专利名称：：一种双歧杆菌生长促进因子及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种双歧杆菌生长促进因子及其制备方法。
背景技术：
：在人体肠道中栖息着400多种、数量多达百万亿的细菌，其生物量达粪便干重的1/3-1/2。这些细菌按照对人体健康的影响可分为有益、有害和无害三类群，正常情况下这三类群细菌处于相对的平衡状态。若人体有益菌如双歧杆菌等处于优势，则对净化肠道、改善营养、维护人体健康起重要作用。双歧杆菌(说yWok^ten'i/m)是一种益生菌，其主要功能有维持肠道菌群平衡，治疗肠道功能紊乱；抗肿瘤作用；激活免疫系统，提高人体免疫机能;营养作用；控制内毒素的产生；降低自氧化作用，延缓机体衰老；降低血清中胆固醇含量；提高宿主对放射线的耐受性等。由于双歧杆菌对营养要求苛刻，在大多数基质中生长缓慢，所以双歧杆菌的培养和生长常常需要添加双歧杆菌生长促进因子(bifidusfactor)来促进其繁殖和生长。现有的双歧杆菌生长促进因子主要包括以下六类物质①纯寡聚糖类物质..一般是由2-10个单糖通过糖苷键聚合在一起所形成的，如已知的乳果糖、果聚糖、大豆低聚糖、异麦芽糖等二十余种。②蛋白酶解产物及一些蛋白质类物质，如胃粘膜蛋白酶解产物，其生物活性部分为糖蛋白中的寡糖；酪蛋白酶解物；牛奶中的(x-乳清蛋白和乳铁蛋白等。◎多糖类物质，如云芝多糖的水提物；胡萝卜中的含氮多糖。短链脂肪酸类物质，如费氏丙酸杆菌产生的丙酸盐(脂)能刺激和促进双歧杆菌的生长繁殖。⑤天然植物及中草药的提取物，如茶叶中的茶多酚；人参中的人参皂甙及五加科植物的水提物。⑥其他类物质，如双泛酰硫乙胺和泛酰硫氢乙胺等。其中，现有的用作双歧杆菌生长促进因子的蛋白酶解产物主要有酵母提取物、牛肉浸液和大豆酶解产物。现有的大豆酶解产物为只采用胰蛋白酶酶解大豆所得的产物。
发明内容本发明所要解决的技术问题是提供一种与现有的仅用胰蛋白酶酶解大豆制备双歧杆菌生长促进因子的方法相比，具有更好的促进双歧杆菌的繁殖和生长效果的新方法，以及由该方法制得的双歧杆菌生长促进因子。本发明的方法为在水中，用中性蛋白酶酶解大豆，更佳的还加入胰蛋白酶，将其与中性蛋白酶共同酶解大豆(Glycinemax(L.)Merrill),即制得本发明的双歧杆菌生长促进因子。其中，所述的大豆的用量较佳的为7.99-20.00%;所述的水较佳的为去离子水，水的用量较佳的为79.80-92.00%;当仅用中性蛋白酶酶解豆浆时，中性蛋白酶的用量较佳的为0.01-0.2%;当用中性蛋白酶和胰蛋白酶共同酶解时，中性蛋白酶的用量较佳的为0.005-0.1%，胰蛋白酶的用量较佳的为0.005-0.1%;上述百分比皆为占水、大豆和蛋白酶总质量的百分比，所述的蛋白酶为中性蛋白酶或中性蛋白酶加胰蛋白酶。其中，对各原料的要求为本领域常规要求，如胰蛋白酶的酶活为2000-2500u/mg;中性蛋白酶的酶活为100-130u/mg;大豆中水溶性蛋白230.0%，杂质^1.0%，水分^14.0%，子叶变色粒^5.0%;水较佳的为去离子水，去离子水中Na+S0.1%，SiO2<0.05%，pH值二6.5-7.5;百分比为质量百分比。其中，所述的酶解按本领域常规酶解方法操作。优选工艺步骤及其条件如下(1)向水和大豆混合磨桨制得的豆浆中加入酶进行酶解，之后加热酶解液。所述的豆浆可采用市售的豆浆或按本领域常规方法自制。制备方法较佳的为将7.99-20.00%的大豆和自来水在40-8(TC混合3-10小时，之后用去离子水冲洗，再加入79.80-92.00%的去离子水混合磨浆，加热到60-10(TC，维持2-20分钟，冷却至42'C，用氢氧化钠调节豆浆pH为7.5-8.0。所述的酶解的温度较佳的为30-60°C，酶解的时间较佳的为2-10小时。酶解之后，加热酶解液的温度较佳的为60-10(TC，加热时间为2-20分钟。