具有增强的稳定性的免疫原性HBc嵌合体颗粒的制作方法

专利名称：具有增强的稳定性的免疫原性HBc嵌合体颗粒的制作方法
技术领域：
本发明涉及免疫学和蛋白质工程领域的交叉部分，并且特别涉及通过工程方法生产的具有增强的自我组装颗粒稳定性和免疫原性表位展示的嵌合乙型肝炎病毒(HBV)核壳蛋白。
背景技术：
嗜肝DNA病毒科是具有被膜的、含有DNA的动物病毒，它能导致人体的乙型肝炎(HBV)。嗜肝DNA病毒科包括其他动物的乙型肝炎病毒，例如土拨鼠(WHA)和地松鼠(GSHV)和存在于鸭(DHV)和灰苍鹭(HeHV)中的禽病毒。本文所说的乙型肝炎病毒(HBV)表示嗜肝DNA病毒科的多个成员，除非有关讨论被指明是一种特定的例子。
根据病毒的亚型，哺乳动物乙型肝炎病毒(HBV或嗜肝DNA病毒)的核壳或核心含有具有183或185个氨基酸残基的序列，而鸭病毒衣壳含有262个氨基酸残基。若干种嗜肝DNA病毒科的乙型肝炎核心蛋白单体，能在受感染的细胞中自我组装成被称为乙型肝炎核心蛋白颗粒(HBc颗粒)的稳定聚集体。业已报导了HBc颗粒的两种三维结构。第一种结构包括具有作为二聚体的90个拷贝的HBc亚基蛋白或180个独立的单体蛋白的小群体，而第二种结构包括具有作为二聚体的120个拷贝的HBc亚基蛋白或240个独立的单体蛋白的大群体。以上颗粒分别被称为T＝4或T＝3颗粒，其中，“T”是三角形的数量。所述人感染性病毒(人病毒)的HBc颗粒的直径分别为大约10或34纳米。Pumpenset al.(1995)Intervirology，3863-74；和Metzger et al.(1998)J.Gen.Viol.，79587-590。
Conway et al.，(1997)Nature，38691-94披露了分辩率为9埃的人HBc颗粒的结构。Bottcher et al.(1997)，Nature，38688-91披露了人HBc单体的多肽折叠，并且提供了对形成α螺旋区及其连接环区的氨基酸残基进行大致计数的方法。Zheng et al.(1992)，J.Biol.Chem.，267(13)9422-9429根据他们进行的缺乏一个或多个半胱氨酸的突变型蛋白的研究和其他人用C-末端截短的蛋白进行的研究[Birnbaum et al.，(1990)J.Virol.64，3319-3330]，报导了核心颗粒形成不取决于富含精氨酸的C-末端结构域、核酸的结合或二硫键的形成。
业已披露了乙型肝炎核壳或病毒核心蛋白(HBc)是一种免疫原性载体部分，它能刺激免疫宿主动物的T细胞反应。例如，参见U.S.4,818,527，4,882,145和5,143,726。这种载体的一种特别有用的用途是它在从该蛋白的氨基末端(N-末端)开始计算的大体上70-90号位置上的免疫优势环呈递外源或异源B细胞表位的能力，更常见的是大约75-85号位置。Clarke et al.(1991)F.Brown et al.eds.，Vaccines 91，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，pp.313-318。
在病毒复制期间，HBV核壳与病毒RNA前基因组、病毒逆转录酶(Pol)、和末端蛋白(源于Pol)结合，形成复制感受态核心。核壳和病毒RNA前基因组的结合是由羧基末端(C-末端)的富含精氨酸的结构域介导的。当它在缺乏病毒RNA前基因组的大肠杆菌等异源表达系统中表达时，鱼精蛋白样C-末端，即150-183号位置上的残基能够与大肠杆菌RNA结合。Zhang et al.(1992)JBC，267(13)9422-29。
在作为疫苗载体部分的用途中，HBV核壳优选不与源于宿主的核酸结合。Birnbaum et al.(1990)J.Virol.，643319-3330证实HBV核壳的鱼精蛋白样C-末端结构域可以缺失，而又不影响该蛋白组装成病毒样颗粒的能力。因此，有人报导将蛋白截短到大约144号位置，即含有从1至大约144号位置的HBc序列可以自我组装，而缺失超过139号残基会破坏衣壳组装[F.Birnbaum & M.Nassal(1990)J.Virl.，643319-30]。
Zlotnick et al.，(1997)Pr℃.Natl.Acad.Sci.，USA，949556-9561研究了全长和截短的HBc蛋白组装成颗粒的情况。除了讨论全长的分子之外，以上作者还报导了截短蛋白的制备，这种蛋白含有从1到149号位置的HBc序列，其中，48、61和107号位置上的半胱氨酸分别被丙氨酸取代，并且在C-末端(150号位置)添加了一个半胱氨酸残基。C-末端的硫醇用于连接金原子团，以便在电子显微术中进行标记。
最近，Metzger ET al.(1998)J.Gen.Viol.，79587-590报导了人病毒序列的138号位置上的脯氨酸(Pro-138或P138)是颗粒形成所必需的。以上作者还报导了在羧基末端截短至142和140个残基长度的颗粒的组装能力受到了影响，当截短到长度为139和137个残基时，组装能力完全丧失。
若干个研究小组业已证实，与标准乙型肝炎核心颗粒相比，截短的颗粒具有较低的稳定性[Galena et al.(1989)J.Virol.，634645-4652；Inada，et al.(1989)Virus Res.，1427-48]，体现在颗粒大小的变化和颗粒片段在纯化制剂中的存在[Maassen et al.，(1994)Arch.Virol.，135131-142]。因此，在上述Metzger等的报导之前，Pumpens等，1995，Intervirology，3863-74对有关文献报导进行了综述，指明自我组装所必需的HBc序列的羧基末端边界位于139和144号氨基酸残基之间，并且前两个或三个氨基末端残基可以被其他序列所取代，但是消除4个或11个氨基末端残基会导致嵌合蛋白在转化的大肠杆菌细胞中的完全消失。Neirynck et al.，(℃tober 1999)Nature Med.，5(10)1157-1163报导了颗粒形成是在表达HBc嵌合体的大肠杆菌上进行的，该嵌合体包括与HBc在5号残基融合的流感病毒M2蛋白的N-末端24个残基部分。
重组生产的杂合HBc颗粒具有内在插入片段(在本领域中被称为HBc嵌合颗粒或HBc嵌合体)，它含有各种插入的多肽序列，这些序列是通过在多种生物中异源表达而制备的，包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、牛痘，鼠伤寒沙门氏菌，酿酒酵母，例如，参见Pumpens et al.(1995)Intervirology，3863-74，以及它所引用的文献，其中提到了若干个研究小组的工作。
上述Pumpens等的报导列举了颗粒形成嵌合体，其中，所插入的多肽序列位于N-末端、C-末端以及位于两个末端之间。在该文献中所报导的插入片段的长度为在N-末端为24-50个残基，在内部为7-43个残基，在C-末端为11-741个残基。
Kratz et al.，(1999)Pr℃.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，961915-1920最近披露了嵌合HBc颗粒的大肠杆菌表达，该颗粒包括内部融合在绿色荧光蛋白(GFP)的238号残基上的截短的HBc序列。该嵌合体包括插入的GFP序列，其侧翼是一对取代了HBc的79和80号氨基酸残基的富含甘氨酸的柔性接头臂。据说这种颗粒能在作为宿主动物的兔体内有效诱导抗天然GFP的抗体。
U.S.5,990,085披露了由抗原性牛抑制素肽融合在(i)78和79号残基之间的免疫原性环和(ii)羧基末端截短的HBc的144号残基后面所产生的两种融合蛋白。据说所表达的融合蛋白在给宿主动物施用之后能诱导抗抑制素抗体的产生。据报导，在免疫接种30天之后在患者体内的效价相当低，插入环中的融合蛋白的效价为1∶3000-15000，而插在144号残基后面的效价为1∶100-125。
在通过电子显微术分析时发现，与缺乏异源表位的颗粒相比，具有内部插入片段的嵌合乙型肝炎核心颗粒通常表现出具有较差的有序结构[Schodel et al.(1994)J.Exp.Med.，1801037-1046]。在某些场合下，将异源表位插入C-末端截短的HBc颗粒会产生明显的脱稳定影响，以至在异源表达之后不能回收到杂合颗粒[Schodel et al.(1994)Infect.Immunol.，621669-1676]。因此，很多嵌合HBc颗粒是如此不稳定，以至它们在纯化期间会分离到无法回收的程度，或者它们表现出非常差的稳定性特征，使得难于将它们用于疫苗开发。
在用嗜肝DNA病毒核壳输送系统开发疫苗时，能够保留全长HBc颗粒的稳定性，同时又消除全长HBc颗粒的核酸结合能力的结构特征将是非常有利的。实际上，Ulrich等在他们的有关用HBc嵌合体作为外源表位载体的最新的综述中[Adv.Virus Res.，vol.50(1998)Academic Press pages 141-182]指出将这种嵌合体用于人类疫苗需要解决三个潜在问题。第一个潜在问题是将嵌合疫苗中的核酸意外转移到接种的宿主中。第二个潜在的问题是现有免疫性对HBc的干扰。第二个可能的问题涉及对完整嵌合体颗粒的可重复制备的需要，这种颗粒还能经受长期的保存。
正如下文所披露的，本发明提供了一种解决HBc嵌合体稳定性以及基本上缺乏该构建体的核酸结合能力的问题的方法，同时提供了有效的免疫原性材料。
发明概述本发明涉及一种重组嗜肝DNA病毒核壳蛋白；即乙型肝炎核心(HBc)嵌合蛋白[或嵌合乙型肝炎核心蛋白分子或HBc嵌合分子，或简单地称之为嵌合体]，在宿主细胞中表达之后，它能自我组装成颗粒。该嵌合蛋白(i)具有一个或多个位于N-末端、HBc免疫原性环或C-末端的免疫原性表位，或具有用于所述免疫环中的偶联表位的异源接头残基，并且含有位于或靠近C-末端的、能够赋予该颗粒增强的稳定性的半胱氨酸残基。这种嵌合蛋白充分缺乏精氨酸残基，以至所述自我组装的颗粒基本上没有核酸结合。
本发明还涉及一种由重组乙型肝炎核心(HBc)嵌合蛋白分子组成的免疫原性颗粒。该嵌合蛋白(i)具有一个或多个位于N-末端、HBc免疫原性环或C-末端的免疫原性表位，或(ii)具有用于所述免疫环中的偶联表位的异源接头残基。该重组蛋白包括位于或靠近C-末端的半胱氨酸残基。所述颗粒基本上没有核酸结合能力，并且与由不含半胱氨酸残基的其他方面相同的蛋白组成的颗粒相比，具有增强的稳定性。
本发明的一种实施方案涉及一种长度多达大约515个氨基酸残基的重组嵌合体乙型肝炎核心(HBc)蛋白分子，该分子(a)包括(i)HBc分子的N-末端150个氨基酸残基中的至少大约130个的序列，包括共价连接的肽键结合的异源表位或用于存在于HBc免疫优势环上的偶联表位的异源接头残基，或(ii)具有N-末端150个HBc氨基酸残基中的至少大约135个残基的序列，(b)包括从HBc序列的C-末端残基到该分子C-末端的1-10个半胱氨酸残基，这些残基存在于所述嵌合体分子的C-末端的大约30个残基[C-末端半胱氨酸残基]内，和(c)包括具有从HBc的135号位置残基到HBc C-末端的至少5个氨基酸残基的序列，所涉及的嵌合体分子(i)在HBc序列中包括不超过20％保守取代的氨基酸残基，和(ii)在宿主细胞中表达时，自我组装成基本上不能结合核酸的颗粒，并且这种颗粒比由缺乏上述C-末端半胱氨酸残基或者在嵌合体中存在的C-末端半胱氨酸残基被另一种残基所取代的在其他方面相同的HBc嵌合体形成的颗粒更稳定。
在本实施方案的一个方面，一种所涉及的HBc嵌合体具有包括大约135-大约515个氨基酸残基的序列，并且包括4个系列的肽键连接的结构域，这些结构域被命名为结构域I、II、III、和IV。从N-末端开始，结构域I包括大约70-大约100个氨基酸残基，其序列包括HBc的从大约5号位置到大约75号位置的残基的序列，并且选择性地包括一个异源表位，该表位包括与HBc的1-4号残基之一形成肽键结合的大约30个氨基酸残基。结构域II包括与结构域I的HBc残基75形成肽键结合的5-大约250个氨基酸残基，其中(i)HBc的76-85号位置的序列中的0-全部，优选至少4个残基可用于与对HBc来说是异源的(外源的)1-大约245个氨基酸残基形成肽键结合，并且构成一个异源表位，如B细胞表位或诸如B细胞表位的表位的异源接头残基，或(ii)HBc的76-85号位置的序列不含异源残基。结构域III是与结构域II的85号残基形成肽键结合的从86号位置到135号位置的HBc序列。结构域IV包括(i)与结构域III的135号残基形成肽键结合的HBc氨基酸序列的从136号位置到149号位置的0-14个残基，(ii)HBc序列C-端的1-10，更优选1-3个半胱氨酸残基[C-末端半胱氨酸残基]，和(iii)从150号位置到C-末端的与HBc异源的序列上的0-大约100，更优选0-大约50，最优选大约25个氨基酸残基，其前提是，结构域IV包括至少6个氨基酸残基，其中包括上述(ii)的1-10个半胱氨酸残基。
一种所涉及的重组嵌合体蛋白所形成的颗粒基本上不结合核酸，并且比由含有相同的肽键连接的结构域I，II和III序列以及结构域IV序列的其他方面相同但缺乏所有半胱氨酸残基或者其中的半胱氨酸残基被诸如丙氨酸残基的另一种残基所取代的HBc嵌合体形成的颗粒更稳定。当嵌合体分子组装成颗粒时，这些颗粒在280与260nm的波长下所表现出的吸光度比例(280/260吸光度比例)为大约1.2-大约1.7。所形成的颗粒被认为是T＝4结构，含有240个单体HBc嵌合体或120个二体HBc嵌合体。
更广泛地讲，一种所涉及的嵌合颗粒包括一种C-末端截短的HBc蛋白(至少到残基149)，该蛋白包括异源表位或免疫优势环中表位的异源接头残基，或不间断的免疫优势环，而与所述免疫优势环的氨基酸残基序列无关，与HBc序列异源的1-3个C-末端半胱氨酸残基。这种颗粒的280/260吸光度比例为大约1.2-大约1.7，并且比缺乏上述C-末端半胱氨酸残基或者在嵌合体内存在一个C-末端半胱氨酸残基并且被另一种残基所取代的在其他方面相同的HBc嵌合体形成的颗粒稳定。
另一种实施方案包括一种接种物或疫苗，它包括上述HBc嵌合颗粒或一种半抗原与上述HBc嵌合颗粒的偶联物，它被溶解或分散在可以药用的稀释组合物中，该组合物通常还含有水。在以免疫原性有效量给诸如哺乳动物或禽类的动物施用时，接种物(i)能诱导与所述嵌合体颗粒或偶联的(悬垂连接的)半抗原发生特异性免疫反应的抗体，或(ii)能激活T细胞，或(iii)能同时达到这两种目的。由此诱导的抗体优选还能够特异性地与含有所述半抗原的抗原发生免疫反应(与它结合)，如所述半抗原是一种肽的蛋白或所述半抗原是一种寡糖的糖。
本发明具有若干优点和好处。
本发明的一个优点是与缺乏所有C-末端半胱氨酸残基的类似序列的颗粒相比，所形成的嵌合HBc颗粒在含水组合物中保存时更稳定。
本发明的一个好处是所制备的嵌合分子具有天然HBc颗粒的自我组装特征，而又不具备所述天然颗粒的核酸结合能力。
本发明的另一个优点是所形成的嵌合颗粒具有良好的B细胞和T细胞免疫原性。
另一个好处是与不含C-末端半胱氨酸残基的类似颗粒相比，本发明的嵌合颗粒通常是以较高的产量制备的。
本发明的另一个优点是所形成的颗粒具有比缺乏C-末端半胱氨酸残基的类似偶联物高的多的免疫原性。
另一个好处是与由缺乏至少一个C-末端半胱氨酸残基的嵌合分子组装的类似颗粒相比，由含有至少一个C-末端半胱氨酸残基的嵌合分子组装的颗粒的免疫原性得到增强。
通过以下说明，本领域技术人员可以了解其他优点和好处。


