专利名称：发育促进因子、其制法及用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术和医学领域，具体地说，本发明涉及新的编码发育促进因子(Development Promoting Factor，简称为“DPF”)的多核苷酸，以及此多核苷酸编码的多肽。本发明还涉及此多核苷酸和多肽的用途和制备。具体地说，本发明的多肽是一种源自输卵管分泌物的、具有克服早期胚胎发育阻断的唯一因子。
背景技术：
哺乳动物早期胚胎的发育受母型基因调控，即由贮存在卵球中的母系mRNAs和其衍生的蛋白质调控。这些母型mRNAs和蛋白质的适时定位、激活、表达和消失决定着早胚细胞的发育命运。
早胚发育至一定时期，必须实现由母型调控向合子型调控的过渡，届时母型转录本成批降解，合子型基因表达并主宰进一步的发育。在小鼠，这种过渡发生在2-细胞期。然而，如果将小鼠受精卵离体培养在化学组份确定的培养基中，早期胚胎往往不能完成从受精卵到囊胚的发育全过程，而是停顿在2-细胞期，此现象称为“2-细胞阻断”。引起人们高度重视的是，这类发育阻断不仅普遍存在于哺乳动物中，而且其阻断的时间与早胚发育由母型向合子型调控过渡的时间完全吻合。相反，倘若将受精卵置于输卵管，或于输卵管液中培养，或于输卵管上皮细胞共培养，或在输卵管上皮细胞条件培养液中培养，均能克服此类发育阻断，继续正常发育。此外，研究还表明，源自输卵管上皮细胞分泌物的促发育作用无种专一性。由此推测，输卵管不仅是早胚发育的“场所”，而且分泌某些参与克服发育阻断作用的因子，从而确保早胚实现其正常发育调控的过渡。在缺乏源自输卵管上皮细胞的“信号”的条件下，小鼠早胚发育就停顿在2-细胞期G2相，发生早胚发育阻断。
迄今为止，只见能涉及可能存在该类信号或因子“相关证据”的报道，而对这一类因子进一步的确证、分离纯化及克隆未见报道。因此是否存在该类调控过渡的因子就一直有争议。特别是在将其它躯体细胞(如成纤维细胞)作为体外培养“饲养层细胞”与早胚共培养，或在常规培养基中加入生长因子、离子螯合剂或去自由基试剂，或改变葡萄糖的添加时间，都在一定程度上起克服早胚发育阻断的作用。Bavister在1992年甚至提出，只要严格控制体外培养的环境质量，选择适当的培养基，早胚能顺利发育，无需输卵管上皮细胞的存在。
与此相反，Poueymirou等证实有依赖cAMP的蛋白激酶(PKA)催化的蛋白质磷酸化反应参与了小鼠2-细胞期早胚合子型基因活化的调控机制。Schwartz等进一步又证实佛波酯“TPA”无能刺激具完整细胞核的卵母细胞中TPA反应元件(TRE)驱动的β-半乳糖苷酶报告基因的表达，却能刺激经aphidicolin处理仍能阻遏在1-细胞期早胚中的报告基因的表达。这些实验分析结果均提示有不同的信号转导系统参与活化合子型基因的可能性。
然而，迄今为止还未有发现与胚胎发育阻断有关的物质的报道。
因此，本领域迫切需要开发与胚胎发育阻断有关的物质及其制备方法。
本发明的目的是提供一种新的发育促进因子(Development Promoting Factor，DPF)-DPF蛋白以及其片段、类似物和衍生物。
本发明的另一目的是提供编码这些多肽的多核苷酸。
本发明的另一目的是提供生产这些多肽的方法以及该多肽和编码序列的用途。
在本发明的第一方面，提供新颖的分离出的DPF多肽，它包括具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽。
在本发明的第二方面，提供编码分离的这些多肽的多核苷酸，该多核苷酸包含一核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少70％相同性(a)编码上述DPF多肽的多核苷酸；和(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。较佳地，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO2或3所示氨基酸序列的多肽。更佳地，该多核苷酸的序列是选自下组的一种(a)具有SEQ ID NO1中53-1477位的序列；(b)具有SEQ ID NO1中101-1477位的序列；(c)具有SEQ ID NO1中1-1906位的序列。
在本发明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的载体，以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。
在本发明的第四方面，提供了制备具有DPF蛋白活性的多肽的方法，该方法包含(a)在适合表达DPF蛋白的条件下，培养上述被转化或转导的宿主细胞；(b)从培养物中分离出具有DPF蛋白活性的多肽。
在本发明的第五方面，提供了与上述的DPF多肽特异性结合的抗体。还提供了可用于检测的核酸分子，它含有上述的多核苷酸中连续的约15-1906个核苷酸。