(2)离心取上清液，微孔滤膜抽滤，浓縮，葡聚糖凝胶柱层析，收集紫外光波长为280nm的洗脱液，浓縮至干即可。所述的离心取上清液的较佳操作为先以3024g的速度离心10-50分钟，取上清液，之后再以10000-20000g的速度离心10-50分钟。所述的微孔滤膜的孔径较佳的为0.45^tm。所述的浓缩可采用旋转蒸发仪进行浓縮，较佳的浓縮至蒸发前体积的1/6-1/5。所述的葡聚糖凝胶较佳的为葡聚糖凝胶SephadexG15。柱层析较佳的条件为浓縮物加入量为1毫升；洗脱液为质量百分比为0.01%-0.1%的乙酸铵，洗脱液用量为柱体积的2.5-3.5倍；洗脱液流速为0.4毫升/分钟。洗脱液以收集波长为280nm的洗脱液为准，一般在洗脱7小时15分钟至8小时20分钟的时段进行收集。本发明还涉及由上述方法制得的双歧杆菌生长促进因子。该双歧杆菌生长促进因子可与益生菌合用，用于酸奶或豆酸奶的发酵；也可加入豆浆或牛奶中，用于促进双歧杆菌的生长繁殖，提高双歧杆菌的浓度，从而有利于双歧杆菌生物制品的生产。本发明中所有的原料均市售可得。本发明的积极进步效果在于首次用中性蛋白酶或中性蛋白酶和胰蛋白酶的混合物，酶解大豆，制成双歧杆菌生长促进因子。其在促进双歧杆菌生长的方面的效果大于仅用胰蛋白酶酶解得到的促进因子。该促进因子能很好促进益生菌的生长繁殖，提高双歧杆菌的浓度和活菌数，活菌数是未添加此因子的10倍。具体实施例方式下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。双歧杆菌丹麦丹尼斯克公司胰蛋白酶国药集团化学试剂有限公司中性蛋白酶无锡市雪梅酶制剂科技有限公司葡聚糖凝胶型号为SephadexG15:GEHealthcareBio-sciencesAB公司凝胶柱型号为1.6X100cm层析柱上海锦华层析设备厂MRS培养基德国MerckkGaA公司下述各实施例中的大豆的水溶性蛋白=30.0%，杂质=1.0%，水分=14.0%，子叶变色粒=5.0%;去离子水中Na+=0.1%，SiO2=0.04%，pH值二7.0;百分比为质量百分比；实施例l、3和5中胰蛋白酶的酶活为2000u/mg;中性蛋白酶的酶活为100u/mg;实施例2、4、68和对比实施例中胰蛋白酶的酶活为2500u/mg;中性蛋白酶的酶活130u/mg。下述各实施例中的百分比皆为质量百分比。实施例1双歧杆菌生长促进因子的制造方法①制备豆浆将大豆8.00%和自来水于451:混合8小时，用去离子水冲洗，添加去离子水91.99%,磨浆，于65"C水浴加热18分钟，冷却至42'C，用氢氧化钠调节pH值至8.0;②向步骤①制得的豆浆中添加中性蛋白酶O.OP/。，于35。C酶解8小时，于70。C水浴加热18分钟，离心，取上清液；离心力为3024g，离心时间为IO分钟；③将步骤②的上清液离心，取上清液，0.45pm微孔滤膜抽滤，蒸发水分至体积为蒸发前的1/5，得浓縮物；离心力为15000g，离心时间为35分钟;④将上述浓縮物1ml用葡聚糖凝胶G15过滤层析，0.04%乙酸铵洗脱，乙酸铵用量540ml;紫外检测仪检测，收集紫外光波长为280nm的洗脱液，蒸干溶剂，得双歧杆菌生长促进因子。实施例2双歧杆菌生长促进因子的制造方法①制备豆浆将大豆'8.00。/。和自来水于4(TC混合10小时，用去离子水冲洗，添加去离子水91.99%，磨浆，于60。C水浴加热20分钟，冷却至42"C，用氢氧化钠调节pH值至8.0;②向步骤①制得的豆浆中添加胰蛋白酶0.005%和中性蛋白酶0.005%，于30'C酶解10小时，于6(TC水浴加热20分钟，离心，取上清液；离心力为3024g，离心时间为IO分钟；③将步骤②的上清液离心，取上清液，0.45pm微孔滤膜抽滤，蒸发水分至体积为蒸发前的1/5，得浓縮物；离心力为10000g，离心时间为50分钟；将上述浓縮物1ml用葡聚糖凝胶G15过滤层析，0.01%乙酸铵洗脱，乙酸铵用量450ml;紫外检测仪检测，收集紫外光波长为280nm的洗脱液，蒸干溶剂，得双歧杆菌生长促进因子。