在构成本说明书一部分的附图中图1表示在制备在本发明中用于制备某些重组HBc嵌合体的质粒载体pKK223-3N时对商业化质粒载体pKK223-3进行的修饰。在商业化载体序列(SEQ ID NO286)下面示出了修饰过的序列(SEQ ID NO285)。所添加的NcoI位点的碱基用小写字母表示，而所有添加的碱基通过双下划线示出，而缺失的碱基用虚线表示。示出了出现在该序列片段上的两个限制位点(NcoI和HindIII)。
图2通过图2A，2B和2C三幅图示意性地表示优选的克隆方法，其中，将诸如(NANP)4(SEQ ID NO1)疟疾B细胞表位克隆到工程生产的HBc基因的78和79号位置之间的EcoRI和SacI位点上，由此破坏了EcoRI位点，而保留了SacI位点。图2B表示编码T细胞表位的DNA，如被称为Pf/CS-UTC的DNA以及一个终止密码子(SEQ ID NO120)，它被克隆在工程产生的、截短的、含有前149个HBc残基(HBc149)的HBc基因的C-末端的EcoRI和HindIII位点上。用具有靠近HBc编码序列的始于79号残基位置的5’-末端SacI限制位点的引物对图2B的构建体进行PCR扩增，用SacI消化扩增的序列和图2A的构建体，然后如图2C所示连接合适的部分，以便产生一种单基因构建体，该构建体在下文中被称为V12，它编码含有抗恶性疟原虫的疫苗的免疫原表位的B细胞和T细胞。
图3是在还原条件下进行的SDS-PAGE分析的照片，用于表示在37℃下，在0天和15天之后插入嵌合体的C-末端密码子(V149)和HBc的终止密码子之间的框中的编码单个半胱氨酸残基的密码子(所述嵌合体(V2.Pf1+C)还包括插在78和79号氨基酸位置之间的(NANP)4)，以及C-末端是残基V149的类似构建体(V2.Pf1)对表达的颗粒的稳定化作用，[泳道1，V2.Pf1-0天；泳道2，V2.Pf1-15天，37℃，泳道3，V2.Pf1+C，0天；泳道4，V2.Pf1+C-15天，37℃]。
图4是在还原条件下进行的SDS-PAGE分析的照片，它表示在37℃下，在0天和28天之后，与其中的C-末端半胱氨酸被丙氨酸所取代的类似颗粒[V2.Pf1+Pf/CS-UTC(C17A)，又被称为V12.Pf1(C17A)]相比，对含有插入78和79号氨基酸之间的(NANP)4和与C-末端融合的含有半胱氨酸的T细胞表位的嵌合体HBc149颗粒[V2.Pf1+Pf/CS-UTC，又被称为V2.Pf1]的稳定化作用[泳道1，V2.Pf1+Pf/CS-UTC-0天；泳道2，V2.Pf1+Pf/CS-UTC-28天，37℃，泳道3，V2.Pf1+Pf/CS-UTC(C17A)-0天；泳道4，V2.Pf1+Pf/CS-UTC(C17A)-28天，37℃]。
图5是表示用戊二醛固定的恶性疟原虫子孢子和FITC标记过的抗小鼠IgG(γ链特异性)进行的间接免疫荧光测定(IFA)的结果的曲线图，该测定检测了在对小鼠进行免疫接种之后三种嵌合免疫原在数周时间内(横坐标)的结合抗体效价(1/稀释对数；纵坐标)。现有嵌合免疫原CS-2的数据用正方形表示，重组HBc嵌合V12.Pf1的数据用菱形表示，而重组HBc嵌合体V12.Pf3.1的数据用三角形表示。
图6表示一种反应方案(方案1)，它表示两种反应序列(I)形成用于将半抗原悬垂连接在嵌合乙型肝炎核心蛋白(sm-HBc)上的、通过硫代-琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰甲基)环己烷1-羧酸酯(硫代-SMCC)激活的载体，然后(II)将以巯基为末端的(半胱氨酸末端的)半抗原连接在所述激活的载体上，以便形成偶联颗粒。sm-HBc颗粒用具有一个悬垂的氨基基团的方框表示(为了附图清楚起见)，而以巯基为末端的半抗原用以SH为末端的线条表示。
图7用图7A和图7B两幅图表示来自六种病毒的哺乳动物HBc蛋白的六种公开的氨基酸残基序列的比对。第一种(SEQ ID NO247)人病毒序列是ayw亚型的，并且披露于Galibert et al.(1983)Nature，281646-650中；adw亚型的第二种人病毒序列(SEQ ID NO248)是由Ono et al.(1983)Nucleic Acids Res.，11(6)1747-1757披露的；第三种人病毒序列(SEQ ID NO249)是adw2亚型，并且由Valenzuela et al.，Animal Virus Genetics，Field et al.eds.，Academic Pres s，New Y或k(1980)pages 57-70披露；第四种人病毒序列(SEQ ID NO250)是adyw亚型的，它是由Pasek et al.(1979)Nature，282575-579披露的；第五种序列(SEQ ID NO251)是土拨鼠病毒序列，它是由Galibert et al.(1982)J.Virol.，4151-65；而第六种哺乳动物序列(SEQ ID NO246)是地松鼠序列，它是由Seegeret al.(1984)J.Virol.，51367-375披露的。
图8是在37℃下培养0、1和2天之后，在还原条件下进行SDS-PAGE分析的照片，它表现的是对以下颗粒的稳定化作用(1)嵌合HBc149颗粒，它含有插在HBc78和79号氨基酸残基之间的恶性疟原虫(NANP)4免疫原性序列，还含有通过肽键与HBc149号位置结合的C-末端通用恶性疟原虫疟疾T细胞表位[UTC；V12.Pf1＝V2.Pf1+Pf/CS-UTC]，和(2)类似的颗粒，其中，UTC的17号位置上的半胱氨酸突变成丙氨酸残基，并且在150号残基位置上添加了一个半胱氨酸残基，该位点位于HBc149号位置上的残基和UTC开始部分之间[V12.Pf1(C17A)+C150]。
图9是在颗粒制备之后在还原条件下进行SDS-PAGE分析的照片，表示与ICC-1492构建体(泳道3)相比，ICC-1438单体构建体是不稳定的(泳道2)，将HBc-149(泳道1)，ICC-1475(泳道4)和ICC-1473(泳道5)用作额外的分子量对照。
定义与HBc嵌合体一起使用的编号是在SEQ ID NO247的HBc ayw氨基酸残基序列上的位置，在该序列的所述位置上添加了一个或多个残基，而无论是否存在所述氨基酸残基序列的添加或缺失。因此，HBc149表明该嵌合体的末端是149号残基，而HBc149+C150表示相同的嵌合体在HBc150号位置上包含一个半胱氨酸残基。另一方面，疟疾CS蛋白通用T细胞表位(UTC)的长度为20个残基，而用丙氨酸取代该序列的17号位置上的半胱氨酸之后它被称为CS-UTC(C17A)。
术语“抗体”表示被称为免疫球蛋白的糖基化蛋白家族成员的成员，它能特异性结合一种抗原。
术语“抗原”曾经被用于表示由抗体或受体结合的实体，并且还被用于表示能诱导抗体产生的实体。更近一些的用法将抗原的含义局限于由抗体或受体结合的实体，而术语“免疫原”被用于表示能诱导抗体产生或与受体结合的实体。其中，本文所讨论的实体同时具有免疫原性和抗原性，根据其预期的用途通常称之为免疫原或抗原。
“抗原决定簇”表示抗原的实际结构部分，它能与抗体结合位点或T细胞受体发生免疫结合。该术语还可以与“表位”交换使用。术语“抗原决定簇”和“表位”在本文中以更广义的含义使用，包括与HBc序列异源但实际上不会被抗体结合的其他残基。因此，举例来说SEQ ID NO1和21的疟疾CS蛋白重复序列(NANP)4和NANPNVDP(NANP)3NVDP分别被认为包括一个以上的实际表位，但是，在本文中被认为各自包括一个表位。将这两种序列用于一个HBc嵌合分子中，被认为使用了多个表位。
本文所使用的术语“偶联物”表示通过诸如赖氨酸、天冬氨酸或谷氨酸、酪氨酸、半胱氨酸残基的载体蛋白的氨基酸残基侧链可操纵地与载体蛋白连接的半抗原。
本文所使用的术语“保守性取代”表示一种氨基酸残基被另一种生物学上似的残基所取代。保守性取代的例子包括用诸如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸的疏水性残基取代另一种残基，或者用一种极性残基取代另一种残基，如精氨酸和赖氨酸之间的取代，谷氨酸和天冬氨酸之间或谷氨酰胺和天冬酰胺之间的取代等。
与肽序列一起使用的各种语法形式的术语“相当”表示在所披露的肽序列的氨基末端和羧基末端中的任一个末端或两个末端上添加或减少最多达3个氨基酸残基，并且仅含有保守性取代，特别是沿着多肽序列的氨基酸残基。
本文所使用的术语“结构域”表示重组HBc嵌合分子的一部分，它是通过(i)相对Galibert et al.，(1979)Nature，281646-650(SEQ ID NO246)HBcAg亚型ayw的位置编号进行的残基位置编号而确定的。所述多肽的至少嵌合体结构域I，II和III的部分被认为以类似于天然存在的HBcAg的相应序列的三级形式存在。
在本文中，术语“融合蛋白”表示包含至少两个在正常情况下不是天然连接在一起的氨基酸残基序列的多肽，这两个序列是通过其相应的羧基末端和氨基末端氨基酸残基之间的肽键头-头(头-尾)地操作性连接在一起。本发明的融合蛋白是HBc嵌合体，它能诱导抗体的产生，这种抗体能与在氨基酸残基序列上与所述融合蛋白的多肽或病原体相关部分相当的多肽或病原体相关免疫原发生免疫反应。
在本文中，术语“乙型肝炎”以其最广义的含义表示嗜肝DNA病毒科的任何成员，正如上文所讨论的。
术语“残基”可以与术语氨基酸残基交换使用，并且表示存在于肽或蛋白中的反应性氨基酸。
在本文中，术语“表达载体”表示构成控制元件的DNA序列，该元件能调控编码一种蛋白的结构基因表达，以便形成蛋白。
在本文中，术语“操作性连接”在用于核酸的场合下表示一个基因以正确的读框共价键合在诸如表达载体的另一个DNA(或合适的RNA)片段上，以便所述结构基因受该表达载体的控制。术语“操作性连接”在用于蛋白、多肽或嵌合体的场合下表示所说的因子彼此共价键合。
在本文中，术语“启动子”表示DNA序列上的识别位点或DNA序列的基团，它提供了基因的表达控制因子，RNA聚合物可以特异性地结合在它上面，并且启动该基因的RNA合成(转录)。
在本文中，术语“重组DNA分子”表示包括至少两个正常情况下不是天然一起存在的核苷酸序列的杂交DNA序列。
在本文中，术语“载体”表示能够在细胞中复制和/或另一种DNA片段能够操作性与它连接以便导致所连接的片段复制的DNA分子。质粒是一种典型的载体。
本文所说的所有氨基酸残基具有天然的L-构型。为了保持标准多肽命名，J.Biol.Chem.，2433557-59，(1969)，在下面的对应表中示出了氨基酸残基的缩略语对应表

发明详述本发明涉及一种嵌合嗜肝DNA病毒核壳蛋白；即重组乙型肝炎核心(HBc)蛋白，它被工程改造成(a)具有免疫原性B细胞或T细胞表位、用于连接免疫原性B或T细胞表位的接头或截短的HBc蛋白；(b)当它存在于自我组装的颗粒中时具有增强的稳定性，以及表现出(c)作为自我组装的颗粒，基本上缺乏核酸结合。相对天然HBc分子而言，一种涉及的HBc嵌合体在该分子的C-末端截短。
因此，所述嵌合蛋白在N-末端、在HBc免疫原环或C-末端具有一个或多个免疫原表位，或免疫原环中的所述表位的接头。所述嵌合蛋白包含位于或靠近C-末端的一个半胱氨酸残基，该残基使得自我组装的颗粒具有增强的稳定性。该嵌合蛋白充分缺乏位于HBc149号残基位置下游(从这里到羧基末端)的精氨酸残基，以便自我组装的颗粒基本上没有核酸结合。
为了便于讨论，所涉及到的嵌合体序列以及本文所提到的序列位置编号是基于人乙型肝炎核心蛋白ayw亚型的序列和位置编号[Galibert et al.(1979)Nature，28164650]。不过，可以理解的是，由于哺乳动物嗜肝DNA病毒衣壳蛋白序列之间存在很大的相似性，并且，这些蛋白表现出类似的颗粒形成——这是本领域技术人员所公知的，有关人HBc亚型ayw的讨论同样适用于adw亚型和土拨鼠和地松鼠蛋白。由于上述高度相似性，HBc序列在本文中通常被称为“HBc”序列，除非另有说明。
在一种实施方案中，所涉及的HBc嵌合体的长度最多达到大约515个残基并且(a)包含(i)具有N-末端150个氨基酸残基中的至少大约130个的序列，包括一个共价连接的异源表位或存在于HBc免疫优势环中的肽键结合的偶联表位的异源接头残基，或(ii)具有N-末端150个HBc氨基酸残基中的至少大约135个残基的序列，(b)包含从HBc序列的C-末端残基到嵌合分子的C-末端的1-10，更优选1-3个半胱氨酸残基，这些残基位于距离该嵌合分子的C-末端的大约30个残基内[C-末端半胱氨酸残基]，和(c)包含从HBc的135号位置残基到HBc C-末端的至少5个氨基酸残基的序列。这6个残基中的5个优选是136-140号位置的HBc序列，第六个残基是所需要的半胱氨酸。
当所述嵌合蛋白分子在宿主细胞中表达时，所涉及的嵌合体自我组装成颗粒，这些颗粒基本上不能结合核酸，并且比(1)由缺乏上述1-10个半胱氨酸残基[C-末端半胱氨酸残基]的在其他方面相同的HBc嵌合体形成的颗粒或(2)当该嵌合体上存在一个单一C-末端半胱氨酸残基并且被诸如丙氨酸残基的另一种残基所取代时更稳定。
在一方面，优选的HBc嵌合体具有大约135-大约515个L-α-氨基酸残基，并且包括4个系列的肽键连接的结构域；即结构域I、II、III、和IV。这四个结构域以与天然蛋白相同的方式连接在一起，与包括除了α氨基酸以外的残基、并因此不能形成肽键的多肽、包括D-氨基酸残基的多肽，或其中的两个或两个以上多肽通过氨基酸残基侧链操作性连接在一起的寡肽偶联物相当。因此，可以通过用重组技术的常用方法表达而制备有关的嵌合HBc蛋白。
从氨基末端开始计算，结构域I包括大约71-大约100个氨基酸残基，其序列至少包括HBc的从5号位置到75号位置的残基的序列。HBc序列的1-75号残基的序列优选作为结构域I的一部分存在。最优选结构域I仅包括1-75号位置的HBc序列。
结构域II包括通过肽键与结构域I的HBc75号残基结合的5-大约250个氨基酸残基，其中(i)HBc 76-85号位置上的0-全部残基，优选至少4个残基，更优选至少8个残基可用于与1-大约245个氨基酸残基形成肽键结合，这1-245个残基对HBc来说是异源的(外源的)，并且构成用于连接诸如B细胞表位的表位的异源接头残基或诸如B细胞表位的异源表位本身或(ii)在76-85号位置上不存在异源残基的HBc序列。
特别优选的是，存在76-85号位置的10个残基的序列(76-85序列)，但是该序列被所述异源接头或异源表位的1-大约245个残基所间断。在其他例子中，特别优选的是这10个残基序列是单独存在的，没有被任何异源残基所间断。
在该结构域中仅包括HBc残基，并且具有下文所披露的特征的嵌合体，可用于诱导B和/或T细胞对HBc本身的反应。一种优选的HBc嵌合体分子具有未间断的76-85序列，该分子包括未间断的从1号到至少140号位置的HBc氨基酸残基序列，更优选包括未间断的从1号到149号位置的HBc氨基酸残基序列，以及位于C-末端的一个半胱氨酸残基，正如下文所披露的。
结构域III是通过肽键与85号残基连接的从86号位置到135号位置的HBc序列。
结构域IV包括(i)通过肽键与结构域III的135号位置的残基连接的HBc 136号-149号位置的氨基酸残基序列的0-14个残基，(ii)1-10个半胱氨酸残基[C-末端半胱氨酸残基]，和(iii)与HBc的从150号位置到C-末端异源的序列中的0-大约100个氨基酸残基，这些残基通常构成一个T细胞表位或多个T细胞表位，其前提是，结构域IV包括至少从HBc135号残基位置到该嵌合体的C-末端的6个氨基酸残基的序列，包括上述(ii)的1-10个半胱氨酸残基。结构域IV优选在与HBc异源的序列中包括0-大约50个氨基酸残基的序列，更优选该序列具有0-大约25个残基。
因此，在一方面，所涉及的一种嵌合体分子可以没有与HBc异源的表位或残基，C-末端半胱氨酸除外。在另一方面，所涉及的一种嵌合体分子包括位于N-末端的与HBc1-5号残基之一形成肽键结合的异源表位。在另一方面，所涉及的一种嵌合体分子包括异源表位或用于连接肽键结合的表位的异源接头残基，该表位靠近该分子的中央，位于免疫优势环的HBc76-85号残基之间。在另一方面，一种异源表位位于嵌合分子的C-末端，与HBc136-149号残基形成肽键结合。在另一方面，在以上位点上存在2或3个异源表位，或者一个或两个异源表位与用于连接表位的异源接头残基同时存在。上述每一种嵌合体分子还包括上文所述的C-末端半胱氨酸残基。下面将讨论上述若干种嵌合体分子及其自我组装的颗粒的具体例子。
正如已经提到过的，所涉及的一种HBc嵌合体分子可以包括大约135-大约515个氨基酸残基。在优选实施方案中，存在HBc1-5号残基，以便结构域I始于HBc1号残基，并且延续到75号残基；即HBc75号位置上的HBc残基。存在于免疫优势环中的结构域I I中的异源表位优选包括大约15-大约50个残基，尽管短到大约6个氨基酸残基的表位能够诱导抗体和T细胞受体并且被它们所识别。结构域III包括与85号残基形成肽键结合的HBc的86-135号残基。结构域IV包括具有至少6个残基的序列，该序列由以下部分组成(i)与135号残基形成肽键结合的HBc的136-149号残基中的0个、1个或一个序列，(ii)至少一个半胱氨酸残基，和(iii)可选择性地包括一个最多可达约100个残基的表位的异源序列，特别是HBc序列的末端是135号残基时，不过，最多达到大约25个残基的较短的序列更优选。
在一种实施方案中，一种特别优选的嵌合体包括两个异源表位。这两个异源表位存在于结构域I和II，或II和IV，或I和IV中。在某些实施方案中，这两个异源表位中的一个优选是B细胞表位。在其他实施方案中，所述两个异源表位之一是T细胞表位。更优选的是，这两个异源表位中的一个是B细胞表位，而另一个是T细胞表位。另外，在B细胞表位部位上可以存在多个B细胞表位，而在T细胞表位部位上可以存在多个T细胞表位。
在嵌合体分子的结构域II中包括异源表位的实施方案中，所述表位优选是一个或多个B细胞表位，存在76-85号氨基酸残基之间的HBc序列，但是该序列被所述异源表位所间断，并且该嵌合体还包括位于结构域IV中的与HBc的140-149号残基之一形成肽键结合的一个或多个T细胞表位。
在这样的嵌合分子中保留了相同的倾向，其中，用于偶联的表位的异源接头残基存在于结构域II中，以便在结构域II中提供一个或多个异源表位，存在76和85号残基，但是被所述异源接头残基所间断，T细胞表位可用于与HBc的140-149号残基之一形成肽键结合。由这种嵌合分子形成的颗粒通常包括比例大约为1∶4-1∶1的偶联的表位和C-末端肽键结合的T细胞表位，常见的比例为大约1∶2。
在上述嵌合分子的一种典型结构中，用于偶联的表位的异源接头残基存在于结构域II中，而T细胞表位存在于结构域IV中，在结构域II中没有其他的B细胞表位。这种嵌合体具有T细胞表位的免疫原性，同时具有少量的(如果有的话)HBc抗原性，这种抗原性是通过在下文所披露的ELISA测定中根据抗-环单克隆抗体的结合测定的。
一种所涉及的优选HBc嵌合分子包括大约140-大约515个残基的序列。优选的HBc嵌合分子包括优选长度分别为大约15-大约50个残基的两个异源表位，和一个长度为大约140-大约149个残基的优选的HBc部分，该嵌合体的序列长度为大约175-大约240个氨基酸残基。特别优选的嵌合分子含有两个异源表位，长度大约为190-大约210个残基。可以理解的是，根据N-和C-末端HBc部分长度的变化以及可以插入所述免疫环中的若干种表位长度的改变，嵌合分子可以具有多种不同的长度。
一种所涉及的的重组蛋白在宿主细胞中表达之后，自我组装成基本上不能结合核酸的颗粒。所涉及的HBc嵌合体颗粒的形状通常是球形的，并且对于特定制剂来说，其大小通常是均匀的。因此，这种嵌合颗粒类似于具有类似形状和大小的天然HBc颗粒，并且可以从受感染的人体内回收。
一种所涉及的嵌合颗粒包括以前披露的嵌合分子。更广义的讲，这种嵌合颗粒包括嵌合的、C-末端截短的HBc蛋白，它具有N-末端150个残基中的至少大约130个的序列，并且包括(i)位于免疫优势环中的异源表位或异源接头残基，或N-末端150个残基中的至少大约130个和一个未间断的免疫优势环和(ii)上文所披露的1-3个C-末端半胱氨酸残基和从135号位置开始的至少一个5HBc残基序列。这种颗粒足够缺乏精氨酸残基，以便自我组装的颗粒基本上缺乏核酸结合，并且表现出大约1.2-大约1.7的280/260吸光度比例，正如下文所讨论的。因此，一种所涉及的嵌合蛋白可能缺乏150和183号位置之间的HBc序列。一种所涉及的颗粒比由缺乏上述C-末端半胱氨酸残基的在其他方面相同的HBc嵌合体蛋白形成的颗粒更稳定。类似地，其嵌合分子包括一个单一C-末端半胱氨酸残基的颗粒比其中的半胱氨酸被诸如丙氨酸残基的另一种残基所取代的颗粒更稳定。在某些场合下，只有在存在C-末端半胱氨酸时才能形成颗粒。在以下实施例中说明了这两种类型序列的增强的稳定性的例子，在与图3、4和8相关的实施例中表现的特别突出。
通过比较在280和260纳米波长下测定的颗粒在水溶液中的吸光度值，即280/260吸光度比例，可以方便地确定基本上缺乏核酸结合。所涉及的颗粒基本上不能结合核酸，这些核酸是用于表达所述蛋白的生物细胞中原始存在的寡聚和/或多聚DNA和RNA。所述核酸在260纳米波长下具有吸光度，而在280纳米波长下具有较弱的吸光度，而诸如相关的嵌合体的蛋白在260纳米波长下具有较弱的吸光度，而在280纳米波长下具有较强的吸光度。
因此，在150-183(或150-185)号残基位置上含有富含精氨酸的序列的重组表达的HBc颗粒或嵌合HBc颗粒，在本领域中有时被称为鱼精蛋白区，它在280纳米波长下的吸光度值与260纳米波长下的吸光度值的比例(280/260吸光度比例)为大约0.8，而充分缺乏精氨酸残基以至自我组装的颗粒所具有的280/260吸光度比例大约为1.2-大约1.6，所述颗粒，如缺乏天然存在的HBc的富含精氨酸的核酸结合区的颗粒，如含有彼此相邻的少于3个精氨酸或赖氨酸残基或其混合物的颗粒，或具有以HBc的大约140号残基位置-149号位置为末端的天然的或嵌合序列的颗粒。
本发明的嵌合HBc颗粒基本上不能结合核酸，并且表现出大约1.2-大约1.6的280/260吸光度比例，更常见的比例是大约1.4-大约1.6。这种范围在很大程度上是由于存在于特定嵌合HBc颗粒的结构域II和IV中的芳族氨基酸残基的数量所造成的。这种范围还在一定程度上是由于半胱氨酸在相关嵌合体的结构域IV中的存在所造成的。由于一种目前尚不了解的原因，该残基的存在可以降低所观察到的比例大约0.1。
与由含有相同的肽键连接的结构域I，II和III序列和缺乏其中的1-10个半胱氨酸残基[C-末端半胱氨酸残基]或所存在的一个C-末端残基被诸如丙氨酸残基的另一种残基所取代的，在其他方面相同的结构域IV序列的HBc嵌合体形成的颗粒相比，所涉及的嵌合HBc颗粒在含水缓冲液中，在37℃下，在大约2周-大约1个月的时间内更稳定。按下文所披露的方法测定各种嵌合颗粒的稳定性。
因此，举例来说，与由其C-末端残基是缬氨酸149的嵌合体分子组装的其他方面相同的颗粒相比，在结构域II中含有一个异源疟疾表位[例如(NANP)4]和缬氨酸残基149的C-末端有一个单一半胱氨酸残基的颗粒更稳定。类似地，与其中的半胱氨酸被丙氨酸所取代的在其他方面相同的颗粒相比，在结构域II中含有上述疟疾B细胞表位和在靠近其C-末端包括一个半胱氨酸的通用疟疾T细胞表位的颗粒更稳定。参见图3、4和8，以及下文与之相关的讨论。
所涉及的含有C-末端半胱氨酸残基的颗粒的制备产量，通常也高于由缺乏C-末端半胱氨酸的嵌合分子所组装的颗粒。通过所获得颗粒的质量或通过用Superose6 HR进行的分析凝胶过滤分析也可以看出产量的提高，正如下文所讨论的，以及在表17中所示出的。
所涉及的嵌合HBc蛋白的结构域I由从至少5号氨基酸残基位置开始到75号位置的HBc的氨基酸残基序列组成，而结构域III由从86号位置到137号位置的HBc序列组成。源于任一种哺乳动物嗜肝DNA病毒的序列都可用于结构域I和III，并且可以将源于两种或两种以上病毒的序列用于一种嵌合体中。优选的，并且为了便于构建，将人ayw序列用于所有嵌合体上。
业已报导了在其结构域I中包括前3个氨基末端(N-末端)残基的一个以上缺失的HBc嵌合体，会导致HBc嵌合蛋白在大肠杆菌细胞中的完全消失。Pumpens et al.，(1995)Intervirology，3863-74。另一方面，在一份最近的研究中，将来自流感病毒M2蛋白的免疫原性23-聚体多肽与HBc N-末端序列融合，根据报导当天然HBc序列的1-4号残基被取代时，所得到的融合蛋白能形成颗粒。Neirynck et al.(℃tober 1999)Nature Med.，5(10)1157-1163。因此，现有技术表明，当所添加的氨基酸序列可用于与HBc的1-4残基中的一个形成肽键结合时，可以形成颗粒，而如果不存在额外的序列并且缺少了HBc的N-末端的超过1-3个残基的话，就不能形成颗粒。
与HBc的N-末端前5个残基之一形成肽键结合的N-末端序列，可能包括一个与HBc异源的最多可达大约25个残基的序列。典型的序列包括诸如下文所披露的B细胞或T细胞表位，上述Neirynck等所披露的源于流感病毒M2蛋白的23-聚体多肽，可以作为所使用的表达系统的结果而以融合蛋白形式存在的诸如β-半乳糖苷酶的另一种(异源)蛋白的序列，或另一种乙型肝炎相关的序列，如源于Pre-S1或Pre-S2区的序列或主要HbsAg免疫原性序列。
结构域II是一种大约5-大约250个氨基酸残基的序列。在这些残基中，0(没有)，优选至少4个残基，更优选至少8个残基构成了HBc序列76-85号位置的部分，而1-大约245个残基，优选1-大约50个残基与HBc是异源的(外源的)。这些异源残基构成了(i)用于连接诸如B细胞或T细胞表位的异源接头残基，或(ii)异源B或T细胞表位，它优选包括6-大约50，更优选大约15-大约50，最优选大约20-大约30个氨基酸残基，并且它们的位置使得它们能够与HBc序列76-85号位置的0，或更优选至少4-所有残基形成肽键结合。异源B细胞表位优选通过所述接头残基与该部位连接，或者与HBc序列形成肽键结合，B细胞的使用将在下文作说明性讨论。
所述至少4个优选的HBc残基可以都存在于一个序列上，如82-85号残基，或者分别存在于异源残基两侧(侧翼)，作为76-77号残基和84-85号残基存在，或者作为76号残基和83-85号残基存在，更优选的是，结构域II包括HBc序列的76-85号残基的至少8个残基。最优选的是，在该嵌合体上存在76-85号位置的所有10个残基的序列。
添加在HBc环序列上的大约1-大约245个残基与HBc序列异源。正如上文所讨论的，有单个添加的异源残基是用于B细胞表位的异源接头残基。正如上文所指出的，通常至少6个氨基酸残基-大约50个氨基酸残基长度，更优选大约15-大约50个残基长度的较长的序列存在于一个包括诸如B细胞表位的异源免疫原的序列中，由限制位点所编码的异源残基除外。
在下面的表A中示出了用于在一种嵌合体表达之后与所述接头残基连接并用于在HBc嵌合体中表达的典型的肽免疫原，同时给出了用于获得该序列的基因的常用名，公开表位的文献或专利引用，和SEQ IDNO。
表AB细胞表位




