合金时很容易造成金属铜的气化挥发，很难控制钽合金中铜的收到率和成分，本发明采用粉末冶金的方法制备具有抗菌功能的医用钽铜合金。 热等静压方法是一种优选的粉末冶金制备钽铜合金的制备方法，而该方法就涉及制备参数如烧结温度，保温时间，烧结压强等的优化过程。比如，烧结温度过低，则就有可能造成材料致密度降低，进而造成材料力学性能和耐蚀性能不足的问题，烧结温度过高，还会使得钽合金中低熔点富铜相液化，严重破坏材料的力学性能和耐蚀性能。同时，保温时间较少和烧结压强过低，均会使得钽铜合金的孔隙率增加，密度降低，从而影响材料的使用性能，保温时间过长和烧结压强较大，并不会大幅提高材料的相关性能，同时还会增加设备的技术要求和制备成本。因此，只有在本发明提供的合适的热等静压制备工艺参数的范围内，医用钽铜合金才会保证足够的力学性能和耐蚀性能，进而才能充分发挥其抗菌功能。
本发明所述具有抗菌功能的医用钽铜合金主要用于缝合骨、肌腱、筋膜及牙齿固定，或用于内脏手术的缝合，也可广泛应用于骨科、口腔科、心血管支架介入等医学临床领域中使用的各类钽铜合金植入医疗器械。
本发明的有益效果是：
1、本发明通过粉末冶金中热等静压工艺参数的优化，制备出力学性能、耐蚀性能、抗菌性能优良的新型医用钽铜合金。
2、本发明所述医用钽铜合金作为植入物时，可向其附近组织中持续释放微量Cu元素，不仅能够抗感染，还能有效地提高生物相容性能，可广泛应用于骨科、口腔科、心血管支架等医学临床领域中使用的各类钽金属植入医疗器械。
具体实施方式
根据本发明钽铜合金所设定的化学成分范围，采用粉末冶金的制备工 艺方法，制备出实施例1-9和对比例1-7钽铜合金各1公斤，实施例1-9和对比例1-7的钽铜合金的化学成分数据见表1。
表1实施例和对比例钽铜合金的化学成分(重量％)
制备工艺方法包括如下步骤：
(1)混合原料：以平均粒度均为45um的纯钽粉末和纯铜粉末为原料，每组按照表1的合金化学成分配比成总质量为1kg的原料粉末，将原料粉末放入混料机进行干式机械混合25小时。
(2)热等静压成型：将真空封装的装有合金粉末的纯Ta包套放入热等静压机中，热等静压工艺参数如表2所示。
表2热等静压工艺参数设计
在高温下利用各向均等的静压力进行压制得到致密化的钽铜合金。经热等静压烧结后的试样加工成力学性能测试和生物学性能测试样品，相关测试方法和结果如下：
一、钽铜合金力学性能测试
将热等静压后的钽铜合金胚体取出，各例所得到的钽铜合金胚体采用阿基米德排水法测量胚体的体积密度，结果如表3所示。取部分钽铜合金用线切割的方法加工取样并标记，切割10mm×10mm×2mm规格的试样，经过打磨抛光后进行硬度测试和抗菌实验，用HVS-1000显微维氏硬度计测定试样硬度，载荷1.96N，保荷时间20S，硬度测定结果如表3所示。按国标加工成圆棒状拉伸试样，在MTS810材料试验机上进行拉伸试验，结果如表3所示。
表3实施例和对比例钽铜合金的力学性能
从表3可知，当热等静压制备工艺参数都在本发明的设定范围内时，实施例1-9钽铜合金均具有高致密度和优良的力学性能。当热等静压制备工艺参数至少有一个不满足本发明的设定范围时，钽铜合金致密度低，力学性能差，不满足材料的使用性能。如对比例1烧结温度过低，导致钽铜合金的致密度降低，造成强度和延伸率指标均低于实施例钽铜合金。对比例2和4因为制备工艺参数中保温时间较少和烧结压强过低，均会使得钽铜合 金的孔隙率增加，密度降低，最终导致钽铜合金的力学性能不足影响材料的适用性能。对比例3则由于烧结温度过高，造成钽合金中低熔点富铜相的液化，也不利于保证材料的力学性能。对比例5中，少的铜添加虽然能保证强度和塑性指标，但结合下表4可知，并不能保证其具有足够的抗菌功能。对比例6中高的铜含量虽然能保证钽合金具有足够的强度，但高的铜含量进一步加剧钽合金的晶格畸变，延伸率降低，致密性差，并且结合下表4的生物安全性结果，其生物相关性能也不符合植入物相关标准要求。可见，只有在本发明提供的热等静压制备工艺参数范围内，才能保证材料具有高致密度和优良的力学性能。
二、生物学性能检测
1、抗菌性能检测：