实施例3双歧杆菌生长促进因子的制造方法①制备豆浆将大豆9.00。/。和自来水于8(TC混合3小时，用去离子水冲洗，添加去离子水90.96%,磨浆，于10(TC水浴加热2分钟，冷却至42。C，用氢氧化钠调节pH值至7.5;②向步骤①制得的豆浆中添加胰蛋白酶0.025%和中性蛋白酶0.025%，于6(TC酶解2小时，于100。C水浴加热2分钟，离心，取上清液；离心力为3024g，离心时间为50分钟；③将步骤②的上清液离心，取上清液，0.45nm微孔滤膜抽滤，蒸发水分至体积为蒸发前的1/6，得浓縮物；离心力为20000g，离心时间为10分钟；将上述浓縮物1ml用葡聚糖凝胶G15过滤层析，0,1%乙酸铵洗脱，乙酸铵用量630ml;紫外检测仪检测，收集紫外光波长为280nm的洗脱液，蒸干溶剂，得双歧杆菌生长促进因子。8实施例4双歧杆菌生长促进因子的制造方法①制备豆浆将大豆10.00%和自来水于60"混合4小时，用去离子水冲洗，添加去离子水89.95%，磨浆，于95。C水浴加热4分钟，冷却至42。C，用氢氧化钠调节pH值至8.0;②向步骤①制得的豆浆中添加胰蛋白酶0.02%和中性蛋白酶0.02%，于43。C酶解8小时，于95。C水浴加热9分钟，离心，取上清液；离心力为3024g，离心时间为35分钟；◎将步骤②的上清液离心，取上清液，0.45)im微孔滤膜抽滤，蒸发水分至体积为蒸发前的1/5，得浓縮物；离心力为20000g，离心时间为25分钟；将上述浓縮物1ml用葡聚糖凝胶G15过滤层析，0.05%乙酸铵洗脱，乙酸铵用量540ml;紫外检测仪检测，收集紫外光波长为280nm的洗脱液，蒸干溶剂，得双歧杆菌生长促进因子。实施例5双歧杆菌生长促进因子的制造方法①制备豆浆将大豆11.1P/。和自来水于53"C混合5小时，用去离子水冲洗，添加去离子水88.83%，磨浆，于90。C水浴加热5分钟，冷却至42。C，用氢氧化钠调节pH值至8.0;②向步骤制得的豆浆中添加胰蛋白酶0.03%和中性蛋白酶0.03%，于42"酶解8小时，于9(TC水浴加热10分钟，离心，取上清液；离心力为3024g，离心时间为30分钟；③将步骤②的上清液离心，取上清液，0.45pm微孔滤膜抽滤，蒸发水分至体积为蒸发前的1/5，得浓縮物；离心力为18000g，离心时间为30分钟；④将上述浓縮物1ml用葡聚糖凝胶G15过滤层析，0.05%乙酸铵洗脱，乙酸铵用量540ml;紫外检测仪检测，收集紫外光波长为280nm的洗脱液，蒸干溶剂，得双歧杆菌生长促进因子。实施例6双歧杆菌生长促进因子的制造方法①制备豆浆将大豆15.00。/。和自来水于70。C混合4小时，用去离子水冲洗，添加去离子水84.88%，磨浆，于80'C水浴加热12分钟，冷却至42"C，用氢氧化钠调节pH值至8.0;②向步骤制得的豆浆中添加胰蛋白酶0.06%和中性蛋白酶0.06%，于44'C酶解7小时，于85。C水浴加热15分钟，离心，取上清液；离心力为3024g，离心时间为25分钟；③将步骤②的上清液离心，取上清液，0.45pm微孔滤膜抽滤，蒸发水分至体积为蒸发前的1/5，得浓縮物；离心力为15000g，离心时间为45分钟；将上述浓縮物1ml用葡聚糖凝胶G15过滤层析，0.06%乙酸铵洗脱，乙酸铵用量540ml;紫外检测仪检测，收集紫外光波长为280nm的洗脱液，蒸干溶剂，得双歧杆菌生长促进因子。实施例7双歧杆菌生长促进因子的制造方法①制备豆浆将大豆20.00%和自来水于64"混合4.5小时，用去离子水冲洗，添加去离子水79.80%，磨浆，于75"C水浴加热15分钟，冷却至42°C,用氢氧化钠调节pH值至8.0;②向步骤①制得的豆浆中添加胰蛋白酶0.1%和中性蛋白酶0.1%，于44。C酶解7小时，于80。