*公开表位的引用文献在表B后面提供存在于异源残基或序列任意一侧的其余的结构域II的残基是HBc的76-85号位置的残基。因此，在一种典型例子中，78-82号残基已经被取代，结构域II中的嵌合体序列是76-77号残基，随后是限制位点编码的残基，异源免疫原性(表位)序列，其他的限制位点编码的残基，以及HBc序列84-85。通过在78和79号残基之间插入所制备的嵌合体的一种典型的代表性序列是1-78号位置的HBc序列，随后是限制位点编码的残基，异源免疫原性序列，其他的限制位点编码的残基和HBc序列79-85。通过以上说明可以了解其他相关嵌合体的结构域I和II的序列，以及随后的序列，并且这些序列没有必要一一列举。
正如已经指出过的，用于偶联表位的异源接头是通过肽键结合在位于HBc序列的76-85号氨基酸残基之间的位置上。对于异源表位来说，优选存在76-85号残基的HBc序列，不过该序列被用于偶联表位的异源接头所间断。该嵌合体优选包括1号位置至至少140号位置的HBc序列，和位于该嵌合蛋白C-末端的半胱氨酸残基。更优选的是，存在1-149号位置的HBc序列，但是在76和85号残基之间被用于偶联表位的异源接头所间断，并且该嵌合分子包括C-末端半胱氨酸。所述用于偶联表位的异源接头最优选是赖氨酸(K)残基。谷氨酸或天冬氨酸，酪氨酸和半胱氨酸残基也可用作接头残基。业已发现，可以存在一个以上接头，如3个赖氨酸的序列，不过，这种用法不是优选的，因为这种用法会产生异源偶联物，其中，偶联的半抗原与第一种嵌合体中的一个接头键合，并且与第二种嵌合分子中的不同的接头键合。公开申请PCT/US99/03055披露了包括一个或多个连接残基，但缺乏稳定化C-末端半胱氨酸残基的HBc嵌合分子。
还发现存在于相关HBc嵌合体上的异源表位序列还可以通过位于所述异源免疫原性(表位)序列一侧或两侧(侧翼)的“柔性接头臂”与HBc序列残基分离。这是当异源免疫原性序列长度超过大约30个残基酸残基时的特定情况。典型的柔性接头臂序列通常包括大约4-大约10个甘氨酸残基。这些残基被认为能够使插入的序列可以从其他凸环向外“凸出”，并且为该结构增加额外的稳定性。代表性柔性接头臂序列由Kratz et al.(March 1999)Pr℃.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，961915-1920披露，并且通过以下氨基酸残基序列表示GGGGSGGGGTSEQ ID NO256GGGGSGGGG SEQ ID NO257
正如上文述所指出的，结构域III构成了HBc的86-135号位置的序列。因此，可以延长上文所讨论的结构域I和II的代表性嵌合体的序列，以便所披露的第一种嵌合体具有HBc的84-135号位置的序列，而所披露的第二种嵌合体具有HBc的79-135号位置的序列。
结构域IV是这样一种序列它(i)选择性地包括136-149号位置的HBc序列，(ii)包括至少一个半胱氨酸残基，最多可达3个半胱氨酸残基，和(iii)在与HBc异源的序列的150号位置到C-末端具有最多可达约100个氨基酸残基，其前提是结构域IV包括至少6个氨基酸残基，包括上述(ii)中的1-10个半胱氨酸残基。与HBc异源的结构域IV序列，更优选包括最多可达约50个氨基酸残基，最优选包括多达大约25个残基。因此，结构域IV序列基本上是任何含有半胱氨酸的序列，从150号位置到C-末端的C-末端HBc序列除外。
结构域IV序列的长度可以是6个残基，即1个半胱氨酸残基加上任意5个残基，包括一共最多达3个半胱氨酸残基，至大约100个氨基酸残基，该长度足够长，以便相关的嵌合蛋白的总长度为大约315-大约515个残基，更优选最多达大约460个残基，最优选最多达435个氨基酸残基。当一个表位与分别最多含大约30或大约50个残基(这对所述表位是优选的)的结构域I或II形成肽键结合时，包括结构域IV表位的嵌合分子的更优选的长度为大约175-大约240个残基。特别优选的嵌合分子包括2个长度为大约190-大约210个残基的异源表位。通过按上述方法测定280/260吸光度比例，确定所得到的颗粒缺乏核酸结合。
结构域IV序列包括至少一个半胱氨酸(Cys)残基，并且可以包括最多3个Cys残基。所述一个或多个Cys残基优选位于嵌合蛋白分子的C-末端的大约5个氨基酸残基上或内。另外，当结构域IV序列上存在一个以上Cys残基时，这些Cys残基优选彼此相邻。
同样优选的是，结构域IV序列构成了生物的T细胞表位，多个相同或不同的T细胞表位或额外的B细胞表位，所涉及的嵌合体将被用作所述生物的免疫原。与表A相似，在下面的表B中提供了典型的结构域IV T细胞表位序列。
表BT细胞表位