将实施例1-9和对比例1-7的钽合金按照“JIS Z 2801-2000《抗菌加工制品－抗菌性试验方法和抗菌效果》、GB/T 2591-2003《抗菌塑料抗菌性能实验方法和抗菌效果》”等相关标准规定进行定量的抗菌性能检测。结果得到实施例1-9和对比例1-7的钽合金对常见感染菌(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌)作用后的杀菌率。体外抗菌性能检测结果见表4，其中杀菌率的计算公式为：杀菌率(％)＝[(对照活菌数-实验组合金活菌数)/对照样品活菌数]×100。
具体实验过程为：
分别取试验用菌液0.3mL滴加到对照样品(Ta)、实验组钽合金样品上。用灭菌镊子将覆盖膜分别覆在各个样品上，使菌液均匀接触样品，置于灭菌平皿中，放在恒温培养箱中37℃、相对湿度90％以上条件下培养24h。 取出已培养24h的样品，分别加入15mL洗脱液，反复清洗样品及覆盖膜，充分摇匀后，分别取0.1mL滴加到板营养琼脂培养基，每个样品做三个平行样，并用灭菌三角耙涂匀，置于37℃恒温箱中培养48h后按照GB/T 4789.2的方法进行活菌计数。
从表4可以看出，本发明所述具有抗菌功能的医用钽铜合金与纯钽相比，具有杀菌功能，特别是其杀菌率随着铜含量的增加而加强。可见本发明在医用纯钽金属中添加Cu元素能够赋予钽铜合金优异的抗菌性能。
2、细菌生物膜的面积与厚度定量测定：
对实施例1-9和对比例1-7的钽合金表面细菌生物膜的面积与厚度进行定量测定，进一步评价实验材料抑制细菌生物膜粘附能力。具体步骤为：
采用美国Invitrogen公司生产的BacLightTM Bacterial Viability Kits L7012荧光染色剂对与细菌菌液共培养24h后的实验材料表面进行染色。BacLightTM Bacterial Viability Kits L7012试剂盒包含两种荧光染色剂，分别是SYTO-9和PI。SYTO-9染色剂能将活细胞与死细胞染色，并呈绿色；PI染色剂能将死细胞染成红色，并选择性地只穿透死细胞的细胞膜，破坏细胞结构，减少其与SYTO-9的显色，从而使死细胞只呈现红色。染色之前，实验材料表面用pH7.2的0.2mmol/mlPBS缓冲溶液轻轻冲洗3次以便将培养基溶液冲掉。染色步骤严格按照试剂盒说明书进行，即将1.5μL SYTO9染色剂与1.5μL PI染色剂混合均匀，应用已灭菌的蒸馏水稀释至1ml。将200μL稀释后的染色剂滴加在实验材料表面，室温避光染色15min。染色结束后，用PBS清洗3次，立即在激光共聚焦显微镜下观察。每个样品随机选取五个视场，利用NIS Viewer软件分析实 验材料表面生物膜的厚度与面积。具体实验结果见表4。
从表4可以看出，本发明所述具有抗菌功能的医用钽铜合金与纯钽相比，表面的细菌生物膜的厚度与面积均较小。可见本发明在医用纯钽金属中添加Cu元素能够有效抑制细菌生物膜的生成与粘附，进而减少细菌感染的发生率。
3、细胞毒性检测：
将实施例1-9和对比例1-7的钽合金进行MTT(3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide，3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐)生物安全性能检测，即根据国标GBT16886.5-2003医疗器械生物学评价，包括细胞相对增殖率(RGR)。
采用噻唑蓝MTT比色法测定细胞生存率，进而评价样品的生物安全性。MTT法是一种检测细胞存活和生长的方法，其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。
具体操作步骤为：将人成骨肉瘤细胞MG63的冻存管从液氮中取出，37℃水浴中快速融化，离心弃上清，加入新鲜配制的含10％胎牛血清的DMEM(dulbecco's modified eagle medium，高糖培养基)高糖培养基中，反复吹打成细胞悬液后移入培养瓶中，置于37℃、相对饱和湿度(95％)、体积分数为5％的CO2恒温培养箱中静置培养，隔日换液。3-4天传代培养，在倒置相差显微镜下观察细胞形态。取生长旺盛的MG63细胞，2.5g/L胰蛋白酶消化后，用含10％胎牛血清的DMEM培养液制备成细胞密度约为6×104/mL的单细胞悬液，接种于9块96孔培养板，每板设A、B、C、D、 E、F、G、H、I实验组及调零组，每组10孔，实验组每孔中均加入细胞悬液100μL，37℃、5％CO2条件下静置培养。