C水浴加热20分钟，离心，取上清液；离心力为3024g，离心时间为40分钟；③将步骤②的上清液离心，取上清液，0.45nm微孔滤膜抽滤，蒸发水分至体积为蒸发前的1/5，得浓縮物；离心力为16000g，离心时间为40分钟；④将上述浓縮物1ml用葡聚糖凝胶G15过滤层析，0.06%乙酸铵洗脱，乙酸铵用量540ml;紫外检测仪检测，收集紫外光波长为280nm的洗脱液，蒸干溶剂，得双歧杆菌生长促进因子。实施例8双歧杆菌生长促进因子的制造方法①制备豆浆将大豆20.00%和自来水于64°(:混合4.5小时，用去离子水冲洗，添加去离子水79.80%，磨浆，于75。C水浴加热15分钟，冷却至42°C，用氢氧化钠调节pH值至8.0;②向步骤①制得的豆桨中添加中性蛋白酶0.2n/。，于44'C酶解7小时，于80'C水浴加热20分钟，离心，取上清液；离心力为3024g，离心时间为40分钟；③将步骤②的上清液离心，取上清液，0.45)im微孔滤膜抽滤，蒸发水分至体积为蒸发前的1/5，得浓縮物；离心力为16000g，离心时间为40分钟；将上述浓縮物1ml用葡聚糖凝胶G15过滤层析，0.06%乙酸铵洗脱，乙酸铵用量540ml;紫外检测仪检测，收集紫外光波长为280nm的洗脱液，蒸干溶剂，得双歧杆菌生长促进因子。对比实施例仅添加胰蛋白酶的双歧杆菌生长促进因子的制造方法①制备豆桨将大豆11.11%和自来水于53"混合5小时，用去离子水冲洗，添加去离子水88.83%,磨浆，于9(TC水浴加热5分钟，冷却至42。C，用氢氧化钠调节pH值至8.0;②向步骤①制得的豆浆中添加胰蛋白酶0.06。/。，于42'C酶解8小时，于90。C水浴加热10分钟，离心，取上清液；离心力为3024g，离心时间为30分钟；③将步骤②的上清液离心，取上清液，0.45jiim微孔滤膜抽滤，蒸发水分至体积为蒸发前的1/5，得浓縮物；离心力为18000g，离心时间为30分钟;④将上述浓缩物1ml用葡聚糖凝胶G15过滤层析，0.05%乙酸铵洗脱，乙酸铵用量540ml;紫外检测仪检测，收集紫外光波长为280nm的洗脱液，蒸干溶剂，得双歧杆菌生长促进因子。效果实施例1双歧杆菌生长促进因子对双歧杆菌生长的促进作用将实施例18和对比实施例的双歧杆菌生长促进因子按5%的比例添加至纯豆浆培养基中，接种双歧杆菌，与空白样(指没有添加过促进因子的豆浆)在相同条件下进行发酵培养，平板计数双歧杆菌活菌数来考察双歧杆菌促进因子的增殖作用。具体步骤如下-(1)浸泡将干豆洗净，用50'C左右的温水浸泡5小时；(2)磨浆用水冲洗后，进行磨浆，得空白样；(3)向步骤(2)中的空白样中添加双歧杆菌生长促进因子；(4)灭菌90。C热处理5分钟；(5)预热将步骤(4)得到的豆浆在无菌条件下预热至约42。C;(6)接种在无菌条件下添加用无菌水溶解的双歧杆菌菌粉，添加量为0.1g菌粉/100g豆浆；(7)发酵放置于42'C恒温箱连续发酵7小时；(8)平板计数将发酵好的豆酸奶震荡均匀，用无菌水按照10"的梯度进行梯度稀释，使用双歧杆菌检验用培养基TPY琼脂培养基作培养基，通过平板计数法检测活菌数，与空白样相比，实施例18和对比实施例的双歧杆菌生长促进因子增加的双歧杆菌活菌的倍数列于表1中。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>由以上数据显示，本专利所提及的提取物对双歧杆菌的生长具有明显的促进作用。效果实施例2双歧杆菌生长促进因子对双歧杆菌生长的促进作用2将实施例5的双歧杆菌生长促进因子按5%的比例添加至MRS培养基中生长，接种双歧杆菌，发酵培养，平板计数双歧杆菌活菌数来考察双歧杆菌促进因子的增殖作用。具体步骤如下(1)接种在无菌条件下将用无菌水溶解的双歧杆菌菌粉添加到MRS培养基中，添加量为O.lg菌粉A00g培养基。