*加下划线的C(C)不是来自天然序列。
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除了存在于结构域IV中的至少一个半胱氨酸残基之外，在所涉及的嵌合分子和颗粒中优选存在从1号残基位置到至少140号位置的HBc的氨基酸序列。更优选存在从1号位置到149号位置的序列。在76-85号残基之间优选存在B细胞表位，并且除了所述HBC序列之外，至少有一个半胱氨酸残基或含有半胱氨酸残基的T细胞表位作为C-末端存在。一种所涉及的重组HBc嵌合体基本上没有结合的核酸。在37℃下，在分子的C-末端或靠近C-末端包括一个额外的半胱氨酸残基的所涉及的嵌合颗粒比不含所述额外Cys的颗粒更稳定。这种增强了的稳定性如图3、4和8所示，并且在下文讨论。
一种所涉及的重组HBc嵌合分子通常以自我组装的颗粒形式存在并且被用作自我组装的颗粒。所述颗粒包括180-240个嵌合分子(90或120个二聚体对)，通常240个嵌合分子，这些分子在存在诸如2-巯基乙醇的二硫化物还原剂的条件下分离成蛋白分子，因此，独立的分子被认为主要是通过二硫键结合成所述颗粒。
尽管不希望受理论的约束，相信所观察到的增强了的稳定性以及在某些场合下所涉及的HBc嵌合体表达的增强是由于在所述嵌合颗粒的蛋白之间形成了其他半胱氨酸二硫键。无论是作为半胱氨酸还是胱氨酸，C-末端半胱氨酸残基都被称作半胱氨酸，因为它是由存在于表达被组装成颗粒的蛋白的核酸中的密码子所编码的残基。
所述颗粒类似于出现在受HBV感染的患者体内的颗粒，不过，这些颗粒是非感染性的。当在各种原核宿主和真核宿主中表达时，单个的重组HBc嵌合分子在宿主中组装成颗粒，如果需要的话，这些颗粒可以方便地从宿主细胞中收集并纯化。
如上文所述，HBc免疫优势环通常被认为位于从完整蛋白的氨基末端(N-末端)开始计算的大约75-85号位置上。将结构域II的含有异源B细胞表位的序列插入该免疫优势环序列中。该序列的插入基本上消除了HBc环序列的HBc免疫原性，同时在组装的嵌合颗粒上的免疫原性极高的位置上提供了异源序列或接头残基。
除了上述N-和C-截短、各种表位和间隔基的插入之外，所涉及的一种嵌合分子还可以包括构成HBc结构域I，II，II和IV的氨基酸残基的保守性取代。保守性取代如上文所定义。
较少见的是还涉及“非保守性”改变，例如用色氨酸取代甘氨酸。类似的小的改变还可以包括氨基酸缺失或插入或包括这两者。使用本领域众所周知的计算机程序，例如LASERGENE软件(DNASTAR Inc.，Madison，Wis.)指导确定哪一个氨基酸残基可以被取代、插入或缺失而又不会破坏生物学活性或颗粒形成。
本发明的嵌合分子的HBc部分，即具有除了添加的表位、接头、柔性接头臂或异源残基以外的其他序列或残基的HBc序列的部分是一种限制酶人为构造物，最优选具有图7所示的亚型ayw的1-149号位置的氨基酸残基序列(SEQ ID NO247)，亚型ayw序列的任何较小的部分因为在一个或两个末端的截短而缺乏。其次优选的是亚型adw，adw2和adyw的相应的氨基酸残基序列，这些序列同样在图7中示出(SEQ ID NO248、249和250)。其次优选的是与1-149号位置比对的土拨鼠和地松鼠的序列，它们是图7中的最后两个序列(SEQ ID NO251和246)。正如在其他部分所指出的，可以将来自不同哺乳动物HBc蛋白的不同序列的部分同时用在一种嵌合体上。
当上述本发明的嵌合分子的HBc部分具有除了哺乳动物HBc分子的相当于1-149号位置的序列的序列时，与SEQ ID NO247相比，对1-149号位置中的不超过大约20％的氨基酸残基进行过取代。与SEQID NO27相比，1-149号位置上的不超过大约10％，更优选不超过大约5％，最优选不超过大约3％的氨基酸残基进行过取代。
因此，一种所涉及的149个HBc残基的嵌合体可以包括最多达大约30个残基与SEQ ID NO247的1-149号位置的残基不同，优选大约15个残基。更优选大约7或8个残基与ayw序列(SEQ ID NO27)的1-149号残基位置不同，最优选大约4或5个残基不同。取代不是在结构域II的免疫优势环或末端进行，而优选在嵌合分子的非螺旋部分进行，并且通常位于1-大约15号残基，24-大约50号残基之间，以便确保颗粒的形成。参见Koschel et al.，J.Virol.，73(3)2153-2160(Mar.1999)。
当HBc序列在C-末端超过149号位置的部位或在N-末端截短时，或者在免疫原性环中包括一个或多个缺失时，取代残基的数量成比例地不同，因为该序列的总长度低于149个残基。为了进行计算，在该分子其他部分的缺失被认为是保守性取代。
嵌合体制备一种相关的嵌合HBc免疫原通常是使用重组DNA技术中的众所周知的技术制备的。因此，在编码HBc的前体序列上添加或缺失编码特定多肽序列的核酸序列，以便形成编码一种相关嵌合体的核酸。
优选把两种方法中的一种用于将所述异源表位序列插入所述环状序列。第一种方法被称为取代，其中，将编码所述免疫优势环的一部分的DNA切除，并且用编码诸如B细胞序列的异源表位的DNA取代。第二种方法被称为插入，其中，将一种异源表位插入所述环中的相邻的残基之间。
将使用聚合酶链式反应(PCR)的定点诱变用于一种典型的取代方法中，以便提供一种嵌合HBc DNA序列，该序列编码一对不同的限制位点，例如EcoRI和SacI，每一个位点靠近免疫优势环编码DNA的一个末端。典型的残基取代是在76-81号位置上进行的。将所述环编码部分切除，将编码异源B细胞表位的需要的序列连接到所述限制位点上，并且将所得到的DNA用于表达HBc嵌合体。例如，有关这种技术的典型应用可以参见Pumpens et al.，(1995)Intervirology，3863-74中的表2。
另外，可以通过定点诱变将一个限制位点编码到所述部分，用一种限制酶裂解DNA以便提供“粘性”末端，用内切核酸酶使该粘性末端变平，并且将平端异源DNA片段连接到所述裂解部位。被取代到HBc中的这种类型序列的例子可以从以下文献中找到Schodel et al.，(1991)F.Brown et al.eds.，Vaccines 91，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，New York，pp.319-325；Schodelet al.，Behring Inst.Mitt.，1997(98)p.114-119和Schodel etal.，J.Exp.Med.，(1994)180(3)p.1037-4，后两份文献分别讨论了抗约氏疟原虫和贝氏疟原虫的疫苗的制备。
业已发现，在HBc免疫性环中的插入位置和环残基的存在，对于该免疫原的活性来说可能是重要的。因此，正如在下文所说明的，将疟疾B细胞表位插入78和79号HBc残基位置之间，提供了一种颗粒状免疫原，该免疫原的免疫原性比将相同的免疫原插入76-81号残基之间的切除和取代部位高10-1000倍。另外，与将相同的疟疾免疫原插入77和78号残基之间相比，将该免疫原插入78和79号残基之间能够出乎意料地将免疫原性增强大约15倍。
因此，插入通常是优选的。在插入方法的一种说明性例子中，利用定点诱变产生两个靠近的限制位点，并且位于编码相邻氨基酸残基，如78和79号残基的密码子之间。该技术增加了12个碱基对，这些碱基对编码位于HBc环中以前相邻的残基之间的4个氨基酸残基(每个限制位点两个残基)。
当用所述限制酶进行裂解，连接编码异源B细胞表位序列的DNA，并且表达该DNA，以便形成HBc嵌合体时，发现HBc环氨基酸序列在其N-末端一侧被由5’限制位点编码的两个残基所打，在朝向C-末端方向上，随后是异源B细胞表位序列，随后是另外两个由3’非限制位点编码的异源、非环状残基，然后是该环状序列的其余部分。可以用相同方法将N-末端序列插入结构域I，正如在Neirynck et al.，(℃tober 1999)Nature Med.，5(10)1157-1163中所披露的，或者用于将T细胞表位或不是T细胞表位一部分的一个或多个半胱氨酸残基插入结构域IV。在以下文献中披露了在82和83号残基之间使用插入的类似方法Schodel et al.，(1990)F.Brown et al.eds.，Vaccines90，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，pp.193-198。
更具体地讲，这种克隆方法在图2A，2B和2C中进行示意性地说明。在图2A中，通过工程改造使编码C-末端截短的HBc序列的DNA序列(HBc149)包括位于78和79号残基之间的相邻的EcoRI和SacI位点。用这两种酶裂解DNA，提供了一种3’末端为EcoRI粘性末端的编码HBc1-78号位置的片段，而另一种片段具有5’末端SacI粘性末端，并且编码79-149号位置的残基。连接一种具有5′AATT突出端、以及随后的编码需要的疟疾B细胞表位和AGCT 3′突出端的合成核酸，从而提供了一种HBc嵌合序列，该序列编码位于78和79号残基之间的每一侧各有两个异源残基[分别为GlyIle(GI)和GluLeu(EL)]的B细胞表位，同时，通常破坏了EcoRI位点，而保留了SacI位点。
在图2B中示出了用于将含有半胱氨酸的序列插入结构域IV的一种类似方法，例如，插入特别优选的疟疾T细胞表位，它含有326-345号位置的恶性疟原虫CS蛋白序列，在本文中它被称为PF/CS326-345(Pf-UTC)。在本发明中，通过工程方法将EcoRI和HindIII限制位点添加到HBc DNA序列上，位于149号氨基酸残基位点之后。在用EcoRI和HindIII消化之后，将一种具有上述AATT 5′突出端、随后的T细胞表位编码序列、一个或多个终止密码子和3′AGCT突出端的合成DNA连接到消化过的序列上，以便形成一种编码HBc1-149号残基、随后的两个异源残基(GI)、终止密码子和HindIII位点的序列。
用一种具有SacI限制位点、随后是一个始于79号残基位置的编码HBc的序列的正向引物进行PCR扩增，然后用SacI和HindIII消化，提供了一种编码HBc79-149号位置的序列，以及两个添加的残基和C-末端的T细胞表位。用SacI消化图2B的构建体并且连接，提供了编码需要的重组HBc嵌合免疫原的完整基因，从N-末端开始，它具有HBc1-78号位置的序列、两个添加的残基、疟疾B细胞表位、两个添加的残基、HBc79-149号位置，两个添加的残基、和T细胞表位，该基因如图2C所示。
可以用类似技术插入异源接头残基，用于将B细胞表位偶联在环区序列中。所涉及的接头残基包括特别优选的赖氨酸(Lys)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)，半胱氨酸(Cys)和酪氨酸(Tyr)。
业已指出过，SEQ ID NO247所示的氨基酸残基序列包括位于77和78号位置的Glu和Asp残基。尽管如此，导入一个额外的、异源的、含有羧基的残基仍然是可行的。现有谷氨酸和天冬氨酸的化学反应性可以通过其他因素减弱。例如，本领域众所周知的是，相邻的脯氨酸，如存在于79号位置上的脯氨酸可以中和并因此减弱相邻羧基的化学反应性。
在这里，使用的所提到过的第一种插入方法将5个异源残基插入环序列；其中的一个残基是用于偶联B细胞表位的异源接头残基，并且其中的两个残基邻近上述接头残基的每一侧，而它们本身又与环序列残基相邻，并且是插入的限制位点的表达产物(限制酶人工构造物)。业已发现，人们还可以通过定点诱变在编码B细胞表位的异源接头残基的HBc环状序列中添加一个密码子。
业已发现，将两个异源残基用于B细胞或T细胞表位的任意一侧(侧翼)是一件方便的事情。结果，人们还可以在插入序列的一侧或两侧使用0-3个或更多个不是HBc序列一部分的添加的残基。可以用一种合适的核酸酶(例如S1核酸酶)“消化”插入和HBc核酸的一端或两端，以便提供平端，这些平端可以连接在一起。既不是插入的B细胞或T细胞表位的一部分也不是HBc序列的一部分的添加的异源残基不被统计在出现在相关结构域中的残基数量内。
还发现可以使用众所周知的合成方法合成需要的重组HBc嵌合核酸的全部或一部分，例如，在U.S.5,656,472中披露了177个碱基对DNA的合成，该DNA编码烟草的具有59个残基的核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶信号肽。例如，人们可以合成具有平端或“粘性末端”的结构域I和II，所合成的结构域可以连接到结构域III和IV上，以便提供一种能表达相关的HBc嵌合体的构建体，该构建体包括添加在B细胞表位N-末端一侧的0个残基，和添加在C-末端一侧或添加在结构域II/III结合部分或添加在某些其他需要位点上的0-3个残基。
在以下文献中披露了另一种插入技术Clarke et al.(1991)F.Brown et al.eds.，Vaccines 91，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，pp.313-318。在这里，利用了遗传密码的简并性，研究人员通过工程方法形成了一个相当于80和81号残基的限制位点，该位点编码存在于所述位点上的原始残基。因此它们所表达的HBc嵌合体不含有限制位点编码的残基，并且含有紧邻插入序列的HBc环的残基。
本发明还涉及编码上述HBc嵌合分子或该编码序列的互补体的核酸序列(片段)。在某些优选实施方案中，所述核酸片段是以分离的和纯化的形式存在。
在活的生物中，蛋白或多肽的氨基酸残基序列通过遗传密码直接与编码该蛋白的基因的脱氧核糖核酸(DNA)序列相关。因此，通过众所周知的遗传密码的简并性，可以根据需要制备额外的DNAs和相应的RNA序列(核酸)，该序列编码相同的嵌合氨基酸残基序列，但是与以前讨论的基因序列有足够的差异，以至这两种序列在高严格条件下不能杂交，而在中等严格条件下能够杂交。
高严格条件可以被定义为包括在大约50-55℃的温度下在6×SSC中杂交，并且最终的洗涤是在68℃在1-3×SSC中进行。中等严格条件包括在大约50℃-大约65℃的温度下在0.2-0.3M NaCl中杂交，然后在大约50℃-大约55℃在0.2×SSC，0.1％SDS(十二烷基硫酸钠)中洗涤。
一种核酸序列(DNA序列或RNA序列)，它(1)本身编码，或其互补体编码一种嵌合分子，它的HBc部分是1-136号位置的残基(如果存在的话)，该序列为SEQ ID NOS246，247，248，249，250或251的HBc部分和(2)至少能在中等严格条件(如上文所述)下与SEQ IDNO274，275，276，277，278或279的DNA序列杂交；和(3)它的与SEQ ID NO274，275，276，277，278和279的DNA序列具有至少80％，更优选至少90％，更优选至少95％，最优选至少100％相同性的HBc序列被定义为DNA变体序列。正如众所周知的，诸如所涉及的核酸序列的核酸序列是在操作性连接在合适的启动子上时在合适的表达系统中表达的，正如在本文的其他部分所讨论的。
编码所涉及嵌合分子的类似物或类似的核酸(DNA或RNA)也是本发明的一部分。嵌合体类似核酸序列或其互补的核酸序列编码一种HBc氨基酸残基序列，该序列与SEQ ID NO246，247，248，249，250和251所示1-136号残基位置的HBc序列部分的相同性至少为80％，更优选至少90％，最优选至少95％。该DNA或RNA在本文中被称为类似于SEQ ID NOs274，275，276，277，278和279的核酸序列，并且能在中等严格杂交条件下与本发明的SEQ ID NOs274，275，276，277，278和279的核酸序列或其互补体杂交。一种编码类似序列的核酸在进行适当转染和表达时也能产生一种相关的嵌合体。
不同的宿主通常优先使用特定的密码子编码特定的氨基酸残基。这种密码子优先性是众所周知的，并且可以通过诸如体外诱变的方法改变编码所需嵌合序列的DNA序列，以便宿主优先使用的密码子被用于要表达的酶的特定宿主。另外，还可以使用遗传密码的简并性来编码SEQ ID NOs246，247，248，249，250或251的序列的HBc部分，由此避免了与SEQ ID Nos274，275，276，277，278或279或其互补体的明显的相同性。因此，有用的类似DNA序列，在中等严格条件下不一定能与SEQ ID NOs274，275，276，277，278或279或互补体的核苷酸序列杂交，但仍然能提供相关的嵌合分子。
本发明还涉及诸如DNA分子的重组核酸分子，它包括与外源核酸片段(例如DNA片段或序列)操作性连接的载体，该外源核酸片段形成了编码一种如上文所述的所涉及的嵌合体的基因，以及适合驱动所述基因在相容的宿主生物中表达的启动子。更具体地讲，还涉及一种重组DNA分子，它包括一种载体，该载体包括用于驱动所述嵌合体在宿主生物细胞中表达的启动子，该启动子与操作性与一种DNA片段连接，该DNA片段形成了编码一种嵌合体的HBc部分的基因或与序列SEQID NOs274，275，276，277，278或279的嵌合基因具有至少90％的相同性，并且能在中等严格条件下与该基因杂交的DNA变体。
还涉及一种重组DNA分子，它包括一种载体，该载体包括用于驱动一种嵌合体在宿主生物细胞中表达的启动子，该启动子操作性连接在一种DNA片段上，该DNA片段是一种类似物核酸序列，它所编码的HBc嵌合部分的氨基酸残基序列与SEQ ID NO246，247，248，249，250或251的序列的HBc部分的相同性至少为80％，更优选90％，最优选95％。所述重组DNA分子在宿主细胞中进行适当的转染和表达时，能提供一种所涉及的嵌合分子。
业已发现，由于地松鼠HBc的N-末端的30个氨基酸残基的序列与任何其他HBc序列都不相同，所述序列及其编码的核酸序列及其互补体不包括在上述相同性范围内，编码所述30个残基序列的核酸部分或其用于杂交测定的互补体也不包括在内。类似的，在HBc N-和C-末端的一端或两端截短的序列在相同性计算时不包括在内，为了插入异源表位而除去了免疫优势环中的残基的序列也不包括在内。因此，仅包括存在于嵌合分子中的编码HBc的碱基或HBc序列残基，并且与相同性百分比计算中的核酸或氨基酸残基序列进行比对。
本文所披露的基因的编码序列如SEQ ID NOs274，275，276，277，278和279所示，分离的核酸片段，优选DNA序列、其变体及类似物可以通过体外诱变制备，这种技术是众所周知的，并且披露于CurrentProt℃ols In Molecular Biology，Ausabel et al.eds.，John Wiley& Sons(New York1987)p.8.1.1-8.1.6，该编码序列始于一个基因的起始ATG密码子，并且止于或正好位于每一个基因的终止密码子下游。因此，可以通过工程方法在起始密码子部位或上游，以及在终止密码子部位或下游产生一个需要的限制位点，以便能够制备、切除并分离其他基因。
正如本领域所公知，只要存在需要的核酸、所列举的DNA序列(包括起始信号和终止信号)，其他的碱基对通常存在于该片段的任意末端，并且该片段仍然可用于表达该蛋白。当然，其前提是在片段中缺乏操作性连接的抑制表达，表达能消耗表达所需要的酶的另一种产物，表达能消耗需要的由所所述需要的酶产生的反应产物的产物，或者以其他方式影响该DNA片段基因的表达的DNA序列。
因此，只要该DNA片段不含有所述干扰性DNA序列，本发明的DNA片段的长度就可以为大约500-大约15000碱基对。重组DNA分子，特别是表达载体的最大大小在很多程度上是根据方便性决定的，并且载体的大小能够被宿主细胞所容纳，只要在需要时存在复制和表达所需要的所有最小DNA序列。最小载体大小是众所周知的。长的DNA片段不是优选的，但是可以使用。
编码上述嵌合体的DNA片段可以通过化学技术合成，例如Matteucci et al.(1981)J.Am.Chem.S℃.，1033185的磷酸三酯方法。当然，通过化学合成所述编码序列，通过简单地用合适的碱基取代编码天然氨基酸残基序列的碱基可以产生任何需要的修饰。不过，优选包括上述序列的DNA片段。
可以在多种转化过的宿主系统，通常是宿主细胞中生产(表达)一种相关的HBc嵌合体，不过表达也可以在无细胞的体外系统中进行。所述宿主细胞系统包括，但不限于微生物，如用重组噬菌体、质粒或粘粒DNA表达载体转化过的细菌；用酵母表达载体转化过的酵母；用病毒表达载体(例如杆状病毒)感染过的昆虫细胞系统；用病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒；烟草花叶病毒)或用细菌表达载体(例如Ti质粒)转化过的植物细胞系统；或适当转化过的动物细胞系统，如CHO，VERO或COS细胞。本发明病毒不局限于所采用的宿主细胞。
含有编码HBc嵌合体的基因的DNA片段优选是从含有个基因的重组DNA分子(质粒载体)获得的。能够指导嵌合基因表达成HBc嵌合体蛋白的载体在本发明中被称为“表达载体”。
表达载体含有包括启动子在内的表达控制因子。所述嵌合体编码基因操作性连接在表达载体上，以便所述启动子序列能指导RNA聚合酶的结合，并表达嵌合体编码基因。可用于表达多肽编码基因的有诱导型、病毒的、合成的、组成型的启动子，Poszkowski et al.(1989)EMBO J.，32719和Odell et al.(1985)Nature，313810所披露的，以及Chua et al.(1989)Science，244174-181所披露的时间调控的、空间调控的和空间时间调控的启动子。
一种在诸如大肠杆菌的原核细胞中使用的优选的启动子是Rec7启动子，它可以通过外源添加的萘啶酮酸诱导。一种更优选的启动子存在于质粒载体JHEX25(可以从Promega获得)中，它可以通过外源添加的异丙基β-D-硫代半乳糖-吡喃糖苷(IPTG)诱导。一种更优选的启动子tac启动子存在于质粒载体pKK223-3中，并且也可以通过外源添加的IPTG诱导。用大约25-大约100微摩尔的IPTG进行诱导，能够使pKK223-3质粒在诸如XL-1，TB1，BL21和BLR的多种大肠杆菌菌株中成功地表达。令人吃惊的是，业已发现大约25-大约50微摩尔IPTG的浓度能够在2升摇瓶和发酵罐中产生最佳结果。
业已将诸如伤寒沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌-大肠杆菌杂交体的若干种沙门氏菌菌株用于表达免疫原性转基因，包括将现有的HBc嵌合体颗粒用作某些颗粒的来源，用作免疫原和活的、减毒的全细胞疫苗和接种物，并且这些表达和免疫系统可以在本发明中使用。参见U.S.6,024,961；U.S.5,888,799；U.S.Patent No.5,387,744；U.S.5,297,441；Ulrich et al.，(1998)Adv.VirusRes.，50141-182；Tacket et al.，(Aug 1997)Infect.Immun.，65(8)3381-3385；Schodel et al.，(Feb 1997)Behring Inst.Mitt.，98114-119；Nardelli-Haefliger et al.，(Dec 1996)Infect.Immun.，64(12)5219-5224；Londono et al.，(Apr 1996)Vaccine，14(6)545-552，以及其中的引用文献。
本发明还涉及与真核细胞相容的表达载体，如与酵母细胞相容的表达载体或与高等植物或动物的细胞相容的表达载体。所述表达还可用于生产本发明的重组DNA分子。用于诸如酿酒酵母或巴斯德毕赤酵母的载体可以是附加型或整合的载体，正如技术人员所公知的。真核细胞载体为本领域所公知，并可以从若干商业渠道获得。通常，所述载体包括一个或多个用于插入需要的DNA片段和启动子序列的方便的限制位点。所述载体选择性地包括专门用于真核细胞的选择标记。用于酿酒酵母的典型的启动子包括酿酒酵母磷酸甘氨酸激酶(PGK)启动子和趋异启动子GAL 10和GAL 1，而醇氧化酶基因(AOX1)是可用于巴斯德毕赤酵母的启动子。
例如，为了在甲基营养酵母巴斯德毕赤酵母中生产嵌合体，将编码所需嵌合体的基因置于调控序列的控制之下，该调控序列能指导结构基因在毕赤酵母属中的表达。将所得到的所述基因的表达感受态形式导入毕赤酵母属细胞中。
更具体地讲，可以使用Cregg et al.(1987)Biotechnology，5479-485；(1987)Molecular and Cellular Biology，123376-3385所披露的转化和表达系统。将编码嵌合体V12.Pf3.1的基因插入醇氧化酶基因(AOX1)启动子下游和同一个AOX1基因的转录终止序列上游。然后将该基因及其侧翼调控区导入具有巴斯德毕赤酵母HIS4基因和巴斯德毕赤酵母ARS序列(自主复制序列)的质粒中，这使得质粒能在巴斯德毕赤酵母细胞中复制[Cregg et al.(1987)Molecular andCellular Biology，123376-3385]。
所述载体还包括诸如pBR322的质粒的合适部分，以便该质粒能在大肠杆菌细胞中生产。所得到的具有嵌合基因，以及上述各种其他元件的质粒被示意性地转化到巴斯德毕赤酵母的his4突变体中；即缺乏功能性组氨醇脱氢酶基因的菌株的细胞。
在缺乏组氨酸的培养基上筛选转化体菌落，然后在缺乏组氨酸，但含有甲醇的培养基上生长细胞，如Cregg et al.(1987)Molecularand Cellular Biology，123376-3385所述，以便诱导AOX1启动子。所诱导的AOX1启动子能导致嵌合蛋白的表达，并且在巴斯德毕赤酵母中生产嵌合体颗粒。