待细胞贴壁生长后弃去原培养液，PBS反复冲洗，按实验分组加样。加样24小时、48小时、72小时、96小时、120小时后，每孔加入新鲜配制的5mg/mL的无菌MTT溶液，继续培养4小时终止培养。小心弃去原培养液，每孔加入150μL DMSO(Dimethyl sulfoxide，二甲基亚砜)，室温下微量振荡器振荡培养板10分钟使结晶物充分溶解。用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定各孔O.D.(optical density，光学密度)值。实验重复三次取各组平均值。计算RGR(relative growth rate，细胞相对增殖率)，计算公式：RGR＝(实验组O.D.值/培养基O.D.值)×100％，对各组结果进行评价，结果见表4。
从表4可以看出，本发明实施例所述的具有抗菌功能的医用钽铜合金与对比例的钽铜合金相比具有更优的细胞相对增值率，且铜优选范围内的钽铜合金具有最高的细胞相对增值率，说明铜的加入不仅赋予钽金属优异的抗菌性能，同时提高了其生物相容性能。而对比例中提供的钽铜合金，除对比例5(低铜含量，然而抗菌性能较差)、对比例7(纯钽)的细胞相对增值率较优外，其余对比例，即使有些对比例的铜范围在本发明提供的范围内，但由于其热等静压制备工艺参数没有在本发明提供的权利要求范围内，导致其力学性能、致密性以及耐蚀性能均较差，因而最终导致细胞相对增值率过低，不满足生物医用材料对植入物生物相容性的相关标准。
4、细胞凋亡率检测：
将实施例1-9和对比例1-7的钽合金进行流式细胞检测，进而进一步定量检测实验材料的细胞相容性。将浓度为2×105/ml的细胞毒性检测中培养 的MG63细胞接种于实验材料表面。48h后胰酶消化，冷PBS吹打重悬细胞，将重悬的细胞悬液在4℃、1000r/min离心10min。将收集到的细胞移入流式管中，用PBS洗2次，用200μL的Buffer缓冲液重悬细胞。加入10μLAnnexinV-FITC和5μL PI，轻轻混匀，在室温下避光孵育10-15min。在500-1000r/min下离心5min，加入300μL Buffer缓冲液，在1h内用流式细胞仪检测不同材料培养的细胞凋亡情况，计算细胞凋亡率，结果见表4。
从表4可以看出，本发明实施例所述的具有抗菌功能的医用钽铜合金与对比例的钽合金相比细胞凋亡数量较少，甚至铜优选范围内的钽铜合金细胞凋亡数量最少，说明铜的加入不仅赋予钽金属优异的抗菌性能，同时提高了其生物相容性能。而对比例中提供的钽铜合金，对比例7(纯钽)的细胞凋亡率较低，其余对比例，即使有些对比例的铜范围在本发明提供的权利要求范围内，由于其热等静压制备工艺参数没有在本发明提供的权利要求范围内，导致其力学性能、致密性以及耐蚀性能均较差，因而最终导致细胞凋亡率显著增高，具有较差的生物相容性。
5、点蚀电位性能测试：
将实施例1-9和对比例1-7的钽合金进行耐蚀性能检测，即根据点蚀电位测量方法(国家标准：GB/T 17899-1999)对本发明实施例1-9和对比例1-7的钽合金进行阳极极化曲线测试，测试结果见表4。
从表4可以看出，本发明实施例所述具有抗菌功能的医用钽合金与对比例的钽铜合金相比，具有较高的点蚀电位，特别是铜元素优选范围内的钽铜合金具有最高的点蚀电位，说明其具有较强的耐点蚀能力。本发明所述合金的点蚀电位满足国家相应标准要求，即点蚀电位超过800mV，能够 显著增强材料的耐微生物腐蚀能力，提高材料的抗腐蚀风险。而对比例提供的钽铜合金，即使有些对比例的铜范围在本发明提供的范围内，由于其热等静压制备工艺参数没有在本发明提供的权利要求范围内，因此耐点蚀能力有所下降，具有较差的耐点蚀能力。
表4实施例和对比例钽铜合金的性能检测结果
综上，通过以上实施例可知，只有当Cu含量、热等静压制备工艺参同时在本发明提供的权利要求范围内，才能制备出同时兼具优良的力学性能、 致密性、耐蚀性能、抗菌功能以及生物相容性的新型抗菌医用钽铜合金。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围。