在本发明的第六方面，提供了模拟、促进、拮抗DPF多肽活性的化合物，以及抑制DPF多肽的表达的化合物。还提供了筛选和/或制备这些化合物的方法。较佳地，该化合物是DPF多肽的编码序列或其片段的反义序列。
在本发明的第七方面，提供了检测样品中是否存在DPF蛋白的方法，它包括将样品与DPF蛋白的特异性抗体接触，观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在DPF蛋白。
在本发明的第八方面，提供了一种检测与DPF多肽异常表达相关的疾病或疾病易感性的方法，该方法包括检测编码所述多肽的核酸序列中是否存在突变。
在本发明的第九方面，提供了本发明多肽和编码序列的用途。例如本发明多肽可被用于筛选促进DPF多肽活性的激动剂，或者筛选抑制DPF多肽活性的拮抗剂、或者被用于肽指纹图谱鉴定。本发明的DPF蛋白的编码序列或其片段，可被作为引物用于PCR扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列。
在本发明的第十方面，提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明的DPF多肽或其激动剂、拮抗剂以及药学上可接受的载体。这些药物组合物可治疗妇女不育症等病症。
本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。
图1是抗DPF多抗血清与小鼠受精卵发育关系的剂量反应曲线(每组受精卵数为40-42枚)。
图2是本发明的DPF的cDNA序列和推定的DPF蛋白的全长氨基酸序列。
图3是GST-NTP367 DPF与小鼠受精卵发育关系的剂量反应曲线(每组受精卵为37-39枚)。GST-NTP367 DPF的剂量是指在50ml培养液中所加GST-NTP DPF的mg数，培养液由F10、M16、胎牛血清、EGF、运铁蛋白和胰岛素组成。
图4是GST-CTP92 DPF与小鼠受精卵发育关系的剂量反应曲线(每组受精卵为37-39枚)。GST-CTP92 DPF的剂量是指在50ml培养液中所加GST-CTP92 DPF的mg数，培养液由F10、M16、胎牛血清、EGF、运铁蛋白和胰岛素组成。
图5是抗CTP92 DPF多抗血清与小鼠受精卵发育关系的剂量反应曲线(每组受精卵为38-41枚)。抗CTP92 DPF多抗血清的剂量是指在50ml培养液中所加抗CTP92DPF多抗血清的ml数，培养液由F10、M16、胎牛血清、EGF、运铁蛋白和胰岛素组成。
图6显示了不同组织总RNA的Northern印迹结果。其中以32P标记的DPF cDNA片段为探针，泳道1-8分别代表来自兔肌肉、心脏、肾脏、输卵管、肝脏、脾脏、肺和小肠的总RNA的Northern印迹结果。
图7不同组织蛋白SDS-PAGE凝胶电泳分离后的Western印迹分析结果以抗DPF单克隆抗体作探针。泳道1-10分别代表来自肝脏、心脏、肺、脾脏、输卵管、子宫、卵巢、小肠、骨骼肌和脑组织的蛋白免疫印迹结果。
图8人输卵管组织蛋白SDS-PAGE凝胶电泳分离后的Western印迹分析结果，以抗DPF单克隆抗体作探针，人输卵管组织的蛋白免疫印迹结果。
图9不同物种输卵管蛋白中DPF及相关分子的Western印迹密度扫描图谱。其中，以抗DPF单克隆抗体作探针。上图分别代表来自昆明小鼠和新西兰大白兔的输卵管蛋白印迹光密度扫描的图谱。
图10人输卵管组织总RNA的Northern印迹结果。其中以DPF cDNA为模板合成放射性标记探针。泳道3，4分别代表两个不同人输卵管组织总RNA的Northern印迹结果。
本发明人经过多年广泛而深入的研究，获得了具有促进发育功能的输卵管因子存在的“功能缺失证据”，证实了体内早胚全面的正常发育必须依赖源自躯体细胞合成和分泌的固有天然“信号”。
具体而言，本发明借助于实验分析所获得的“相关性”和“功能缺失证据”，首次证实兔输卵管分泌物中具有解除受精后早胚发育阻断和实现早胚由母型向合子型调控过渡的物质是一种糖蛋白，命名为Development Promoting Factor(DPF)。DPF蛋白表观分子量为64KD，pI为7.2-8.1，功能上无种专一性，对牛、羊、猪、大鼠和小鼠的受精卵发育都有促进作用。此外，DPF蛋白不同于目前国际上所关注的且功能尚不清楚的雌激素依赖性oviductins。
在本发明的一个实施例中，建立了兔输卵管粘膜上皮的cDNA文库，并通过抗体筛选到长0.7kb左右的3＇端DPF cDNA。DPF分布具组织专一性，只存在于输卵管，其它主要脏器中均不存在。Northern印迹分析亦证实该蛋白mRNAs只存在于输卵管并证实其mRNA全长为1.9kb左右。以0.7kb左右的3＇端DPF cDNA，并进行了测序和序列分析。通过基因检索证明所得到的基因为一新基因。进一步筛选克隆和测序后发现了全长的DPF cDNA。