还可以通过整合性转化导入一种相关的嵌合基因，这种方法不需要使用ARS序列，正如Cregg et al.(1987)Molecular and CellularBiology，123376-3385所披露的。
例如，通过在哺乳动物细胞中进行重组DNA表达生产嵌合体颗粒是使用能够在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达所述嵌合基因的重组DNA载体完成的。上述目的是通过使用本领域众所周知的方法实现的，并且该方法更详细地披露于以下文献中Sambrook et al.，MolecularCloningA Laboratory Manual，2nded.，Cold Spring HarborLaboratories(1989)。
在一种说明性例子中，用NcoI和HindIII对基于猿猴病毒(SV40)的表达载体pKSV-10(Pharmacia Fine Chemicals，Piscataway，NJ)进行限制性内切核酸酶消化。将按例1所述方法制备的编码所需HBc嵌合体的NcoI/HindIII序列片段连接到所述表达质粒上，由此产生了被命名为pSV-Pf的环状重组表达质粒。
表达质粒pSV-Pf包括一个完整的大肠杆菌氨苄青霉素抗性基因。因此，当用pSV-Pf转化大肠杆菌RR101(Bethesda ResearchLaboratories，Gaithersburg，MD)时，可以根据氨苄青霉素抗性选择含有所述质粒的细菌。然后克隆含有质粒的细菌，然后筛选插入的编码基因以正确方向插入所述表达载体的克隆。
通过培养含有所述质粒的大肠杆菌，繁殖含有编码需要的HBc嵌合体的基因的上面获得的质粒pSV-Pf。按照上述Sambrook等所披露的方法从大肠杆菌培养物中分离质粒DNA。
嵌合体的表达是通过将pSV-Pf导入诸如CHO的哺乳动物细胞系而实现的，使用Graham et al.(1973)Virol.，52456的磷酸钙介导的转染方法或类似技术。
为了确保以最大的效率将pSV-Pf导入培养中的CHO细胞，转染是在存在第二种质粒pSV2NEO(ATCC #37149)和细胞毒性药物G418(GIBCO Laboratories，Grand Island，N.Y.)的条件下进行的，如Southern et al.(1982)J.Mol.Appl.Genet.，1327所披露的。所培养的抗G418的CHO细胞获得了质粒pSV2NEO和pSV-Pf，并且被命名为CHO/pSV-Pf细胞。通过pSV-Pf表达载体的遗传学构造，在所得到的CHO/pSV-Pf细胞中表达一种嵌合体，并且可以在这些细胞的细胞质中检测并且从这些细胞的细胞质中纯化。正如在本说明书的其他部分所披露的，在柱上分离所得到的含有细胞蛋白的组合物。
选择哪一种表达载体，以及最终将编码嵌合体的基因操作性连接在哪一种启动子上，直接取决于所需要的功能特性，例如，蛋白表达的部位和时间控制，以及要转化的宿主细胞。以上是构建重组DNA分子领域中所固有的众所周知的制约因素。不过，可用于实施本发明的载体能够指导包括在操作性与它连接的DNA片段上的所述嵌合基因的复制，并且还优选能指导该基因的表达(例如表达载体)。
在一种优选实施方案中，表达嵌合体的宿主是原核生物大肠杆菌，而优选的载体包括原核生物复制子；即能够指导所述染色体外的重组DNA分子，在用它转染过的原核宿主细胞中自主复制和维持的DNA序列。所述复制子为本领域所公知。
所述包括原核复制子的载体还包括能够指导相关的HBc嵌合基因在用它转化过的诸如大肠杆菌的宿主中表达的原核启动子区。通常在质粒载体中提供与细菌宿主相容的启动子序列，该质粒载体包括一个或多个方便的限制位点，用于插入相关的DNA片段。所述载体质粒的例子包括可以从Biorad Laboratories(Richmond，CA)购买的pUC8，pUC9，和pBR329以及可以从Pharmacia，Piscataway，NJ购买的pPL和pKK223-3。
可用于在来自高等植物和哺乳动物的细胞中表达的典型载体为本领域所公知，并且包括Rogers et al.(1987)Meth.in Enzymol.，153253-277所披露的源于根瘤农杆菌的根瘤诱导(Ti)质粒的植物载体，和上述哺乳动物表达载体pKSV-10，和pCI-neo(Promega Corp.，#E1841，Madison，WI)。不过，已知能在植物中发挥作用的若干种其他表达载体系统包括Fromm et al.(1985)Pr℃.Natl.Acad.Sci.USA，8258-24所披露的pCaMVCN转移控制载体。质粒pCaMVCN(可以从Pharmacia，Piscataway，NJ购买)包括花椰菜花叶病毒CaMV 35S启动子。
上述植物表达系统通常能提供所插入的转基因的系统型或组成型表达。当植物的大部分或所有部分被用作相关的嵌合分子或所得到的颗粒的来源时，或当所述植物的大部分被用于提供口服疫苗时，可以使用系统表达。不过，在诸如根、种子或果实的植物储存器官中表达嵌合分子或颗粒可能更有效，因为可以从所述器官中更方便地分离或摄取所述颗粒。
实现储存器官表达的一种方法是使用能在一种或多种预先选择的或预定的非光合植物器官中表达其所控制的基因的启动子。在一种或多种预定储存器官中表达，而很少或不能在其他器官中表达在本文中被称为增强或优先表达，如根、种子或果实相对叶片或茎的表达。与其他器官相比，能够在一种或多种预定器官中以至少5∶1的比例指导表达的代表性启动子在本文中被定义为器官增强的启动子。基本上只能在一种储存器官中表达，并且基本上不能在其他储存器官中表达被称为器官特异性表达；即在一种储存器官中的表达产物相对另一种储存器官中的表达产物大约为100∶1或更高的比例表现出器官特异性。储存器官特异性启动子是储存器官强化启动子类型的成员。
代表性的植物储存器官包括胡萝卜、芋或木薯的根，马铃薯块茎，和果肉，如红色番石榴、西番莲果实、芒果、番木瓜、番茄、鳄梨、蜜柑、柑橘、棕榈，诸如罗马甜瓜和西瓜的甜瓜，以及其他肉质果实，如笋瓜、黄瓜、芒果、杏、桃，以及玉米、大豆、水稻、油用油菜等的种子。
CaMV 35S启动子通常被认为是组成型启动子。不过，最近的研究业已证实，当CaMV 35S启动子的一个21-bp的区域操作性连接到另一种异源常见绿色组织启动子rbcS-3A启动子上时，会导致所得到的嵌合启动子成为根增强的启动子。所述21-bp的序列披露于U.S.5,023,179。含有U.S.5,023,179的21-bp插入片段的嵌合rbcS-3A启动子可以用作本发明的根增强的启动子。
包括上述21-bp片段的类似的根强化启动子是CAMV 35S启动子本身的-90至+8部分。U.S.5,110,732披露了截短的CaMV 35S启动子能够在根和种子原基中进行强化表达，种子原基是注定要成为根的组织。该启动子也可用于本发明中。
另一种有用的根强化启动子还披露于PCT/GB92/00416(WO91/1392
公开日为1991年9月19日)的油用油菜(Brassica napus L.)基因的-1616至-1启动子。具有质粒pRlambdaS4的大肠杆菌DH5.α.和具有该启动子的噬菌体λ.β.1于1990年3月8日保藏于国立工业和海洋微生物保藏有限公司，爱伯丁，英国，保藏号为NCIMB40265和NCIMB40266。可以通过用HaeIII裂解所述质粒以1.0kb片段的形式获得该启动子的一个有用部分。
一种优选的根增强启动子是存在于由DiRita和Gelvin(1987)Mol.Gen.Genet，207233-241所披露的质粒pKan2中的甘露氨酸合成酶(mas)启动子。该启动子可以以XbaI-XbalI片段形式从它的质粒pKan2中除去。
优选的甘露氨酸合成酶根增强启动子由最多达-138号位置的核心甘露氨酸合成酶(mas)启动子区和从-318至-213的甘露氨酸合成酶激活物组成，并且被统称为AmasPmas。业已发现，与叶片表达水平相比，该启动子能将烟草根部的产量提高大约10-大约100倍。
另一种根特异性启动子是在侧根启动期间表达的富含羟基脯氨酸糖蛋白基因HRGPnt3的大约500bp的5’侧翼序列，该启动子由Keller et al.(1989)Genes Dev.，31639-1646所披露的另一种优选的根特异性启动子存在于烟草根特异性基因ToRBF的大约-636至-1的5’侧翼区中，这是由Yamamoto et al.(1991)Plant Cell，3371-381报道的。所述作者将调控表达的顺式作用元件更具体地定位于转录起始位点5’的大约-636至大约-299区。Yamamoto等披露了TorBF基因在根中的稳态mRNA生产，而不是在叶片、芽分生组织或茎中。
另一种有用的储存器官特异性启动子是番茄成熟果实基因E8的5′和3′侧翼区。Deikman et al.(1988)EMBO J.，7(11)3315-3320和(1992)Plant Physiol.，1002013-2017说明并披露了所述区及其cDNA序列。
位于该基因的5′侧翼序列的2181bp中的三个区以及poly(A)添加位点3’的522bp的序列似乎控制E8基因的表达。从-2181至-1088的一个区是通过乙烯激活E8基因在未成熟果实中转录所必需的并且它还决定着在成熟期间的转录。另外两个区-1088至-863和-409至-263不能在未成熟果实中导致乙烯反应，但是足以在成熟期间导致E8基因表达。
玉米蔗糖合成酶-1(Sh)启动子在玉米中能在胚乳中高水平表达其控制的酶，而在根中的表达水平要低的多，并且不能在绿色组织或花粉中表达。业已报道这种启动子能够在茎和根中大量存在的烟草韧皮细胞中特异性表达嵌合报道基因β-葡糖醛酸酶(GUS)。Yang et al.(1990)Pr℃.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，874144-4148。因此，这种启动子可用于诸如肉质果实的植物器官，如甜瓜，例如罗马甜瓜，或含有胚乳的组织，并且用于具有大量韧皮细胞的根。
另一种典型的组织特异性启动子是凝集素启动子，该启动子对种子组织具有特异性。大豆种子中的凝集素蛋白是由一个基因(Le1)编码的，该基因只能在种子成熟期间表达，并且占总的种子mRNA的大约2％-大约5％。业已充分表征了凝集素基因和种子特异性启动子，并且被用于在转基因烟草植物中指导种子特异性表达。例如，参见Vodkinet al.(1983)Cell，341023和Lindstrom et al.(1990)Developmental Genetics，11160。
一种特别优选的块茎特异性表达启动子是马铃薯蛋白(patatin)基因的5’侧翼区。Twell et al.(1987)Plant Mol.Biol.，9365-375披露了该启动子的用途。该启动子存在于噬菌体LPOTI的大约406bp的片段上。LPOTI启动子具有与其他四种马铃薯蛋白启动子的同源性超过90％的区域，并且在所有400个碱基中与马铃薯蛋白启动子PGT5的同源性为大约95％。上述每一种启动子都可用于本发明。还可参见Wenzler et al.(1989)Plant Mol.Biol.，1241-50。
Benfey et al.(1988)Science，244174-181披露了其他的器官增强启动子和器官特异性启动子。
所使用的每一种启动子序列基本上不受所述细胞中的嵌合分子或颗粒数量的影响。在本文中，术语“基本上不受影响”表示对转化细胞或转基因植物中所积累的嵌合分子或颗粒的直接反馈控制(抑制作用)没有反应。
用根瘤农杆菌转染植物细胞通常最好是用双子叶植物进行的。单子叶植物通常最方便的是通过所谓的原生质体直接基因转移进行转化。直接基因转移通常是通过电穿孔、通过聚乙二醇介导的转移进行或者通过用携带所需DNA的微粒轰击细胞进行。上述转染方法为本领域所熟知，并且没有必要在这里作进一步的讨论。由转染的细胞和原生质体再生完整植株的方法同样是众所周知的。用从植物组织中获得所需蛋白的技术也是众所周知的。还可参见U.S.5,618,988和5,679,880及其所引用的文献。
通过农杆菌属转化、电穿孔或其他方法生产的转基因植物通常包括位于一个染色体上的单基因。对所添加的基因而言所述转基因植物可以被称为是杂合的。不过，术语“杂合的”的使用通常意味着在一对染色体的另一个染色体的相同位点上存在一个互补基因，而在本发明的含有一个添加的基因的植物中没有这样的互补基因，这种植物的更确切的名称被认为是独立分离体，因为所添加的外源嵌合分子编码基因在有丝分裂和减数分裂期间是独立分离的。含有驱动编码一种相关的HBc嵌合分子的单一结构基因的器官强化型启动子的转基因植物，即独立分离体是优选的转基因植物。
更优选的是对所添加的结构基因为杂合的转基因植物，即包括两个添加的基因，在染色体对的每一个染色体的相同位点上存在一个基因的转基因植物。可以通过以下方法获得纯合的转基因植物让包括单一的添加基因的独立分离的转基因植物有性交配(自交)，让所生产的某些种子发芽，并且分析所生产的相对对照(天然的，非转基因的)或独立分离的转基因植物而言增强了嵌合颗粒积累的植物。与天然的、非转基因植物和独立分离的转基因植物相比，纯合转基因植物表现出增强的嵌合颗粒积累。
可以理解的是，还可以让两种不同的转基因植物杂交，以便产生包括两个独立分离的添加的外源(异源)基因的后代。让合适的后代自交能产生对编码一种嵌合HBc分子的两个添加的、外源基因为纯合的植物。也可以与一种亲本植物回交，和与一种非转基因植物进行异型杂交。
因此，本发明的转基因植物具有编码一种相关的嵌合HBc分子的异源结构基因。优选的转基因植物对于所添加的异源嵌合HBc结构基因来说是独立分离体，并且能够将该基因传递给它的后代。一种更优选的转基因植物对所述异源基因是纯合的，并且能够通过有性交配将该基因传递给它的所有后代。
由于编码嵌合HBc分子的基因在植物中不是天然存在的，当转基因植物和非转基因植物在相同条件下生长时，相关的转基因植物所积累的嵌合HBc分子颗粒的数量高于相同类型或株的非转化植物中的积累量。
术语“相同类型”或“相同株”在本文中被用于表示相同杂交的植物或未转化植物的克隆。当杂交的姊妹株之间的等位基因变异较小时，如进行充分自交的植物，可以在姊妹株之间进行比较或用若干个姊妹株进行平均。另外，优选将克隆用于比较。
在大田温室或窗台等中生长来自转基因植物的种子，并且让所产生的性成熟的转基因植物自花授粉，以便产生纯育植物。来自所述植物的后代成为不分离的纯育系，评估该纯育系中嵌合HBc分子颗粒的积累，优选在大田中，在多种环境条件下进行评估。
让在嵌合HBc分子颗粒积累方面为纯合的转基因植物与具有其他理想性状的亲本植物杂交。让在嵌合HBc分子颗粒积累方面为杂合的或者可独立分离的后代与一个或另一个亲本回交，以便获得具有嵌合HBc分子颗粒积累和其他理想性状的转基因植物。所述后代与亲本的回交可能必须重复进行1次以上，以便获得具有多种理想性状的转基因植物。
还可以用昆虫细胞系统表达HBc嵌合体。例如，在一种这样的系统中，将苜蓿营蚊夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)或杆状病毒用作载体，以便在草地夜蛾细胞或粉纹夜蛾幼虫体内表达外源基因。
可以将编码嵌合体的序列克隆到所述病毒的非必须区域，如多角体蛋白基因，并且置于多角体蛋白启动子的控制之下。嵌合序列的成功插入，会使得所述多角体蛋白基因失活，并且产生缺乏外被蛋白的重组病毒。例如，可以用所述重组病毒感染草地夜蛾细胞或粉纹夜蛾幼虫，以便能够表达HBc嵌合体。E.Engelhard et al.(1994)Pr℃.Natl.Acad.Sci.，USA，913224-3227；和V.Luckow，InsectCell Expression Technology，pp.183-218，inProtein EngineeringPrinciples and Practice，J.L.Cleland et al.eds.，Wiley-Liss，Inc，1996)。置于苜蓿营纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)的多角体蛋白启动子控制之下的异源基因，在感染的晚期通常以高水平表达。
含有所述嵌合基因的重组杆状病毒是用杆状病毒穿梭载体系统构建的(Luckow et al.(1993)J.Virol.，674566-4579)，该载体系统是作为Bac-To-BacTM杆状病毒表达系统出售的(LifeTechnologies)。制备重组病毒原种，并且通过标准方法监测重组蛋白的表达(O′Reilly et al.，Baculovirus Expression VectorsALaboratory Manual，W.H.Freeman and Company，New York，1992；and Kinget al.，The Baculovirus Expression SystemA LaboratoryGuide，Chapman & Hall，London，1992)。
业已开发了多种方法以便通过互补性粘性末端或平端将DNA操作性连接到载体上。例如，可以将互补性均聚物片段添加到将要插入载体DNA中的DNA片段上。然后通过所述互补均聚物的尾之间的氢键结合连接所述载体和DNA片段，以便形成重组DNA分子。
另外，可以用含有一个或多个限制性内切核酸酶位点的合成接头将所述DNA片段连接到所述表达载体上，正如上文所披露的。通过在存在能够催化平端DNA分子连接的诸如噬菌体T4 DNA连接酶的酶的条件下培养所述平端DNA片段和大量过量的合成接头分子，将所述合成接头连接在平端DNA片段上。
因此，所述反应的产物是在其末端具有合成接头序列的DNA片段，然后用合适的限制性核酸内切酶裂解所述DNA片段，并且连接到业已用一种能产生与所述合成接头相容的末端的酶裂解过的表达载体中。含有多种限制性内切核酸酶的合成接头可以从多种来源购买，包括NewEngland BioLabs，Beverly，MA。还可以通过PCR技术获得需要的DNA片段，其中，正向和反向引物含有可以在扩增之后裂解的理想的限制位点，以便可以将该基因插入所述载体。获得，可以将PGR产物直接克隆到包括T-突出端的载体上(Promega Corp.，A3600，Madison，WI)，正如本领域所熟知的。
所表达的嵌合蛋白在宿主细胞内自我组装成颗粒，所述宿主细胞是单细胞或多细胞宿主的细胞。用标准方法收获含有颗粒的细胞，用弗氏压碎器、溶菌酶、超声波破碎器、玻珠破碎器或微型流化器(Microfluidics International Corp.，Newton MA)裂解细胞。在澄清裂解物之后，用45％的硫酸铵使颗粒沉淀，重新悬浮在20mM磷酸钠，pH6.8中，并且用相同的缓冲液透析。通过短时间离心将透析材料澄清，并且用SepharoseCL-4B对上清液进行凝胶过滤层析。鉴定含有颗粒的级份，进行羟基磷灰石层析，并且在再次悬浮之前再次用硫酸铵沉淀，透析，消毒过滤，并且在-70℃下保存。
HBc嵌合体偶联物可以将B细胞或T细胞反应所需要的任何半抗原连接到一种相关的HBc嵌合体或嵌合体颗粒上，以便形成HBc嵌合体偶联物，所述嵌合体颗粒如含有异源接头残基的接头颗粒，所述接头残基如存在于结构域II的环区中的赖氨酸、谷氨酸或天冬氨酸、半胱氨酸或酪氨酸，以及存在于结构域IV中的添加的半胱氨酸残基。感兴趣的半抗原通常是B细胞免疫原。所述半抗原可以是多肽、碳水化合物(糖类；即寡糖或多糖)、或非多肽、非碳水化合物，如2，4-二硝基苯或诸如可卡因或尼古丁的药物。由此形成的HBc嵌合颗粒偶联物可用作接种物或疫苗，正如下文所讨论的。由于所述嵌合蛋白在表达时自我组装，并且在表达之后形成偶联物，偶联物形成通常是使用所述组装的颗粒完成的，而不是由游离的蛋白分子形成。
通过蛋白或多肽的氨基酸残基侧链将单个的半抗原操作性连接到该蛋白或多肽上以便形成悬垂连接(pendently linking)的免疫原性偶联物，例如支链多肽聚合物的方法为本领域所公知。所述方法包括通过各种侧链上的一种或多种类型的官能团连接，并且导致在所述颗粒内的载体蛋白多肽主链(在这里是HBc嵌合体)与所述半抗原悬垂连接-共价连接(偶连)-但是间隔至少一个侧链。
利用上述每一种官能团将载体蛋白连接到半抗原上的方法披露于以下文献中Erlanger，(1980)Method of Enzymology，7085；Aurameaset al.，(1978)Scand.J.Immunol.，Vol.8，Suppl.7，7-23和授予Nestor等的美国专利U.S.4,493,795。另外，还可以实施Rodwe11et al.(1985)Biotech.，3889-894所披露的定点连接反应，以便所述多肽的生物学活性基本上不会减弱。
另外，正如本领域所公知的，所述HBc蛋白和多肽半抗原能够以它们的天然形式使用，或者通过将赖氨酸残基琥珀酰化或与半胱氨酸-硫内酯起反应改变其官能团含量。还可以将巯基基团掺入载体蛋白中，或者通过氨基官能团与2-iminothiolane，3-(3-二硫代吡啶基)-丙酸酯的N-羟基琥珀酰亚胺酯或本领域已知的其他试剂反应进行偶联。
还可以将HBc嵌合体或半抗原修饰成包括一个间隔臂，如六亚甲基二胺或其他双功能分子，以便有利于所述悬垂连接。下面将披露这样一种方法。
用于共价键合多肽半抗原的方法有很大不同，并且为免疫学领域的技术人员所熟知。例如，根据U.S.4,818,527披露的方法，让m-马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯(ICN Bi℃hemicals，Inc.，Costa Mesa，CA)或琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC，Pierce Chemical Co.，R℃kford，IL)与合适的HBc嵌合体起反应，以便形成激活的载体。
然后让激活的载体与诸如以巯基为末端的半抗原或含有末端半胱氨酸或业已添加了额外的氨基或羧基末端半胱氨酸残基的多肽的半抗原起反应，以便形成共价键合的HBc嵌合偶联物。作为另一种例子，可以首先让多肽半抗原的氨基与N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基硫代)丙酸酯(SPDP，Pharmacia，Piscataway，NJ)起反应，并且在还原之后，可以让含有硫醇的多肽与激活的载体起反应。当然，含硫的部分和含有双键的Michael受体可以颠倒。所述反应披露于供应商的文献中，并且还可以参见Kitagawa，et al.(1976)J.Bi℃hem.，79233和Lachmann et al.，in1986 Synthetic Peptides as Antigens，(Ciba Foundation Symposium 119)，pp.25-40(Wiley，Chichester1986)。
U.S.4,767,842披露了若干种可用于本发明的在载体和多肽之间进行共价连接的方法。在一种方法中，在0℃下在二烷缓冲溶剂中让甲苯二异氰酸酯与所述载体起反应，以便形成激活的载体。然后将多肽半抗原与所述激活的载体混合并起反应，以便形成共价键合的HBc嵌合偶联物。
特别有用的是大量的能在一个官能团末端形成二硫键，并在另一个末端形成酰胺键的大量异双功能剂，包括上文所披露的N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)-丙酸酯(SPDP)，它能在它本身与HBc嵌合体或半抗原中的硫醇之间形成二硫键。典型的试剂包括多肽半抗原中的半胱氨酸残基和偶联配偶体中的胺，如所述载体蛋白上的赖氨酸或其他游离氨基的ε-胺。有多种这样的形成二硫键/酰胺的试剂是公知的。例如，参见Immun.Rev.(1982)62185。
其他双功能偶联试剂形成硫醚，而不是二硫键。有多种这样的成硫醚试剂可以通过商业渠道获得，并且包括6-马来酰亚胺己酸，2-溴乙酸，2-碘乙酸，4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸等的活性酯。所述羧基基团可以通过与琥珀酰亚胺或1-羟基-2-硝基-4-磺酸、钠盐结合而被激活。对于本发明的方法来说，特别优选的偶联试剂是从Pierce Chemical Co.，R℃kford，IL购买的琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)。上面所列举的化合物并非是全部的，并且所述化合物的改性物显然是可以使用的。图6提供了用SMCC(I)生产HBc激活的载体，并且随后让激活的载体与以巯基为末端的半抗原(II)起反应的示意图(方案1)。
可以用本领域所公知的多种方法获得多肽半抗原。常用的肽合成技术可以方便地应用。例如，可以使用生产较长肽的重组和基于PCR的技术。由于需要的序列通常较短，可以使用固相化学合成。
在上文的表A和B中示出了典型的多肽半抗原。所述每一种多肽可以通过它的N-末端氨基而被利用，或者通过使用在所述表中没有示出的额外的N-末端半胱氨酸。
使用相关的化学方法，将被称为“化合物”的物质连接到载体蛋白上。通常，将用于偶联的合适的官能团设计在所述化合物上。能够诱导预防肺炎链球菌的抗体的典型的化学半抗原是6-O-磷酸胆碱羟基己酸酯。Fischer et al.(1995)J.Immunol.，1543373-3382。下面的表提供了其他典型的化学半抗原。
化学半抗原