MRS是微生物领域里常有的培养基，其MRS分别是MAN,ROGOSA，SHARPE三个单词的縮写；(2)将实施例5中的双歧杆菌生长促进因子按5%的比例添加至步骤(1)得到的MRS培养基中生长；(3)发酵放置于42"C恒温箱连续发酵7小时；(8)平板计数将发酵好的培养基，用无菌水按照10—1的梯度进行梯度稀释使用双歧杆菌检验用培养基TPY琼脂培养基作培养基，通过平板计数法检测活菌数，双歧杆菌生长促进因子增加的双歧杆菌活菌的倍数列于表2中。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>权利要求1、一种双歧杆菌生长促进因子的制备方法，其特征在于在水中，用中性蛋白酶酶解大豆，即制得双歧杆菌生长促进因子。2、如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的中性蛋白酶的用量为0.01-0.2%;所述的百分比为中性蛋白酶质量占水、大豆和中性蛋白酶总质量的百分比。3、如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的中性蛋白酶的酶活为100-130u/mg。4、如权利要求1所述的制备方法，其特征在于在水中进行所述的酶解时还加入胰蛋白酶，将其与中性蛋白酶共同酶解大豆。5、如权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述的中性蛋白酶的用量为0.005-0.1%;胰蛋白酶的用量为0.005-0.1%;所述的百分比为中性蛋白酶或胰蛋白酶的质量占水、大豆、中性蛋白酶和胰蛋白酶总质量的百分比。6、如权利要求1或4所述的制备方法，其特征在于所述的大豆的用量为7.99-20.00%;所述的水的用量为79.80-92.00%;所述的百分比为大豆或水占水、大豆、和蛋白酶总质量的百分比，所述的蛋白酶为中性蛋白酶，或中性蛋白酶加胰蛋白酶。7、如权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述的胰蛋白酶的酶活为2000-2500u/mg。8、如权利要求1所述的制备方法，其特征在于其包含下述步骤(1)向水和大豆混合磨浆制得的豆浆中加入酶进行酶解，之后加热酶(2)离心取上清液，微孔滤膜抽滤，浓縮，葡聚糖凝胶柱层析，收集紫外光波长为280nm的洗脱液，浓縮至干即可。9、如权利要求8所述的制备方法，其特征在于步骤(1)中，所述的豆浆的pH为7.5-8.0;所述的酶解的温度为30-60°C，酶解的时间为2-10小时；酶解之后，所述的加热酶解液的温度为60-10(TC，加热时间为2-20分钟；步骤(2)中，所述的离心取上清液的操作为先以3024g的速度离心10-50分钟，取上清液，之后再以10000-20000g的速度离心10-50分钟；所述的微孔滤膜的孔径为0.45所述的浓縮的操作为浓縮至蒸发前体积的1/6-1/5;所述的葡聚糖凝胶柱为葡聚糖凝胶SephadexG15;柱层析条件为浓縮物加入量为1毫升；洗脱液为质量百分比为0.01%-0.1%的乙酸铵，洗脱液用量为柱体积的2.5-3.5倍；洗脱液流速为0.4毫升/分钟；在洗脱7小时15分钟至8小时20分钟的时段进行收集。10、用权利要求19任一项所述的方法制得的双歧杆菌生长促进因子。全文摘要本发明公开了一种双歧杆菌生长促进因子的制备方法在水中，用中性蛋白酶酶解大豆，即制得双歧杆菌生长促进因子。本发明还涉及本发明的双歧杆菌生长促进因子的制备方法制得的双歧杆菌生长促进因子。本发明首次用中性蛋白酶或中性蛋白酶和胰蛋白酶的混合物，酶解大豆，制成双歧杆菌生长促进因子。其在促进双歧杆菌生长的方面的效果大于仅用胰蛋白酶酶解得到的促进因子。该促进因子能很好促进益生菌的生长繁殖，提高双歧杆菌的浓度和活菌数，活菌数是未添加此因子的10倍。文档编号C12P21/06GK101643765SQ20081004138公开日2010年2月10日申请日期2008年8月5日优先权日2008年8月5日发明者徐成勇,王荫榆,郭本恒申请人:光明乳业股份有限公司