在本发明的另一实施例中，利用GST融合基因表达系统，表达和纯化了DPF，NTP DPF(1-367)(DPF的N末端肽(N-terminal peptide of DPF))和CTPDPF(368-459)(DPF的C末端肽(C-terminal peptide of DPF))，并相应制备了抗血清，用GST-Sepharose 4B亲和层析柱和GST-CTP DPF(368-459)-Sepharose4B亲和层析柱对多抗进行了纯化，用纯化的兔抗CTP DPF(368-459)多抗构建了亲和层析柱并用它纯化出了兔天然DPF。
在另一实施例中，用天然DPF及表达纯化的融合蛋白进行了功能获得实验，取得DPF的功能获得性证据。用多抗进行了功能封闭实验以确定DPF中起作用的主要部位。
在本发明中，术语“DPF蛋白”、“DPF多肽”或“发育促进因子DPF”可互换使用，都指具有兔发育促进因子DPF氨基酸序列(全长序列见SEQ ID NO2；成熟蛋白的序列见SEQ ID NO3)的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的发育促进因子DPF，以及含有或不含信号肽的发育促进因子DPF如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
如本文所用，“分离的DPF蛋白或多肽”是指DPF多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化DPF蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。
本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。
本发明还包括DPF蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然DPF蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
在本发明中，术语“DPF多肽”指具有DPF蛋白活性的SEQ ID NO.3或2序列的多肽。该术语还包括具有与DPF蛋白相同功能的、SEQ ID NO.3或2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括DPF蛋白的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与DPF DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗DPF多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含DPF多肽或其片段的融合蛋白(如DPF与GST的融合蛋白)。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了DPF多肽的可溶性片段。通常，该片段具有DPF多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
发明还提供DPF蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然DPF多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
在本发明中，“DPF蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO2或3的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
表1
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ IDNO2或3的蛋白质，但与SEQ ID NO1所示的相应编码区序列有差别的核酸序列。
编码DPF成熟多肽的多核苷酸包括只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％ Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码DPF蛋白的多聚核苷酸。
本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。
本发明的DPF核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science1985；2301350-1354)被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或DPF蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