本领域有多种已知的将载体蛋白偶连到多糖上方法。可以在寡糖或较小的多糖的还原性末端[anderson(1983)Infect.Immun.，39233-238；Jennings，et al.(1981)J.Immunol.，1271011-1018；Poren et al.(1985)Mol.Immunol.，22907-919]或终端[andersonet al.(1986)J.Immunol.，1371181-1186；Beuvery et al.(1986)Dev.Bio.Scand.，65197-204]上制备醛基，该基团能够通过还原性氨基化与所述载体蛋白连接。
可以通过末端激活[anderson et al.(1986)J.Immunol.，1371181-1186]或通过沿着所述多糖链随机激活若干个官能团[Chu et al.(1983)Infect.Immun.，40245-256；Gordon，U.S.Patent No.4,619,828(1986)；Marburg，U.S.Patent No.4,882,317(1989)]偶联大的多糖。沿着所述多糖链随机激活若干个官能团，会导致一种由于沿着所述多糖链的随机连接而高度交联的偶联物。多糖与载体蛋白的最佳比例取决于所使用的特定的多糖，载体蛋白和偶联物。
有关糖与载体蛋白偶联方法的详细综述可以参见Dick et al.，inContributions to Microbiology and Immunology，Vol.10，Cruse etal.，eds.，(S.Karger1989)，pp.48-114；Jennings et al.，inNeoglyc℃onjugatesPreparation and Applications，Lee et al.，eds.，(Academic Press1994)，pp.325-371；Aplinet al.，(1981)CRC Crit.Rev.Bi℃hem.，10259-306；和Stowell et al.(1980)Adv.Carbohydr.Chem.Bi℃hem.，37225-281。
所述碳水化合物本身可以通过本领域已知方法合成，例如通过Witte et al.(1997)J.Am.Chem.S℃.，1192114-2118所披露的酶促糖蛋白合成方法合成。
在以下段落中披露了若干种合成的和半合成的以及天然的寡聚糖，用它作为用于制备本发明的HBc偶联物的相关半抗原的寡糖的例子。
适用于制备用于治疗b型流感嗜血菌(Hib)疫苗的寡糖半抗原由2-20个重复的D-核糖-D-核糖醇-磷酸(I，见下文)，D-核糖醇-磷酸-D-核糖(II，见下文)或磷酸-D-核糖-D-核糖醇(III，见下文)组成。Eduard C.Beuvery et al.，EP-0 276 516-B1。

美国专利U.S.4,220,717也披露了一种用于b型流感嗜血菌的聚核糖基核糖醇磷酸(PRP)半抗原。
Peterson et al.(1998)Infect.Immun.，66(8)3848-3855披露了一种三糖半抗原，αKdo(2→8)αKdo(2→4)αKdo，它能提供对肺炎衣原体的预防作用。肺炎衣原体是导致从咽炎到致命性肺炎的人类呼吸道感染的病因。Kdo是3-脱氧-D-甘露糖-辛-2-酮糖酸(ulosonicacid)。
Andersson et al.，EP-0 126 043-A1披露了可用于治疗、预防或诊断由肺炎链球菌导致的细菌感染的糖类。一种类型的有用的糖类源于二糖GlcNAcβ1→3Gal。andersson等还披露了可以使用neolactotetraosylceramide，它是Galβ1→4GlcNAcβ1→3Galβ1→4Glc-Cer。
McKenney et al.(1999)Science，2841523-1527披露了一种多糖，聚-N-琥珀酰β1→6GlcN(PNSG)，它提供了对金黄色葡萄球菌的预防作用。金黄色葡萄球菌是社区获得的感染的常见原因，包括心内膜炎、骨髓炎，脓毒性关节炎、肺炎和脓肿。
其内容被收作本文参考的欧洲专利0 157 899-B1披露了肺炎球菌多糖的分离，这种多糖可用于本发明中。下面的表格列举了能生产可用作本发明的半抗原的荚膜多糖的肺炎球菌培养物类型。
多糖半抗原来源

据报导，黏膜炎莫拉氏菌能导致儿童的中耳炎和鼻窦炎，以及成年人的下呼吸道感染。在3-脱氧-D-甘露糖-酮糖酸-葡糖胺键上裂解所述细菌的脂寡糖表面抗原(LOS)的脂质A部分。用弱碱处理裂解产物，以便除去酯连接的脂肪酸，而保留酰胺连接的脂肪酸，以便产生来自黏膜炎莫拉氏菌的脱氧化脂多糖(dLOS)。DLOS是非免疫原性的，直到它与蛋白载体连接。Xin-Xing Gu et al.(1998)Infect.Immun.，66(5)1891-1897。
B型链球菌(GBS)是人类脓毒症、脑膜炎和相关的神经疾病的致病原因。已知英膜多糖特异性抗体能预防人类婴儿受到感染。Jenningset al.，U.S.5,795,580。GBS荚膜多糖II型的重复单位是→4)-β-D-GlcpNAc-(1→3)-[β-D-Galp(1→6)]-β-D-Galp(1→4)-β-D-Glcp-(1→3)-β-D-Glcp-(1→2)-[α-D-NeupNAc(2→3)].-β-D-Galp-(1→，其中，加括号的部分是连接在紧随其后的没加括号的亚基上的分支。GBS荚膜多糖V型的重复单位是→4)-[α-D-NeupNAc-(2→3)-β-D-Galp-(1→4)-β-D-GlcpNAc-(1→6)]-α-D-Glcp-(1→4)-[β-D-Glcp-(1→3)]-β-D-Galp-(1→4)-β-D-Glcp-(1→。
Brade的欧洲专利申请EU-0 641 568-A1披露了从沙眼衣原体、肺炎衣原体和鹦鹉热衣原体获得梯状条带图样的方法。
Slovin et al.，(1999)Pr℃.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，96(10)5710-5715披露了使用与KLH连接的合成的寡糖globo H作为制备用于抗前列腺癌的疫苗的载体。类似的，Helling et al.，(July 1995)Cancer Res.，552783-2788披露了将KLH-连接的GM2用于治疗患有黑素瘤的患者的疫苗中。后一种疫苗是通过以下方法制备的用臭氧裂解GM2的神经酰胺双键，导入一个醛基，并且还原性烷基化到KLH。可以将一种相关的嵌合颗粒用于类似方法中。
存在于诸如黑素瘤、成神经细胞瘤和健康脑细胞的其他肿瘤细胞和正常细胞表面上的诸如红细胞糖苷和神经节苷脂的鞘脂的寡聚糖部分在本发明中同样可用作半抗原。红细胞糖苷globo H的寡聚糖部分具有以下结构Fucα-(1→2)-Galβ(1→3)-GalNAcα-(1→3)-Galβ-(1→4)-Galβ-(1→4)Glc，而神经节苷脂GM2，GM1和GD1a的糖类部分分别具有以下结构GalNAcβ-(1→4)-[NeuAcα-(2→3)]-Galβ-(1→4)-Glc；Galβ-(1→3)-GalNAcβ-(1→4)-[NeuAcα-(2→3)]-Galβ-(1→4)-Glc；和NeuAc-(2→3)-Galβ-(1→3)-GalNAcβ-(1→4)-[NeuAcα-(2→3)]-Galβ-(1→4)-Glc。
U.S.4,356,170披露了有用多糖的制备，这种糖是还原性，然后被氧化成具有末端醛基的化合物。所述醛基被还原性地氨基化到载体蛋白的游离氨基上，如破伤风类毒素和白喉类毒素，存在或不存在显著交联。典型的有用的细菌多糖包括β-溶血链球菌、流感嗜血菌、脑膜炎球菌、肺炎球菌和大肠杆菌；除了还原性地胺化所述颗粒之外，还可将诸如由ε-氨基C2-C8烷基羧酸提供的接头臂还原性地胺化到所述多糖上，然后通过水溶性碳二亚胺与所述颗粒连接。
接种物和疫苗在本发明的另一个实施方案中，将与一种半抗原偶联的HBc嵌合颗粒或与一种半抗原偶联的HBc嵌合颗粒用作接种物的免疫原，它能在接种过的宿主中诱导B或T细胞反应(刺激)，以便产生能够与异源表位或半抗原发生免疫反应的抗体，或实现T细胞激活，或作为一种疫苗，提供对产生所述异源表位或半抗原的病原体的预防作用。
可以通过多种技术测定T细胞激活。在常用方法中，用一种相关的HBc嵌合颗粒疫苗或接种物接种一种宿主动物，并且随后采集外周单核血细胞(PMBC)。然后存在T细胞免疫原的条件下体外培养所述PMBC大约3-5天时间。然后测定所培养的PMBC的增殖或诸如IFN-γ的IL-2、GM-CSF的细胞因子的分泌。T细胞激活的测定为本领域所公知。例如，参见U.S.5,478,726，及其所引用的文献。
以抗体形成为例，一种相关的接种物或疫苗包括溶解或分散在可以药用的稀释组合物中的免疫原性有效量的HBc嵌合体颗粒或HBc嵌合体颗粒偶联物。所述稀释组合物通常还含有水。在给需要免疫或需要在它体内诱导抗体的诸如哺乳动物(例如，小鼠、犬、山羊、绵羊、马、牛、猴、猿或人)或禽类(例如，鸡、火鸡、鸭或鹅)的宿主动物施用时，接种物能诱导与偶联的(悬垂连接的)半抗原发生免疫反应的抗体。所述抗体优选还能结合在B细胞免疫原的蛋白或糖上。
疫苗是一种类型的接种物，其中，所述异源B细胞表位或偶联的半抗原相当于与一种疾病状态相关的蛋白或糖类结构的一部分，例如与疟疾病原体相关的疟疾B细胞序列。所述疫苗诱导的抗体不仅能与所述表位或半抗原或对所述异源或半抗原有反应的激活的T细胞发生免疫反应，而且还能在体内与所述病原体或病变细胞发生免疫反应，并且提供对所述疾病状态的预防作用。
用于每一次免疫接种的重组HBc嵌合体免疫原的量被称为免疫原性有效量，并且可以有很大的不同，特别是根据所述重组HBc嵌合免疫原、免疫接种的哺乳动物和佐剂在所述疫苗中的存在而有所不同，正如下文所讨论的。如上文所述，免疫有效量的疫苗和接种物分别能提供预防作用或抗体活性。
疫苗或接种物通常含有每次接种大约1微克-大约1毫克浓度的重组HBc嵌合体免疫原(单位剂量)，优选大约10微克-大约50微克/单位剂量。与本发明的疫苗或接种物相关的术语“单位剂量”表示适合作为动物的单元剂量的物理学上分离的单位，每个单位含有计算出来的预定数量的活性物质，用于与需要的稀释剂，即载体或媒介物一起单独或共同产生需要的免疫效果。
疫苗或接种物通常是用回收的重组HBc嵌合体免疫原制备的，包括将所述免疫原，优选颗粒形式的免疫原分散在诸如水、盐水、磷酸缓冲的盐溶液(PBS)、乙酸缓冲的盐溶液(ABS)、或Ringer′s溶液等的生理学可耐受的(可接受的)稀释媒介物中，以便形成含水组合物。所述媒介物还可以包括含油物质，如下文所披露的花生油、角鲨烷或角鲨烯。
含有蛋白类物质作为活性成分的接种物或疫苗的制备同样为本领域所熟知。通常，所述接种物或疫苗是以液体溶液或悬浮液的肠胃外制剂形式制备的；还可以制备适合在注射之前溶解或悬浮在液体中的固体形式。所述制剂还可以是乳化的，乳化形式的制剂是特别优选的。
免疫活性成分通常与可以药用的并且与所述活性成分相容的赋形剂混合。例如，合适的赋形剂包括水、盐水、葡萄糖、甘油、或乙醇等及其组合。另外，如果需要，接种物或疫苗可以含有能增强该组合物的免疫效果的微量辅助物质，如湿润剂或乳化剂、pH缓冲剂。
一种相关的疫苗或接种物优选还包括一种佐剂。适用于本发明的疫苗和接种物的佐剂包括能增强针对所述嵌合体的B细胞表位的抗体反应的佐剂，以及能增强细胞介导的针对所述嵌合体中所含的T细胞表位的佐剂。佐剂被本领域所公知(例如，参见Vaccine Design-TheSubunit and Adjuvant Approach，1995，PharmaceuticalBiotechnology，Volume 6，Eds.Powell，M.F.，和Newman，M.J.，Plenum Press，New York和London，ISBN 0-306-44867-X)。
典型的佐剂包括不能用于人的完全弗氏佐剂(CFA)，不完全弗氏佐剂(IFA)、角鲨烯、角鲨烷、明矾[例如，AlhydrogelTM(Superfos，Denmark)]这些材料是本领域所公知，并且被从若干来源购买。
可以与本发明的免疫原一起使用的优选佐剂包括铝盐或钙盐(例如，氢氧化物或磷酸盐)。用于本发明特别优选的佐剂是诸如AlhydrogelTM的氢氧化铝凝胶。对于氢氧化铝凝胶来说，将所述嵌合蛋白与该佐剂混合，以便每一个剂量中存在50-800微克的铝，优选存在400-600微克的铝。
用于本发明免疫原的另一种特别优选的佐剂是乳液。所涉及的一种乳液可以是水包油乳液或油包水乳液。除了所述免疫原性嵌合蛋白之外，所述乳液包括众所周知的诸如角鲨烯、角鲨烷、或花生油之类的油相，以及分散剂。优选非离子型分散剂，并且，所述材料包括山梨聚糖和二缩甘露醇的单和二-C12-C24-脂肪酸酯，如山梨聚糖单硬脂酸酯，山梨聚糖单油酸酯和二缩甘露醇单油酸酯。含有免疫原的乳液以乳液形式施用。
所述乳液优选是油包水乳液，该乳液包括在水相中与所述嵌合蛋白乳化的角鲨烯和二缩甘露醇甘油酸酯(ArlacelTMA)，并选择性地含有角鲨烷。所述乳液包括众所周知的MontanideTMISA-720，和MontanideTMISA 703(Seppic，Castres，France)，这两种乳液都被认为含有角鲨烯和角鲨烷，在每一种乳液中都以角鲨烯为主，但在MontanideTMISA-703中所占比重较小。最优选的是使用MontanideTMISA 720，并且使用7∶3(w/w)的油与水的比例。其他优选的水包油型乳液佐剂披露于WO 95/17210和EP 0 399 843中的佐剂。
本发明还可以使用小分子佐剂。可用于本发明的一种类型的小分子佐剂是披露于U.S.4,539,205，No.4,643,992，No.5,011,828和No.5,093,3187中的7-取代的8-氧或8-硫-鸟苷衍生物，以上专利内容被收作本文的参考。在上述材料中，7-烯丙基-8-氧化鸟苷(loxoribine)是特别优选的。业已证实所述分子在诱导抗原-(免疫原)特异性反应方面特别有效。
其他有用的佐剂包括可以从CoRIxa Corp.(参见see，U.S.4,987,237)购买的单磷酰脂质A(MPL)，可以从Coley PharmaceuticalGroup购买的CPG，可以从Aquila Biopharmaceuticals购买的QS21，可以从SKB购买的SBAS2，披露于U.S.4,767,842中的所谓胞壁酰二肽类似物，和可以从Chiron Corp.购买的MF59(参见U.S.5,709,879和6,086,901)。
更具体地讲，还可以使用源于南美树种Quillaja SaponariaMolina的树皮的具有佐剂活性的免疫学活性皂苷级份(例如QuilTMA)。在U.S.5,057,540中披露了QuilTMA的衍生物，例如QS21(HPLC纯化的QuilTMA的级份衍生物)及其生产方法。除了QS21(被称为QA21)之外，还披露了诸如QA17的其他级份。
3-De-O-酰化单磷酸脂质A是由Ribi Immun℃hem，Hamilton，Montana生产的一种众所周知的佐剂。所述佐剂含有溶解在20％角鲨烯/Tween80乳液中的从细菌中提取的三种成分单磷酰脂质(MPL)A、海藻糖二分支菌酸(TDM)和细胞壁骨骼(CWS)(MPL+TDM+CWS)。这种佐剂可以用GB 2122204B中所披露的方法制备。一种优选形式的3-de-O-酰化单磷酰脂质A是乳液形式的，具有直径小于0.2微米的粒度(EP 0 689 454 B1)。
胞壁酰二肽佐剂包括N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thur-MDP)、N-乙酰-正-胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(CGP 11637，被称为正-MDP)和N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(CGP)1983A，被称为MTP-PE)。
优选的佐剂混合物包括3D-MPL和QS21的组合(EP 0 671 948B1)、含有3D-MPL和QS21的水包油型乳液(WO 95/17210，PCT/EP98/05714)、与其他载体配伍的3D-MPL(EP 0 689 454 B1)、在含有胆甾醇的脂质体中配制的QS21(WO 96/33739)、或免疫刺激寡核苷酸(WO 96/02555)。其他佐剂包括披露于WO 99/52549中的佐剂，和聚氧乙烯醚的非颗粒悬浮液(英国专利申请号9807805.8)。
以佐剂用量使用佐剂，佐剂用量可以根据所述佐剂、哺乳动物和重组HBc嵌合免疫原而改变。典型的用量可以在每次接种大约1微克-大约1毫克之间变化。本领域技术人员了解的是，可以方便地确定合适的浓度或用量。
接种物和疫苗通常是通过注射以肠胃外方式施用的，例如皮下注射或肌内注射。适合其他施用模式的其他制剂包括栓剂，以及在某些场合下为口服制剂。还可以使用用于接种的鼻腔喷雾剂，正如在Neirynck et al.(℃t.1999)Nature Med.，5(10)1157-1163中所披露的。对于栓剂来说，可以包括传统粘接剂和载体，例如聚亚烷基二醇或甘油三酯；所述栓剂可以用含有0.5％-10％优选1-2％的活性成分的混合物制成。口服制剂包括常用的赋形剂，例如药物级甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素和碳酸镁等。
接种物或疫苗组合物采用溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、缓释制剂或粉末形式并且含有免疫原性有效量的HBc嵌合体或HBc嵌合体偶联物，优选颗粒形式的活性成分。在一种典型组合物中，免疫有效量的优选HBc嵌合体或HBc嵌合体偶联物颗粒为每个剂量中大约1微克-大约1毫克活性成分，更优选每个剂量大约5微克-大约50微克，正如上文所披露的。
制备的疫苗通常是用于肠胃外施用的。典型的免疫接种是通过皮下(SC)、肌内(IM)、静脉内(IV)、腹膜内(IP)或真皮内(ID)注射进行的。
所述HBc嵌合体颗粒和HBc嵌合体颗粒偶联物可以制备成中性或盐形式的疫苗。可以药用的盐包括酸加成盐(与蛋白或半抗原的游离氨基一起形成)，并且是与无机酸，如氢氯酸或磷酸，或诸如乙酸、草酸、酒石酸、和扁桃酸的有机酸一起形成的。与游离羧基形成的盐还可以由诸如钠、钾、铵、钙或铁氢氧化物的无机碱产生，以及由诸如异丙胺、三甲胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸和普鲁卡因之类的有机碱产生。
在另一种实施方案中，涉及一种疫苗或接种物，其中，将编码相关HBc嵌合体的基因转染到适当减毒的肠道细菌中，如伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌-大肠杆菌杂合体或大肠杆菌。在上文所提供的引用文献中披露了代表性的减毒的或无毒的伤寒沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌-大肠杆菌。所述疫苗和接种物特别适合于抗感染或通过鼻黏膜、肠道和呼吸道传播的疾病，如流感，酵母，如曲霉属和念珠菌属，病毒，如脊髓灰质炎病毒、口蹄疫病毒、甲型肝炎病毒和细菌，如霍乱菌属、沙门氏菌属和大肠杆菌，并且，其中除了IgG系统反应之外或作为该系统反应的替代之外，需要黏膜IgA反应。
所述肠道细菌可以是冷冻干燥的，与干的可以药用的稀释剂混合，制成片剂或胶囊，以便摄取和施用，或由所述宿主动物以常见固相药物形式使用。另外，所述细菌疫苗的含水制剂适用于黏膜接种，如通过口腔、鼻腔、直肠或阴道施用。
用含有相关嵌合分子颗粒的植物材料口服免疫接种可以通过简单地摄取诸如胡萝卜的根或诸如水稻或玉米的种子的转基因植物组织而实现。在这种情况下，口腔或胃肠道中的水提供了用于免疫接种的常用的含水介质，而周围的植物材料提供了可以药用的稀释剂。
所述接种物或疫苗是以与制剂相容的形式，以及治疗和免疫有效的用量使用的。要使用的量取决于接受治疗的对象，所述对象免疫系统合成抗体的能力，以及需要保护的程度。需要施用的活性成分的确切数量取决于开业医生的判断，并且对每一个个体来说有所不同。不过，合适的剂量范围是每个个体10的乘方个微克的活性成分。最初施用和加强接种的合适方案也是可以变化的，不过通常在首次施用之后间隔一定时间(数周或数月)再进行1次注射或以其他方式施用。
一旦进行了接种，就将所述哺乳动物维持一段足以由所述重组HBc嵌合体免疫原诱导产生足够效价的抗体的时间，所述抗体能结合感兴趣的抗原，如疟疾疫苗的子孢子。用于生产说明性的抗子孢子抗体的维持时间通常持续大约3周-大约12周时间，并且可以包括1次加强免疫，第2次免疫施用所述疫苗。如果必要，还可以在首次免疫接种之后24周-5年内进行第3次接种。特别理想的是，一旦达到了预防性抗体效价水平，就可以通过以大约1-大约5年的间隔定期加强免疫接种优选维持在该抗体效价水平上或接近该抗体效价水平上。
抗子孢子或其他抗体的生产可以通过以下方法方便地证实从免疫接种的哺乳动物体内获得血浆或血清样品，通过下文所披露的ELISA或通过本领域众所周知的诸如蛋白印迹的其他免疫测定测定样品中的抗体结合诸如合成的环子孢子免疫优势抗原的合适抗原[如本发明所使用的恶性疟原虫CS蛋白肽(NANP)5]的能力。
业已发现，可以用众所周知的技术从接种的宿主哺乳动物血液中分离所诱导的抗体，如抗CS抗体，并且，重构成用于被动免疫接种的第二种疫苗，这种技术同样是众所周知的。类似技术可用于人类的γ-球蛋白免疫。例如，可以在硫酸铵水溶液中(通常为40-50％的饱和度)沉淀来自一种或多种免疫宿主的抗血清，并且通过层析方法纯化沉淀的抗体，例如通过亲和层析纯化，其中，将(NANP)5用作固定在层析柱上的抗原。因此，举例来说，可以将一种接种物用于马或绵羊体内，以便诱导抗疟疾病原体的抗体的产生，以便用于诸如人的其他动物的被动免疫接种。
本发明的另一种实施方案是一种在动物宿主内诱导抗体、激活的T细胞或这两者的方法，包括用一种接种物接种所述动物宿主的步骤。用于所述方法中的接种物包括溶解在或分散在可以药用的稀释剂中的免疫原性数量的上述HBc嵌合颗粒或HBc嵌合体颗粒偶联物。维持所述动物宿主一段足以诱导抗体或激活的T细胞的时间，这段时间可以通过众所周知的技术确定，通常需要数周至数月时间，这同样是众所周知的。在此维持期间需要进行多次这样的免疫接种。
通过下面的非限定实施例对本发明进行说明。
实施例1制备含有B细胞表位的嵌合体A.制备质粒载体pKK223-3N，pKK223-3的一种修饰形式通过建立一个独特的NcoI限制位点修饰质粒载体pKK223-3(Pharmacia)，以便能够以NcoI-HindIII限制片段形式插入HBc基因，然后在大肠杆菌宿主细胞中表达。为了修饰pKK223-3质粒载体，使用PCR引物pKK223-3/433-452-F和pKK223-NcoI-mod-R，并且用pKK223-3作模板制备一种新的SphI-HindIII片段。用限制酶SphI和HindIII裂解该PCR片段，以便得到467bp的片段，然后将该片段连接到pKK223-3载体的4106bp片段上，以便有效取代原有的480bpSphI-HindIII片段。因此，所得到的质粒(pKK223-3N)比亲本质粒短了13bp，并且包括位于所导入的NcoI位点上游的修饰过的核苷酸序列(参见图1，其中，虚线表示缺少碱基)。最终的质粒pKK223-3N的大小为4573bp。在图1中示出了pKK223-3N的限制位点，为了形成质粒pKK223-3N而对pKK223-3进行的核苷酸改变通过下划线表示，如下文所示。
pKK223-3/433-452-F GGTGCATGCAAGGAGATG SEQ ID NO65pKK223-NcoI-mod-RGCGAAGCTTCGGATCccatggTTTTTTCCTCCTTATGTGAAATTGTTATCCGCTCSEQ ID NO66B.V1和V2克隆载体的制备通过PCR构建能够接受定向插入免疫优势环区的合成dsDNA片段的修饰过的HBc149基因。[在E77和D78氨基酸之间接受插入片段的质粒被命名为V1，而D78的P79之间接受插入片段的质粒被命名为V2]。用两个PCR引物对分两半扩增HBc149基因，其中的一个引物对扩增氨基末端，而另一个引物对扩增羧基末端。对于V1来说，PCR反应产物(N-和C-末端)都是246bp片段，对于V2来说，扩增产物是249bp(N-末端)和243bp片段(C-末端)。
用NcoI和EcoRI消化所制备的N-末端片段，并且用EcoRI和HindIII消化C-末端片段。然后通过共同的EcoRI突出端将V1和V2片段对连接在一起。然后将所得到的NcoI-HindIII片段连接到pKK223-3N载体上，该载体业已通过用NcoI和HindIII消化进行过制备。
为了将B细胞表位插入V1和V2质粒，用EcoRI和SacI限制酶消化所述质粒。然后插入含有5′EcoRI和3′SacI突出端的合成的dsDNA片段。对于V1和V2这两种质粒来说，在所插入的B细胞表位侧翼是由所述限制位点编码的甘氨酸-异亮氨酸(EcoRI)和谷氨酸-亮氨酸(SacI)氨基酸对。在下面的引物中在插入限制位点下面加下划线。
V1HBc149/NcoI-F5′-TTGGGCCATGGACATCGACCCTTA SEQ ID NO67
HBc-E77/EcoRI-R5′-GCGGAATTCCTTCCAAATTAACACCCACCSEQ ID NO68HBc-D78/EcoRI-SacI-F5′-CGCGAATTCAAAAAGAGCTCGATCCAGCGTCTAGAGACSEQ ID NO69HBc149/HindIII-R5′-CGCAAGCTTAAACAACAGTAGTCTCCGGAAG SEQ ID NO70V2HBc149/NcoI-F5′-TTGGGCCATGGACATCGACCCTTA SEQ ID NO67HBc-D78/EcoRI-R5′-GCGGAATTCCATCTTCCAAATTAACACCCAC SEQ ID NO72HBc-P79/EcoRI-SacI-F5′-CGCGAATTCAAAAAGAGCTCCCAGCGTCTAGAGACCTAGSEQ ID NO73HBc149/HindIII-R5′-CGCAAGCTTAAACAACAGTAGTCTCCGGAAG SEQ ID NO70C.V7克隆载体的制备为了能够将T细胞表位融合在HBc嵌合体的C-末端，重建了一种新的载体V7。将单一的EcoRI和SacI限制位点插入149号缬氨酸和HindIII位点之间，以便将合成的dsDNAs定向插入EcoRI-HindIII(或EcoRI-SacI)限制位点。使用下面的PCR引物对扩增在氨基末端具有NcoI限制位点，并且在羧基末端具有EcoRI，SacI和HindIII位点的HBc149基因。用NcoI/HindIII消化PCR反应的产物(479bp)，并且克隆到pKK223-3N上，以便形成V7。
为了插入T细胞表位，用EcoRI/HindIII(或EcoRI-SacI)消化质粒(V7)，将具有EcoRI/HindIII(或EcoRI/SacI)突出端的合成dsDNA片段连接到V7上。对于所有V7构建体来说，天然HBc(149号缬氨酸)的最后一个氨基酸和插入的T细胞表位的第一个氨基酸由形成EcoRI限制位点的核苷酸编码的甘氨酸-异亮氨酸二肽序列隔开。对于插入EcoRI/SacI位点的表位来说，由于有SacI位点，在T细胞表位之后，在终止密码子之前还编码的额外的谷氨酸-亮氨酸残基。同样在所示出的限制位点下面加下划线。
HBc149/NcoI-F5′-TTGGGCCATGGACATCGACCCTTA SEQ ID NO67HBc149/SacI-EcoRI-H3-R5′-CGCAAGCTTAGAGCTCTTGAATTCCAACAACAGTAGTCTCCGSEQ ID NO75D.V12表达构建体的制备用V2和V7载体构建V12载体，该载体包括位于78和79号氨基酸之间的B细胞表位，以及位于149号缬氨酸下游的T细胞表位。用两种PCR引物(HBc-P79/SacI-F和pKK223-2/4515-32R)扩增含有插入EcoRI/HindIII位点的AT细胞表位的V7载体的羧基末端，以便提供相当于79-149号氨基酸加上T细胞表位的dsDNA片段，其侧翼为SacI和HindIII限制位点。
用SacI和HindIII裂解PCR产物，然后将其克隆到通过用两种相同的酶裂解制备的需要的V2载体上。所示出的PCR引物能够扩增所有V7基因的羧基末端，而无论T细胞表位是否存在于HBc基因的149号氨基酸之后。
该方法普遍的一个例外是，含有Pf-CS(C17A)突变的V12构建体的制备，该构建体是用现有的V12构建体制备的。在这种情况下，用HBc149/NcoI-F(SEQ ID NO67)和错配反向PCR引物(SEQ ID NO145)扩增V12构建体，它有利于C17A突变。用NcoI和HindIII消化所得到的产物，并且重新克隆到pKK223-3N(事先用相同的酶裂解)上，在限制位点下面加下划线。
HBc-P79/SacI-F 5′-CGCGAGCTCCCAGCGTCTAGAGACCTAGSEQ ID NO76pKK223-2/4515-32R 5′-GTATCAGGCTGAAAATCSEQ ID NO77E.插入V2的恶性疟原虫CS-重复B细胞表位对于V2和V7构建体来说，将编码感兴趣的B(V2)或T细胞表位(V7)的合成dsDNA片段插入EcoRI/SacI限制位点。编码B和T细胞表位的dsDNA片段是通过以下方法制备的以等摩尔浓度混合互补的单链DNA寡核苷酸，加热到95℃，保持5分钟，然后以每分钟降低1℃的速度冷却到室温。该退火反应是在TE缓冲液中进行的。双链DNA在下方示出，而它所编码的表位序列在上方示出。符号#被用于以下某些氨基酸残基序列中，用它表示存在终止密码子。
Pf1I N A N P N A N P N A N P N AAATTAACGCTAATCCGAACGCTAATCCGAACGCTAATCCGAACGCTATTGCGATTAGGCTTGCGATTAGGCTTGCGATTAGGCTTGCGATN P E LSEQ ID NO78ATCCGGAGCT SEQ ID NO79TAGGCC SEQ ID NO80Pf3I N A N P N V D P N A N P N A N PAATTAACGCTAATCCGAACGTTGACCCGAACGCTAATCCGAACGCTAATCCGATTGCGATTAGGCTTGCAACTGGGCTTGCGATTAGGCTTGCGATTAGGCTN A N P N V D P N A N P E L SEQ ID NO81ACGCTAATCCGAACGTTGACCCGAACGCTAATCCGGAGCT SEQ ID NO82TGCGATTAGGCTTGCAACTGGGCTTGCGATTAGGCCTCGAGGSEQ ID NO83pf3.1
I N A N P N V D P N A N P N A N PAATTAACGCGAATCCGAACGTGGATCCGAATGCCAACCCTAACGCCAACCCTTGCGCTTAGGCTTGCACCTAGGCTTACGGTTGGGATTGCGGTTGGGN A N P E LSEQ ID NO84AAATGCGAACCCAGAGCTSEQ ID NO85TTTACGCTTGGGTCSEQ ID NO86Pf3.2I N A N P N A N P N A N P N V D PAATTAACGCGAATCCGAATGCCAACCCTAACGCCAACCCAAACGTGGATCCGATTGCGCTTAGGCTTACGGTTGGGATTGCGGTTGGGTTTGCACCTAGGCTN A N P E L SEQ ID NO87ATGCGAACCCAGAGCT SEQ ID NO88TACGCTTGGGTC SEQ ID NO89Pf3.3I N A N P N V D P N A N P N A N PAATTAACGCGAATCCGAACGTGGATCCAAATGCCAACCCTAACGCTAATCCAATTGCGCTTAGGCTTGCACCTAGGTTTACGGTTGGGATTGCGATTAGGTTN A N P N V D P N A N P E L SEQ ID NO90ACGCCAACCCGAATGTTGACCCCAATGCCAATCCGGAGCT SEQ ID NO91TGCGGTTGGGCTTACAACTGGGGTTACGGTTAGGCC SEQ ID NO92Pf3.4I N P N V D P N A N P N A N P N A
AATTAATCCGAACGTGGATCCAAATGCCAACCCTAACGCTAATCCAAACGCCATTAGGCTTGCACCTAGGTTTACGGTTGGGATTGCGATTAGGTTTGCGGTN P N V E L SEQ ID NO93ACCCGAATGTTGAGCT SEQ ID NO94TGGGCTTACAAC SEQ ID NO95Pf3.5I N P N V D P N A N P N A N P N AAATTAATCCGAACGTGGATCCAAATGCCAACCCTAACGCTAATCCAAACGCCATTAGGCTTGCACCTAGGTTTACGGTTGGGATTGCGATTAGGTTTGCGGTN P N V D P E LSEQ ID NO96ACCCGAATGTTGACCCTGAGCTSEQ ID NO97TGGGCTTACAACTGGGACSEQ ID NO98Pf3.6I N P N V D P N A N P N A N P N AAATTAATCCGAACGTGGATCCAAATGCCAACCCTAACGCTAATCCAAACGCCATTAGGCTTGCACCTAGGTTTACGGTTGGGATTGCGATTAGGTTTGCGGTN P N V D P N A E L SEQ ID NO99ACCCGAATGTTGACCCTAATGCTGAGCT SEQ ID NO100TGGGCTTACAACTGGGATTACGAC SEQ ID NO101Pf3.7I N V D P N A N P N A N P N A N P
AATTAACGTGGATCCAAATGCCAACCCTAACGCTAATCCAAACGCCAACCCGATTGCACCTAGGTTTACGGTTGGGATTGCGATTAGGTTTGCGGTTGGGCTN V E LSEQ ID NO102ATGTTGAGCTSEQ ID NO103TACAAC SEQ ID NO104Pf3.8I N V D P N A N P N A N P N A N PAATTAACGTGGATCCAAATGCCAACCCTAACGCTAATCCAAACGCCAACCCGATTGCACCTAGGTTTACGGTTGGGATTGCGATTAGGTTTGCGGTTGGGCTN V D P E L SEQ ID NO105ATGTTGACCCTGAGCT SEQ ID NO106TACAACTGGGAC SEQ ID NO107Pf3.9I N V D P N A N P N A N P N A N PAATTAACGTGGATCCAAATGCCAACCCTAACGCTAATCCAAACGCCAACCCGATTGCACCTAGGTTTACGGTTGGGATTGCGATTAGGTTTGCGGTTGGGCTN V D P N A E LSEQ ID NO108ATGTTGACCCTAATGCTGAGCTSEQ ID NO109TACAACTGGGATTACGACSEQ ID NO110Pf3.10I D P N A N P N A N P N A N PAATTGATCCAAATGCCAACCCTAACGCTAATCCAAACGCCAACCCTAGGTTTACGGTTGGGATTGCGATTAGGTTTGCGGTTGG
N V E LSEQ ID NO111CGAATGTTGAGCT SEQ ID NO112GCTTACAAC SEQ ID NO113Pf3.11I D P N A N P N A N P N A N P N VAATTGATCCAAATGCCAACCCTAACGCTAATCCAAACGCCAACCCGAATGTTGCTAGGTTTACGGTTGGGATTGCGATTAGGTTTGCGGTTGGGCTTACAACD P E L SEQ ID NO114ACCCTGAGCT SEQ ID NO115TGGGAC SEQ ID NO116Pf3.12I D P N A N P N A N P N A N P N VAATTGATCCAAATGCCAACCCTAACGCTAATCCAAACGCCAACCCGAATGTTGCTAGGTTTACGGTTGGGATTGCGATTAGGTTTGCGGTTGGGCTTACAACD P N A E L SEQ ID NO117ACCCTAATGCCGAGCT SEQ ID NO118TGGGATTACGGC SEQ ID NO119F.恶性疟原虫通用T细胞表位Pf-UTC(PF/CS326-345)I E Y L N K I Q N S L S T E W S P
AATTGAATATCTGAACAAAATCCAGAACTCTCTGTCCACCGAATGGTCTCCGTCTTATAGACTTGTTTTAGGTCTTGAGAGACAGGTGGCTTACCAGAGGCAC S V T # # SEQ ID NO120GCTCCGTTACCTAGTA SEQ ID NO121CGAGGCAATGGATCATTCGASEQ ID NO122间日疟原虫CS重复B细胞表位Pv-T1AI P A G D R A D G Q P A G D R A AAATTCCGGCTGGTGACCGTGCAGATGGCCAGCCAGCGGGTGACCGCGCTGCAGGGCCGACCACTGGCACGTCTACCGGTCGGTCGCCCACTGGCGCGACGTCG Q P A G E L SEQ ID NO123GCCAGCCGGCTGGCGAGCT SEQ ID NO124CGGTCGGCCGACCGC SEQ ID NO125Pv-T1BI D R A A G Q P A G D R A D G Q PAATTGACAGAGCAGCCGGACAACCAGCAGGCGATCGAGCAGACGGACAGCCCGCTGTCTCGTCGGCCTGTTGGTCGTCCGCTAGCTCGTCTGCCTGTCGGGCA G E L SEQ ID NO126CAGGGGAGCT SEQ ID NO127GTCCCC SEQ ID NO128Pv-T2AI A N G A G N Q P G A N G A G D QAATTGCGAACGGCGCCGGTAATCAGCCGGGGGCAAACGGCGCGGGTGATCAACCGCTTGCCGCGGCCATTAGTCGGCCCCCGTTTGCCGCGCCCACTAGTTG
P G E L SEQ ID NO129CAGGGGAGCT SEQ ID NO130GTCCCC SEQ ID NO131Pv-T2BI A N G A D N Q P G A N G A D D QAATTGCGAACGGCGCCGATAATCAGCCGGGTGCAAACGGGGCGGATGACCAACCGCTTGCCGCGGCTATTAGTCGGCCCACGTTTGCCCCGCCTACTGGTTGP G E L SEQ ID NO132CAGGCGAGCT SEQ ID NO133GTCCGC SEQ ID NO134Pv-T2CI A N G A G N Q P G A N G A G D QAATTGCGAACGGCGCCGGTAATCAGCCGGGAGCAAACGGCGCGGGGGATCAACCGCTTGCCGCGGCCATTAGTCGGCCCTCGTTTGCCGCGCCCCCTAGTTGP G A N G A D N Q P G A N G A D DCAGGCGCCAATGGTGCAGACAACCAGCCTGGGGCGAATGGAGCCGATGACCGTCCGCGGTTACCACGTCTGTTGGTCGGACCCCGCTTACCTCGGCTACTGGQ P G E L SEQ ID NO135AACCCGGCGAGCT SEQ ID NO136TTGGGCCGC SEQ ID NO137
PV-T3I A P G A N Q E G G A A A P G A NAATTGCGCCGGGCGCCAACCAGGAAGGTGGGGCTGCAGCGCCAGGAGCCAATCCGCGGCCCGCGGTTGGTCCTTCCACCCCGACGTCGCGGTCCTCGGTTAGQ E G G A A E LSEQ ID NO138AAGAAGGCGGTGCAGCGGAGCTSEQ ID NO139TTCTTCCGCCACGTCGCCSEQ ID NO140实施例2间日疟原虫通用T细胞表位Pv-UTCI E Y L D K V R A T V G T E W T PAATTGAATATCTGGATAAAGTGCGTGCGACCGTTGGCACGGAATGGACTCCGTCTTATAGACCTATTTCACGCACGCTGGCAACCGTGCCTTACCTGAGGCAC S V T # # SEQ ID NO141GCAGCGTGACCTAATA SEQ ID NO142CGTCGCACTGGATTATTCGASEQ ID NO143A.用于定点诱变的PCR引物Pf-CS(C17A)-R SEQ ID NO144# # T V S A P S W E T SGCCAAGCTTACTAGGTAACGGAGGCCGGAGACCATTCGGTGGHindIII SEQ ID NO145B.用于截短和在C-末端添加半胱氨酸的PCR引物为了通过添加半胱氨酸残基改变HBc基因的长度而修饰HBc嵌合基因的C-末端，用HBc 149作模板，使用能指导需要的C-末端修饰的HBc/NcoI-F引物和反向引物(例如HBc149+C/HindIII-R)进行PCR反应。用NcoI和HindIII消化PCR产物，并且克隆到pKK223-3N的相同限制位点上。
HBc149/NcoI-FSEQ ID NO245M D I D P Y5′-TTGGGCCATGGACATCGACCCTTA SEQ ID NO67HBc149+C/HindIII-R SEQ ID NO147# C V V T T E P L5′-CGCAAGCTTACTAGCAAACAACAGTAGTCTCCGGAAGHindIII SEQ ID NO148HBc144/HindIII-R SEQ ID NO149# P L T S L I PCGCAAGCTTACGGAAGTGTTGATAGGATAGGG SEQ ID NO150HBc142/HindIII-R SEQ ID NO151# T S L I P A N PCGCAAGCTTATGTTGATAGGATAGGGGCATTTGG SEQ ID NO152
HBc140/HindIII-R SEQ ID NO153# L I P A N P PCGCAAGCTTATAGGATAGGGGCATTTGGTGG SEQ ID NO154HBc139/HindIII-R SEQ ID NO155# I P A N P PGCGAAGCTTAGATAGGGGCATTTGGTGG SEQ ID NO156HBc138/HindIII-R SEQ ID NO157# P A N P P RCGCAAGCTTAAGGGGCATTTGGTGGTCT SEQ ID NO158HBc138+C/HindIII-R SEQ ID NO159# C P A N P P RGCGAAGCTTAGCAAGGGGCATTTGGTGGTCT SEQ ID NO160HBc137/HindIII-R SEQ ID NO161# A N P P R Y AGCGAAGCTTAGGCATTTGGTGGTCTATAGCSEQ ID NO162HBc137+C/HindIII-R SEQ ID NO163# C A N P P R Y AGCGAAGCTTAGCAGGCATTTGGTGGTCTATAA SEQ ID NO164HBc136/HindIII-R SEQ ID NO165# N P P R Y A PCGCAAGCTTAATTTGGTGGTCTATAAGCTGG SEQ ID NO166实施例3测定方法A.抗原性1.颗粒ELISA用包被缓冲液(50mM碳酸氢钠，pH 9.6)将纯化的颗粒稀释到10μg/mL的浓度，并且涂敷到ELISA条的孔上(50μL/孔)。在室温下将所述ELISA条培养一夜(大约18小时)。第二天上午用ELISA洗涤缓冲液[磷酸缓冲的盐溶液(PBS)，pH 7.4，0.05％Tween-20]洗涤所述孔，并且用溶解在PBS中的3％BSA封闭1小时(75μL/孔)。干燥ELISA条，并且在-20℃下保存待用。
为了测定颗粒的抗原性，用溶解在PBS中的1％BSA稀释抗血清，并且以50微升/孔的用量添加到抗原包被的ELISA孔中。培养血清1小时，用ELISA洗涤缓冲液洗涤，并且用抗小鼠(IgG)-HRP(The BindingSite，San Diego，CA；HRP＝辣根过氧化物酶)偶联物(50μL/孔)或其他合适的抗体检测30分钟。在用ELISA洗涤缓冲液洗涤之后，通过添加TM兰底物(50μL/孔)观察所述反应。10分钟之后，通过添加1N H2SO4(100μL/孔)终止该反应，并且在设定为450nm的波长下在ELISA平板读数器上读数。
2.合成肽ELISA用包被缓冲液(50mM碳酸氢钠，pH 9.6)将具有20个氨基酸残基的合成肽(NANP)5稀释到2微克/毫升的浓度，并且涂敷到ELISA条的孔上(50μL/孔)。通过在通风厨排风状态下将培养过夜的肽干燥在所述孔上(大约18小时)。第二天上午，用ELISA洗涤缓冲液(磷酸缓冲的盐溶液，pH 7.4，0.05％Tween-20)洗涤所述孔，并且用溶解在PBS中的3％BSA封闭(75μL/孔)1小时。干燥ELISA条，并且在-20℃下保存待用。
为了测定颗粒的抗体抗原性，用溶解在PBS中的1％BSA稀释抗血清(单克隆或多克隆抗血清)，并且以50μL/孔的用量添加到抗原包被的ELISA孔中。培养血清1小时，用ELISA洗涤缓冲液洗涤，并且用抗小鼠(IgG)-HRP偶联物(与前面相同，用量为50μL/孔)或其他合适的抗体检测30分钟，再次用ELISA洗涤缓冲液洗涤之后，然后通过添加TM兰底物(50μL/孔)观察。10分钟之后，通过添加1N H2SO4(100μL/孔)终止该反应，并且在设定为450nm的波长下用ELISA平板读数器读数。
B.颗粒的免疫原性为了测定颗粒的免疫原性，通过用溶解在弗氏完全佐剂中的20微克颗粒通过IP对小鼠进行免疫接种，并且在第4周用溶解在弗氏不完全佐剂中的10微克颗粒进行加强接种。在2，4，6和8周大时对小鼠放血。
C.子孢子IFA用戊二醛固定的恶性疟原虫子孢子和FITC-标记的抗小鼠IgG(γ-链特异性)(Kirkegaard和Perry，Gaithersburg，MD)进行间接免疫荧光测定(IFA)，以便检测结合的抗体[Munesinghe et al.，Eur.J.Immunol.1991，21，3015-3020]。所使用的子孢子是从疟蚊的唾液腺上解剖的，疟蚊通过在来自体外培养物的恶性疟原虫(NF54分离物)配子母细胞上采食而受到感染。
实施例4重组嵌合体HBc颗粒的表达A.插入位置对免疫原性的影响测定用含有插入氨基酸E77/D78(SEQ ID NOs260和261)或D78/P79(SEQ ID NOs259和260)之间的恶性疟原虫-CS B细胞表位(NANP)4的HBc颗粒免疫的小鼠的抗体效价(1/相互稀释)，或通过使用环取代方法(CS-2)[披露于Schodel等，(1994)J.Exp.Med.，1801037-1046，使用完全弗氏佐剂]。使用上述佐剂用20微克的单一剂量免疫接种小鼠，用固定化(NANP)5合成肽通过ELISA测定抗体效价。所述研究的结果如下面的表1所示。
表1