通过常规的重组DNA技术(Science，1984；2241431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的DPF多肽。一般来说有以下步骤(1).用本发明的编码DPF多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中，DPF多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。在本发明中适用的载体包括但不限于在细菌中表达的基于T7的表达载体；在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含DPF编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，a Laboratory Manual，coldSpring Harbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS细胞的动物细胞等。
本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
重组的DPF蛋白或多肽有多方面的用途。这些用途包括(但不限于)直接做为药物治疗DPF蛋白功能低下或丧失所致的疾病(如某些妇女不育症)，和用于筛选促进或对抗DPF蛋白功能的抗体、多肽或其它配体。用表达的重组DPF蛋白筛选多肽库可用于寻找有治疗价值的能抑制或刺激DPF蛋白功能的多肽分子。
另一方面，本发明还包括对DPF DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于DPF基因产物或片段。较佳地，指那些能与DPF基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制DPF蛋白的分子，也包括那些并不影响DPF蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的DPF基因产物结合的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab＇或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的DPF基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达的DPF蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备。本发明的抗体包括能阻断DPF蛋白功能的抗体以及不影响DPF蛋白功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用DPF基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与DPF基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。
抗DPF蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的DPF蛋白。
本发明中的抗体可用于治疗或预防与DPF蛋白相关的疾病。给予适当剂量的抗体可以阻断DPF蛋白的产生或活性。本发明抗体的另一重要用途是作为可逆性避孕的药物。
利用本发明蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与DPF蛋白发生相互作用的物质，如受体、抑制剂、激动剂或拮抗剂等。
本发明蛋白及其抗体、抑制剂、激动剂、拮抗剂或受体等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)肌内、腹腔内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。
本发明的多肽可直接用于疾病治疗，例如，用于妇女不育症方面的治疗。在使用本发明DPF蛋白时，还可同时使用其他治疗剂。
本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明DPF多肽或其激动剂、拮抗剂以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的DPF蛋白或其拮抗剂、激动剂施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
DPF蛋白的多聚核苷酸也可用于多种治疗目的。基因治疗技术可用于治疗由于DPF蛋白的无表达或异常/无活性的DPF蛋白的表达所致的细胞增殖、发育或代谢异常。重组的基因治疗载体(如病毒载体)可设计成表达变异的DPF蛋白，以抑制内源性的DPF蛋白活性。来源于病毒的表达载体如逆转录病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒、单纯疱疹病毒、细小病毒等可用于将DPF基因转移至细胞内。构建携带DPF基因的重组病毒载体的方法可见于已有文献(Sambrook，et al.)。另外重组DPF基因可包装到脂质体中，然后再转移至细胞内。
本发明还涉及定量和定位检测DPF蛋白水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括FISH测定和放射免疫测定。试验中所检测的DPF蛋白水平，可以用作解释DPF蛋白在各种疾病中的重要性和用于诊断DPF蛋白起作用的疾病。
一种检测检测样品中是否存在DPF蛋白的方法是利用DPF蛋白的特异性抗体进行检测，它包括将样品与DPF蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在DPF蛋白。
DPF蛋白的多聚核苷酸可用于DPF蛋白相关疾病的诊断和治疗。在诊断方面，DPF蛋白的多聚核苷酸可用于检测DPF蛋白的表达与否或在疾病状态下DPF蛋白的异常表达。如DPF DNA序列可用于对活检标本的杂交以判断DPF蛋白的表达异常。杂交技术包括Southern印迹法，Northern印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术，相关的试剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用DPF蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测DPF蛋白的转录产物。
检测DPF基因的突变也可用于诊断DPF蛋白相关的疾病。DPF蛋白突变的形式包括与正常野生型DPF DNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外，突变有可能影响蛋白的表达，因此用Northern印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变。
本发明的序列对染色体鉴定也是有价值的。简而言之，根据本发明DPF蛋白的cDNA制备PCR引物(优选15-35bp)，可以将序列定位于染色体上。然后，将这些引物用于PCR筛选含各条人染色体的体细胞杂合细胞。只有那些含有相应于引物的人基因的杂合细胞会产生扩增的片段。
一旦序列被定位到准确的染色体位置，此序列在染色体上的物理位置就可以与基因图数据相关联。这些数据可见于例如，V.Mckusick，Mendelian Inheritancein Man(可通过与Johns Hopkins University Welch Medical Library联机获得)。然后可通过连锁分析，确定基因与业已定位到染色体区域上的疾病之间的关系。
在本发明的一个实例中，提供了一种分离的多核苷酸，它编码具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。本发明的多核苷酸是从兔输卵管cDNA文库中分离出的。其序列如SEQ ID NO1所示，它包含的多核苷酸序列全长为1906个碱基，其开放读框位于53-1477位，编码全长为475个氨基酸的DPF蛋白(SEQ ID NO2)。去除了19个氨基酸信号肽后的成熟DPF，具有459个氨基酸(SEQ ID NO3)。
Western印迹分析已证实，被检测的其它物种(人、小鼠、金黄田鼠)的输卵管分泌物中均含DPF相关分子。因此，利用本发明公开的内容(尤其是DPF的核苷酸序列和氨基酸)，可以从人输卵管cDNA文库中筛选、克隆DPE-1同源分子，并进行结构和功能方面的深入分析。用本发明人构建的较高质量的人输卵管上皮细胞cDNA文库，通过Northern印迹分析表明，人相关DPFcDNA约为3.5kb。这为人相关DPFcDNA的筛选及人相关DPF的研究奠定了基础。
通过对“DPF”结构和功能的进一步分析，借助于DPF对早胚细胞信号传导系统影响的研究，以及对导致G2→M相过渡所依赖的驱动器(p34cdc2/Cyclin B)形成和活化过程影响的研究，并观察可能由此带来的染色质结构变化，完全有助于阐明受精后早胚发育及发育阻断的机制。另外在医学、农牧业等方面也有非常重要的应用价值，通过改造、选择合适的载体与免疫途径，DPF还有望成为一种干扰局部微环境而阻断早胚发育的新型避孕疫苗，因此因而具有巨大的应用前景。
具体而言，本发明具有以下潜在的应用前景(1)人工辅助生育技术供移植的人类胚胎质量决定着助孕的成功率和胚胎进一步发育的质量。着床前早胚发育的关键环节之一是克服早胚发育阻断，使胚胎能按着固有的程序正常发育。DPF就是输卵管粘膜上皮细胞提供的克服早胚发育阻断的唯一因子。
(2)免疫避孕目前免疫避孕的抗原研究主要集中在三类靶抗原，即卵外围的透明带抗原、精子抗原和激素抗原。DPF有望成为免疫避孕用的第四类抗原。基于DPF是输卵管上皮细胞特有的分泌蛋白，其抗体的避孕安全性会明显提高。
(3)部分不明原因的妇女不育症的诊断和治疗妇女不育症的病因很多，但迄今尚未考虑到输卵管上皮细胞DPF基因表达异常或妇女产生抗DPF抗体等原因亦可导致不育的可能性。本实验室提供的DPF及其抗体可用于此类病因的鉴别诊断。
(4)家畜的繁殖DPF的功能无种专一性，因此本实验室提供的兔DPF或人DPF，均能提高家畜的受孕率。
(5)早胚发育的基础研究着床前早胚发育的质量决定着床后早胚发育的质量。借助于DPF，人们有可能在体外研究着床前早胚发育的固有程序，为全面建立早胚质量的鉴别指标和技术奠定基础。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1抗64kDa蛋白的抗体对早期胚胎发育有阻断作用在体外，于成份确定的培养液中，受精后的早胚发育会遭阻断。这种早胚发育阻断为普遍存在的现象。发育阻断发生的时间正是早胚发育由母型(源自卵的发育调控元件)调控向合子型(源自合子基因组表达的发育调控元件)调控过渡的时期。母型向合子型调控过渡的时间随动物而异，例如鼠为2-细胞期早胚，人为8-细胞期早胚。而输卵管分泌物(或输卵管粘膜上皮细胞条件培液)具有克服早胚发育阻断的作用。
为此，在该实施例中，收集兔输卵管分泌物，沉淀蛋白质。并通过制备性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质各组份，免疫BALB/c小鼠，取得针对各组份蛋白质的多抗。
结果表明，唯独针对分子量约64,000道尔顿的蛋白质(DPF)的抗体具100％抑制培养在输卵管粘膜上皮细胞条件培液中小鼠早胚发育的作用，使之无法由2-细胞期早胚发育至4-细胞期早胚(1)。
实施例2 DPF cDNA的克隆用常规方法构建兔输卵管粘膜上皮的cDNA文库，并通过实施例1的抗体筛选到一长0.7kb左右的3＇端DPF cDNA。以0.7kb左右的3＇端DPF cDNA，并进行了测序和序列分析。通过基因检索证明所得到的基因为一新基因。
进一步筛选发现，有一个cDNA克隆的DNA序列为新的全长cDNA。通过合成一系列引物对新克隆所含的DNA序列进行双向测定。计算机分析表明，克隆所含的全长cDNA是一个新的cDNA序列(如SEQ ID NO1所示)，编码一个新的蛋白质(如SEQ ID NO2所示)。此蛋白质被命名为DPF蛋白，其编码基因命名为DPF蛋白基因。
DPF的全长cDNA序列为1906bp(图2和SEQ ID NO1)，含有完整的开放性读框(53-1477)，编码含475氨基酸残基的多肽(图2和SEQ ID NO2)。根据分析，已表明DPF蛋白含有16个氨基酸残基组成的信号肽，成熟的多肽分子由459个氨基酸残基组成(SEQ ID NO3)。
实施例3用RT-PCR方法克隆DPF蛋白的编码序列用常规方法提取兔输卵管粘膜上皮细胞总RNA，取6mg细胞总RNA与0.5μgOligo-dT12-18混合，进行反转录。反转录体系为20μl，反应结束后加80μl ddH2O进行稀释。PCR扩增所用的引物如下有义引物5＇-GCTGGTTCTTGTGCTGGATT-3＇(SEQ ID NO4)，反义引物5＇-GAAAAGCAACTGATGCTCCG-3＇(SEQ ID NO5)。PCR反应体积为50μl，其中含反转录模板10μl、0.4mM引物、0.2mM dNTP和1U ExTaqDNA聚合酶(Takara Inc.)，扩增参数为94℃ 30秒、60℃ 30秒、72℃ 45秒，25个循环后PCR产物行2％琼脂糖凝胶电泳初步确认。DNA序列分析结果表明该PCR产物的DNA编码序列如SEQ ID NO1中28-1866所示，是包括信号肽在内的编码全长阅读框的DPF cDNA。
实施例4 DPF的Northern印迹杂交分析以32P标记的DPF cDNA片段为探针，按常规方法进行Northern印迹。结果如图6所示。
结果表明，DPF只存在于兔输卵管粘膜上皮细胞中，兔其它组织(脑、肺、心、肝、脾、肾、小肠、大肠、卵巢、胰和子宫)中均未检测到。
实施例5 DPF多肽的重组表达和纯化在本实施例中，利用GST融合基因表达系统，表达和纯化了DPF，NTPDPF(1-367)(DPF的N末端肽(N-terminal peptide of DPF))和CTP DPF(368-459)(DPF的C末端肽(C-terminal peptide of DPF))，并相应制备了抗血清，用GST-Sepharose 4B亲和层析柱和GST-CTP DPF(368-459)-Sepharose 4B亲和层析柱对多抗进行了纯化。
在该实施例中，以实施例3中的PCR扩增产物为模板，用序列如下的5＇和3＇端的PCR寡核苷酸引物进行扩增，获得DPF DNA作为插入片段。PCR反应中使用的5＇端寡核苷酸引物序列如下DPF5’端引物5’-TAGAATTCTTACCAACTGGCACATAGTCG-3’(SEQ ID NO6)3’端引物5’-TTGCGGCCGCGAAAAGCAACTGATGCTCCG-3’(SEQ ID NO7)
DPF-NTP5’端引物5’-TAGAATTCTTACCAACTGGCACATAGTCG-3’(SEQ ID NO8)3’端引物5’-TTGCGGCCGCAGGTGAGTTCTTGAAAAATTC-3’(SEQ ID NO9)DPF-CTP5’端引物5’-CGGAATTCTTCAAGAACTCACCTGGCCGTG-3’(SEQ ID NO10)3’端引物5’-TTGCGGCCGCGAAAAGCAACTGATGCTCCG-3’(SEQ ID NO11)各DPF蛋白cDNA PCR产物纯化后经EcoRI和NotI双酶切再与质粒pGEX-4T-3(Pharmacia公司)按常规方法重组并转化至感受态大肠杆菌DE3，从而得到三种重组载体pGEX-4T-3/DPF、pGEX-4T-3/DPF-NTP和pGEX-4T-3/DPF-CTP。
分别挑取含有重组表达载体pGEX-4T-3/DPF、pGEX-4T-3/DPF-NTP或pGEX-4T-3/DPF-CTP的DE3克隆接种于100ml 2×YTA培养基中，37℃ 300rpm振荡培养12-15hr，1∶50稀释于预热的2×YTA培养基继续振荡培养6-8小时，加100mM IPTG至0.1mM后37℃诱导2小时，5,000g 4℃离心10min去上清，置冰上用50ml1×PBS(0.14M NaCl，2.7mM KCl，10.1mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，pH7.3)重悬，超声(B.Braun Labsonic U)破碎后再加入20％ Triton X-100至1％轻摇30min，然后12,000g 4℃离心10min，上清用0.8μm滤膜过滤后，过1ml 50％谷胱甘肽Sepharose 4B层析柱，1×PBS充分洗涤后，加入500ul谷胱甘肽洗脱缓冲液(10mM谷胱甘肽，50mM Tris-HCl，pH 8.0)室温静置30分钟后收集洗脱液，重复洗脱2-3次，分别得到GST-DPF、GST-DPF-NTP(1-367)和GST-DPF-CTP(368-459)融合蛋白。
实施例6 DPF的活性部位位于C末端在该实施例中，将实施例5中用GST融合基因表达系统表达并纯化的GST-NTPDPF(1-367)(即GST-NTP367-DPF)和GST-CTP-DPF(368-459)(即GST-CTP92-DPF)，分别加入各种培养基(液)中，观察小鼠受精卵的发育情况。
结果如图3和4所示。GST-NTP367-DPF无克服早胚发育阻断的作用(图3)；GST-CTP92-DPF具有克服早胚发育阻断的作用(图4)。
进一步地用GST-CTP-DPF抗原，免疫免疫成年雄性新西兰大白兔后获得的抗血清。结果发现抗CTP92 DPF的抗体具有功能封闭作用(图5)。
这表明，DPF的活性部位位于C末端。
此外，进一步的实验表明，兔DPF的上述促早胚发育功能无种专一性，在牛、羊、猪和鼠上均可促进早期胚胎发育。
实施例7单克隆抗体的制备酒精沉淀法富集兔输卵管蛋白，12％SDS-PAGE电泳分离、切出64kD蛋白条带(即DPF蛋白)，与弗氏佐剂充分乳化后免疫Balb/C小鼠，免疫4次后，取免疫小鼠脾细胞，在PEG作用下与SD2/0骨髓瘤细胞融合，筛选阳性杂交瘤细胞克隆，扩大培养后收集杂交瘤细胞，注入小鼠腹腔，9天后收集腹水，纯化制备单克隆抗体。
结果获得了抗DPF的单克隆抗体。
实施例8 DPF的Western印迹杂交分析以实施例7制备的抗DPF单克隆抗体作探针，按常规方法进行Western印迹分析，结果如图7所示。
结果表明，DPF只存在于兔输卵管粘膜上皮细胞中，兔其它组织(脑、肺、心、肝、脾、肾、小肠、大肠、卵巢、胰和子宫)中均未检测到。
实施例9人、鼠输卵管分泌物中亦有兔DPF同源分子按与实施例8相同的方法，以抗DPF单克隆抗体作探针，对人输卵管组织进行免疫印迹分析，结果如图8所示。
同时，对不同物种(昆明小鼠和新西兰大白兔)输卵管蛋白中DPF及相关分子的Western印迹密度扫描图谱(其中以抗DPF单克隆抗体作探针)。获得的昆明小鼠和新西兰大白兔的输卵管蛋白印迹光密度扫描图谱如图9所示。
这些结果证实人、鼠的输卵管分泌物中亦有兔DPF同源分子。
实施例10人DPF mRNA的Northern印迹分析以兔DPF cDNA为模板合成放射性标记探针，对按常规方法提取的人输卵管组织总RNA进行Northern印迹分析，结果如图10所示。
结果表明，人DPF mRNA约为3.5kb。
实施例11纯化天然兔DPF按与实施例7相似的方式制备单克隆抗体，不同点在于用DPF-CTP(368-459)替换作为DPF蛋白免疫原。
将抗DPF-CTP(368-459)单抗与用溴化氢活化的Sepharose 4B偶联，制备亲和层析柱。然后，通过亲和层析方法从兔输卵管蛋白中分离纯化天然兔DPF蛋白。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>上海市计划生育科学研究所<120>发育促进因子其制法及用途<130>012029<160>5<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>1906<212>DNA<213>兔<220><221>CDS<222>(53)..(1477)<400>1gatggggaag ctgttgctgt ggcttgggct ggttcttgtg ctggattgca cg atg gcg 58Met Ala1ctg cta caa gct ggt gtg tta ttt tac caa ctg gca cat agt cga ccg 106Leu Leu Gln Ala Gly Val Leu Phe Tyr Gln Leu Ala His Ser Arg Pro5 10 15ggc ccc gcc gcc atc ctg ccc cac gac ctg gac ccg ttt ctc tgc aca 154Gly Pro Ala Ala Ile Leu Pro His Asp Leu Asp Pro Phe Leu Cys Thr20 25 30cac ctg ata ttc gcg ttt gcc tca atg aac gac aat gag atc gtt gct 202His Leu Ile Phe Ala Phe Ala Ser Met Asn Asp Asn Glu Ile Val Ala35 40 45 50aag gat gtc caa gat gag cga att ttc tac cca gag ttc aac aaa ctc 250Lys Asp Val Gln Asp Glu Arg Ile Phe Tyr Pro Glu Phe Asn Lys Leu55 60 65aaa gag agg aac agg gag ctg aaa aca ctg ctg tcc att gga ggg tgg 298Lys Glu Arg Asn Arg Glu Leu Lys Thr Leu Leu Ser Ile Gly Gly Trp70 75 80aac ttc ggc aca acc agg ttc acg cca tgc tgg tct tca ttc gcc agc 346Asn Phe Gly Thr Thr 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权利要求
1.一种分离的DPF多肽，其特征在于，它包含具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，该多肽是具有SEQ ID NO2或3氨基酸序列的多肽。
3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少70％相同性(a)编码如权利要求1和2所述多肽的多核苷酸；(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。
4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO2或3所示氨基酸序列的多肽。
5.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸的序列选自下组的一种(a)具有SEQ ID NO1中53-1477位的序列；(b)具有SEQ ID NO1中101-1477位的序列；(c)具有SEQ ID NO1中1-1906位的序列。
6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求3所述的多核苷酸。
7.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求6所述的载体。
8.一种具有DPF蛋白活性的多肽的制备方法，其特征在于，该方法包含(a)在适合表达DPF蛋白的条件下，培养权利要求7所述的宿主细胞；(b)从培养物中分离出具有DPF蛋白活性的多肽。
9.一种能与权利要求1所述的DPF蛋白特异性结合的抗体。
10.一种检测样品中是否存在DPF蛋白的方法，其特征在于，包括将样品与权利要求9所述的抗体接触，观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在DPF蛋白。
11.一种药物组合物，其特征在于，它含有安全有效量的权利要求1所述的多肽以及药学上可接受的载体。
全文摘要
本发明提供了一种新的发育促进因子－DPF蛋白,编码DPF蛋白的多核苷酸和经重组技术产生这种DPF蛋白的方法。DPF蛋白是一种源自输卵管分泌物的、具有克服早期胚胎发育阻断的唯一因子。本发明还公开了DPF蛋白及其编码序列的用途。本发明还公开了此DPF蛋白受体用于多种疾病(如妇女不育症)的诊断和治疗。本发明还提供了含DPF蛋白的药物组合物。
文档编号C07K16/18GK1384114SQ0111281
公开日2002年12月11日 申请日期2001年4月30日 优先权日2001年4月30日
发明者左嘉客, 顾正, 王健 申请人:上海市计划生育科学研究所