*Schodel et al.，(1994)J.Exp.Med.，1801037-1046。
用BALB/c小鼠对NANP CS-重复表位的插入位置对免疫原性的影响进行另一种比较。将用Schodel等的CS-2颗粒诱导的抗体效价与使用插入HBc78和79号位置之间的相同的(NANP)4B细胞表位以及使用上述V2.Pf1颗粒作为免疫原获得的效价进行比较。在初次接种之后4周(1°)和加强接种之后2周(2°)分析血清，并且分析结果在下面的表2中示出。
表2

*Schodel et al.，(1994)J.Exp.Med.，1801037-1046用B10.S小鼠对NANP CS-重复表位的插入位置对免疫原性的影响作了类似的比较，结果如表3所示。
表3

*Schodel et al.，(1994)J.Exp.Med.，1801037-1046检查了包括次要B细胞表位NANPNVDP(SEQ ID NO167)和重复的NANP序列的HBc嵌合颗粒(ELISA，F1小鼠)的免疫原性的效果。表达一种HBc嵌合体，该嵌合体包括插入HBc78和79号位置之间的序列NANPNVDP(NANP)3NVDP(SEQ ID NO21；V12.Pf3)。将所得到的ELISA数据与用位于相同位点(V12.Pf1)上的四聚体重复(NANP)4B细胞表位或二聚体次要B细胞表位(V12.Pf7)获得的效价进行比较。上述三种嵌合体中的每一种包括一个结构域IV，该结构域包括从141到149号位置的HBc序列，该序列作为C-末端序列键合在恶性疟原虫通用T细胞表位上。在下面的表4中示出了使用上述初次和加强免疫并且使用佐剂进行研究的结果。
表4

所观察到的通过包括‘次要’重复表位而观察到的免疫原性20倍以上的提高是相当出人意料的，因为大肠杆菌不能很好地表达V12.Pf3，构建了Pf3表位的变体NANPNVDP(NANP)3NVDP(SEQ ID NO21)，该变体具有与Pf3类似的抗原性，但是具有较高的表达水平，如下文所述。只测定了结构3.1和3.2的免疫原性。
在下面的表5中示出了重组嵌合体HBc/恶性疟原虫颗粒的相对表达水平和对CS表位(NANP)4和(NANPNVDP)特异的单克隆抗体的抗原性。相对表达水平如下****＝75-125mg/L；***＝50-75mg/L；**＝25-50mg/L。免疫原性是通过对有关单克隆抗体[对于(NANP)4来说使用MoAb2A10；对于NANPNVDP来说使用MoAb 2B6D8，以及由纽约大学医学中心的E.Nardin提供的间日疟原虫Rpt.MoAb 2F2]抗原性是通过终点滴定稀释测定的。将有关数据统一化，以便将最低的效价表示为1。例如，对于(NANP)4-特异性单克隆抗体来说，V12.Pf3的免疫原性比V12.Pf3.10的免疫原性高165倍，而对于NANPNVDP-特异性单克隆抗体来说，比V12.Pf3.2高26倍。N.D.＝无可检测的抗体结合。[注由于表达载体上的一个突变V12.Pf3.7不能表达；不再对它作进一步的检查，因为类似的构建体没有抗原性，并且因此再克隆不值得去做的事情。
表5

按上述方法测定含有Pf3表位变体的特定HBc嵌合体颗粒的免疫原性。在初次免疫之后4天(1°)和加强免疫之后4周(2°)通过ELISA分析血清。所获得的数据在下面的表6中示出，其中，嵌合体的“名称”和相应的B细胞免疫原的序列如上文所述。
表6

令人吃惊的是，尽管对于NANP单克隆抗体来说免疫原性低5倍，含有一个拷贝的NANPNVDP重复的形式(V12.Pf3.1)与含有2个拷贝的形式(V12.Pf3)的免疫原性相同(并且表达的更好)。
B.表达失败业已试图将若干其他的表位插入HBc环(结构域II)上的78和79号位置之间(如V2.Pf1中)，并且由于尚未了解的原因而没能够表达。在下面的表7中列举了当插入HBc嵌合体上的D78和P79(V2)之间时不能表达的表位。
表7


实施例5测定280/260吸光度比例用磷酸缓冲的盐溶液(PBS)，pH 7.4将蛋白样品稀释到浓度为0.1-0.3mg/mL。用PBS对分光光度计进行空白测定，并且在260nm和280nm的波长下测定蛋白样品的吸光度比。然后用在280nm波长下测定的一种样品的吸光度值除以在260nm波长下用相同的样品测定的吸光度值，以便获得特定样品的280/260吸光度比例。在下面的表8中示出了用若干种样品获得的吸光度比例，包括天然颗粒(HBc183)、在149号残基位置之后截短的HBc颗粒(HBc 149)、以及在本文的其他部分鉴定的若干种HBc嵌合体。
表8

实施例6位于截短的HBc颗粒C-末端的半胱氨酸A.在杂交HBc颗粒的C-末端添加一个半胱氨酸残基通过聚合酶链式反应(PCR)，可以将表达杂交HBc颗粒的基因方便地诱变成将一个半胱氨酸或含有半胱氨酸的肽导入HBc的C-末端。例如，可以将SEQ ID NO148的PCR寡核苷酸引物与第二种合适的引物一起用于扩增杂合的HBc基因，并且将一个半胱氨酸密码子整合在密码子V149和终止密码子之间。
可以截短乙型肝炎核心颗粒从183(或185，取决于病毒亚型)到140的部分，并且保留组装成颗粒状病毒样颗粒的能力。很多研究小组都使用了截短至149号氨基酸的颗粒，因为150号氨基酸代表富含精氨酸的C-末端结构域的第一个精氨酸残基。
为了评估单个半胱氨酸残基稳定HBc颗粒的能力，使用上述技术将编码半胱氨酸残基的密码子插入编码HBc氨基酸残基V149的密码子和嵌合HBc分子的终止密码子之间，该嵌合分子包括插入78和79号残基之间的(NANP)4疟疾B细胞表位(本文称之为V2.Pf1)，以便形成所述嵌合分子和被称为V2.Pf1+C(HBc149C)的颗粒。如图3所示，发现这种嵌合颗粒(V2.Pf1+C；SEQ ID NOs264和265)的热稳定性(在37℃)与缺乏所述插入的半胱氨酸的类似的嵌合颗粒(V2.Pf1)相比明显提高。
应当指出的是，通过在V2构建体的C-末端添加半胱氨酸而制备的载体和表达产物在本文中有时被称为V16载体或表达产物。
从图3中可以方便地看出，这两种颗粒的出发点类似。不过，在37℃下经过14天之后，含有半胱氨酸的颗粒在SDS凝胶上表现出较少的带，表明与缺乏所添加的Cys残基的颗粒相比具有较高的稳定性。
C.热稳定性方法用50mM NaPO4，pH 6.8将纯化的颗粒稀释到1mg/mL的浓度，并且添加最终浓度为0.02％的叠氮化钠，以便抑制细菌生长。在37℃下培养颗粒，并且在附图中所示出的时间点上采集等份样品。将样品SDS-PAGE样品缓冲液(还原性)混合，并且在15％SDS-PAGE凝胶上电泳。用考马斯兰对凝胶进行染色，然后分析。
实施例7位于与HBc的C-末端融合的一种肽的C-末端的半胱氨酸为了进一步研究末端半胱氨酸残基是否能在除了150号位置以外的位置上诱导稳定化作用，将来自乙型肝炎核心蛋白的Th表位(74-87号氨基酸残基)融合到在其免疫优势环含疟疾表位的HBc的C-末端。所述Th表位不包括半胱氨酸残基，因此将一个Cys残基添加在其C-末端(加下划线的″C″)。对照是缺乏半胱氨酸的相同的表位。通过将V2.Pf1与V7.HBc74-87(和V7.HBc74-87+C)结合制备所述颗粒。用HBc-P79/SacI-F引物(SEQ ID NO76)和pKK223-2/4515-32-R(SEQ IDNO77)对V7构建体进行PCR扩增。用SacI和HindIII裂解扩增产物，并且将SacI/HindIII片段连接到用相同的酶裂解过的V2.Pf1上。
下面的表9中示出了C-末端融合的HBc(74-87)和HBc(74-87)+C，相对存在于野生型HBc蛋白中的天然序列以及HBc149+C颗粒的氨基酸序列。″Cys偏移″是所导入的半胱氨酸相对其在野生型蛋白中的位置，其中，它是最后一个残基(183号位置)。
表9

实施例8位于和HBc杂交体的C-末端融合的肽中的半胱氨酸为了确定HBc基因的最终的氨基酸是否绝对需要半胱氨酸残基(正如在野生型HBc中的情况)或半胱氨酸是否能在导入的C-末端序列内部起作用，进行了有关研究。
将来自疟疾寄生虫Plasmodium falciparum的CS蛋白的相当于具有20个残基的通用T细胞表位的肽融合在HBC嵌合体(V2.Pf1；SEQID NOs266和267)的C-末端，所述肽含有位于这种肽的17号位置上的或位于所述CS蛋白的342号位置的半胱氨酸[Calvo-Calle etal.，J.Immunol.，(1997)159(3)p.1362-1373]。这种嵌合体包括从1号位置到149号位置的HBc序列，所述恶性疟原虫B细胞表位(NANP)4插在78号和19号氨基酸残基之间。因此，这种HBc构建体的结构域I包括1-75号残基；结构域II包括76-85号残基，(NANP)4表位插在78-79号残基之间(具有构成有关限制位点的4个残基)；结构域III包括86-135号残基；而结构域IV包括136-149号残基，加上具有20个残基的恶性疟原虫T细胞表位，以及来自EcoRI克隆位点的两个残基(GI)。
这种融合的C-末端肽长度为20个氨基酸残基(根据病毒亚型比野生型序列短12个或14个氨基酸)，并且推测的pI值比野生型序列低8个pH单位以上。为了减少可能由除了半胱氨酸之外的其他氨基酸所产生的潜在的稳定化作用，制备了一种(类似的)对照构建体，该结构在17号位置上具有取代半胱氨酸的丙氨酸(参见下面的表10)。
为了简化对该序列稳定化作用的评估，将所述肽与事先业已证实能在37℃下方便地降解的颗粒(V2.Pf1)的C-末端融合，以便形成分别被命名为V2.Pf1+Pf/CS-UTC和V2.Pf1+Pf/CS-UTC(C17A)的HBc嵌合体。在图4中示出了为期28天的热稳定性研究的结果(如上文所述)。
本研究的结果表明，在上述时间的研究中，半胱氨酸在源于恶性疟原虫蛋白的T细胞表位中的存在是颗粒稳定性所必须的，并且不是绝对需要该半胱氨酸位于所述表位的C-末端。下面的表格表示具有位于17号位置的半胱氨酸或丙氨酸的C-末端融合体的氨基酸序列，同时对照示出了存在于野生型HBc蛋白中的天然序列。
表10

(GI)＝从克隆的位点开始添加的残基。
实施例9间日疟原虫HBc嵌合体在上述用含有恶性疟原虫B细胞和T细胞免疫原的HBc进行的研究之后，用来自间日疟原虫CS蛋白的序列进行了类似研究。代表性构建体在下面的表11中示出。
表11

为了研究所述重复的变异性，将以下变体表位插入HBc的78和79号氨基酸位置之间。
1.I型CS-重复PAGDRADGQPAGDRAAGQPAG(间日疟原虫-1A型)--SEQ ID NO197。这种形式的表位不能产生颗粒。
DRAAGQPAGDRADGQPAG(间日疟原虫-1B型)--SEQ ID NO198.这种形式的表位含有侧翼二肽克隆位点残迹，它能成功地产生颗粒，并且被称为V2.PV-TIB。业已成功地克隆、表达纯化了间日疟原虫-I型免疫原，并且在小鼠体内实验了其免疫原性。
所述小鼠研究的结果在下文的表12中示出。
2.II型CS-重复对于II型重复来说，由于存在四种不同形式的II型表位，使得该研究复杂化。以上形式在5号位置上包括G或D，而在6号位置上包括N或D[Qariet al.，Mol.Bi℃hem.Parasitol.，(1992)55(1-2)p.105-113]。因此，为了增加成功的可能性，需要四种不同的可能的重复序列(GN，GD，DN，和DD)。第一位并且优选的方法是制备含有所有四种重复的单一杂交颗粒，如下面的下划线所示。该方法被成功地用于研究I型重复的可波动性。
上述每一种构建体包括侧翼二肽克隆位点残迹。ANGAGNQPGANGAGDQPGANGADNQPGANGADDQPG(间日疟原虫-II型-GN/GD/DN/DD) SEQ ID NO199.
业已作为HBc嵌合体克隆、表达并纯化了上述序列，没有对C-末端进行修饰。
第二种方法是制备两种杂交颗粒，使每一种颗粒包括两种变体表位(见下文)。该方法不太理想，因为在表达期间它需要用一种更复杂的表达系统指导‘混合的’颗粒的生产，或者需要在生产之后混合II型颗粒。
ANGAGNQPGANGAGDQPG(间日疟原虫-II型-GN/GD)SEQ ID NO200.
QANGADNQPGANGADDQPG(间日疟原虫-II型-DN/DD)SEQ ID NO201.
CGCGAATTCAAGCGAACGGCGCCGATAATCAGCCGGCGGGTGCA(间日疟原虫-II型B-ER1-wt-F) SEQ ID NO146.
3.III型(′间日疟原虫-样′)CS-重复与另外两种表位明显不同的第三种间日疟原虫CS-表位与氨基酸变异无关(见下文)[Qari et al.，Lancet，1993.341(8848)p.780-783]。将该序列克隆到HBc表达系统中，并且生产含有侧翼二肽克隆位点残迹的杂合体。
APGANQEGGAAAPGANQEGGAA(间日疟原虫-III型)SEQ ID NO202.
4.位于HBc C-末端的T细胞表位同样用合成的DNA片段(Synthetic Genetics，San Diego CA)将间日疟原虫Th表位(Pv-UTC；YLDKVRATVGTEWTPCSVT；SEQ ID NO196)插入HBc和HBc杂交体中。不过，与插入HBc基因的免疫优势环区的B细胞表位不同，T细胞表位与HBc基因的C-末端融合。使用上述克隆载体将B和Th表位插入HBc。同样成功地制备了只能表达位于C-末端的Pv-UTC的颗粒。
5.将B和T细胞表位组合在单一颗粒中为了将B和Th表位组合在单一的HBc结构上，通过PCR扩增N-末端HBc片段(AA 1-80，它包括B细胞表位)以及C末端片段(AA 81-150，它包括T细胞表位)。将所述片段连接在一起，并且再次通过PCR扩增，并且同样，通过限制性内切核酸酶作图和自动DNA序列分析(LarkTechnologies，Houston TX)验证克隆。有关细节大体上与恶性疟原虫相同。业已表达并回收了分别含有I型、II型和III型B细胞表位和变体，以及Pv-UTC的颗粒。
实施例10HBc嵌合体的相对免疫原性通过上文所述的IFA在小鼠体内比较若干种HBc嵌合免疫原的相对免疫原性。在下面的表12中示出了使用上文所述的两种剂量的免疫方案进行研究的结果。
表12
从以上数据可以看出，用嵌合免疫原获得了恶性疟原虫的105-106的效价；与之对应是的，使用Schodel等的转换技术仅获得了贝氏疟原虫的104和恶性疟原虫的103的效价。在第0天，使用20微克的CS-2或V12.Pf1的颗粒对小鼠进行免疫接种，并且在第4周用10微克的颗粒加强接种。在第0天用20微克的V12.Pf3和V12.Pf3.1颗粒对小鼠进行免疫接种，并且在第8周用10微克的颗粒加强接种，按上文所述使用佐剂。在图5中示出了表示所达到的效价的持续时间的数据，使用V12.Pf3颗粒获得的数据基本上与使用V12.Pf3.1颗粒所获得的数据相同，在图中没有示出。
实施例11相对HBc免疫原性为了测定与天然HBcAg(颗粒)相比若干种疟疾HBc嵌合颗粒对两种单克隆抗体(MoAb-3120和MoAb-3105)的相对免疫原性进行了一系列研究。所述抗体对HBc的环区具有特异性，并且是日本东京的免疫学研究所的珍贵礼品。研究是使用表5所示的嵌合体作抗原进行ELISA测定，使用单克隆抗体作探针进行的，所述嵌合体包括插HBc颗粒的各种位点的疟疾表位。以上研究的结果(终点稀释)在下面的表13A、13B和13C中示出，并且表明相关的嵌合体基本上缺乏对单克隆抗体的抗原性，所述单克隆抗体能结合所述环区，即HBc的主要免疫原。能特异性结合HBc环区的单克隆抗体很少能识别相关的嵌合体(如果还能识别的话)。
表13A

表13B

插入免疫优势环中的若干位点(包括77-78或78-79号位置能完全消除MoAb-3105的结合。V13是位于129和130号残基之间的插入，并且被用作对照，因为在该构建体中天然HBc免疫优势环保持完整。
表13C

以上数据表明，与78和79号残基之间插入相比，78和79号之间的插入会导致抗-MoAb-3120结合的更明显的减弱。
实施例12构建修饰过的乙型肝炎核心蛋白表达载体通过定点诱变将一个赖氨酸密码子(AAA)连同SacI(GAGCTC)限制性内切核酸酶位点一起导入HBc基因的氨基酸E77和E78之间，以便遗传插入编码生产含有接头基团的HBc颗粒的其他密码子。因此，所述插入片段的氨基酸残基序列为KEL，其中，EL是SacI位点的人工构造物。因此，所述含有接头基团的HBc蛋白的长度为152个氨基酸残基。下面披露pKK223-3-HBc152-K78表达质粒的构建。
用寡核苷酸引物P1F(SEQ ID NO203)和P1R(SEQ ID NO204，位于互补链上)扩增HBc基因的5’末端(1-234碱基，1-77号氨基酸)，并且同时在其5’末端整合一个限制位点(CCATGG)，并且同时在扩增产物的3’末端整合一个SacI限制位点(GAGCTC)，并且在SacI位点前面整合一个赖氨酸密码子(从A)。将寡核苷酸引物P2F(SEQ ID NO205)和P2R(SEQ ID NO206，在互补链上)用于扩增HBc基因的3’末端(235-450号碱基，78-149号氨基酸)，并且同时在扩增产物的5’末端整合一个SacI限制位点(GAGCTC)，在3’末端整合一个HindIII限制位点(AAGCTT)。
用SacI裂解以上两种PCR产物(编码1-77号氨基酸和78-149号氨基酸)，将其共同的SacI突出端连接在一起，用NcoI和HindIII裂解，并且用标准技术克隆到表达质粒pKK223-3(Pharmacia)上，所得到的质粒被称为pKK223-3-HBc152-K78。
该质粒可用于表达在其免疫优势环中具有一个作为接头基团的赖氨酸的HBc嵌合体。所表达的HBc嵌合体能自动形成颗粒。因此，本实施例的含有所述接头基团的HBc具有一个相当于SEQ ID NO247的HBc的77号位置的插入片段，一个位于相当于SEQ ID NO247的HBc的77号位置的位置上的化学反应性赖氨酸接头残基，并且在相当于SEQ ID NO247的HBc的149号位置上截短。
可以使用例11所披露的PCR技术以及上文所述的制备方法制备编码上述嵌合体并且还包括一个C-末端半胱氨酸残基的质粒。含有C-末端Cys残基和连接残基的Cys嵌合颗粒能与通过按照本文所披露的方法表达所述质粒而产生的免疫原性半抗原偶联。
引物P1FTTGGGCCATGGACATCGACCCTTA SEQ ID NO203引物P1RGCGGAGCTCTTTTTCCAAATTAACACCCAC SEQ ID NO204引物P2FCGCGAGCTCGATCCAGCGTCTAGAGAGACC SEQ ID NO205引物P2RCGCAAGCTTAAACAACAGTAGTCTCCGGAAGSEQ ID NO206实施例13纯化修饰的乙型肝炎核心颗粒在大肠杆菌中表达例12中的含有嵌合接头基团的HBc颗粒，所述大肠杆菌通常是购自Novagen(Madison，Wisconsin)的大肠杆菌BLR或BL21，或购自Amersham(Arlington Heights，Illinois)的大肠杆菌TB1。转染过的大肠杆菌[被称为HBc152-K78]能表达质粒pKK223-3-HBc152-K78。使用业已建立的方法通过SepharoseCL-4B-(Pharmacia)层析纯化含有嵌合体接头的HBc颗粒[HBc152(K78)颗粒]。
在用于所述嵌合分子或颗粒的命名系统中，“HBc”表示乙型肝炎核心蛋白序列；“152”表示存在于所述嵌合体中的氨基酸残基的数量，该嵌合体具有添加在SacI位点上的HBc149序列的赖氨酸和两个限制位点残基(谷氨酸和亮氨酸；EL)；而″(K79)″表示赖氨酸(K)作为一个新的79号残基添加在所述序列的78号残基后面。在下文披露的包括一个作为该分子的C-末端残基的半胱氨酸残基的嵌合分子和颗粒被称为″+C″。
由于颗粒纯化是以可预测的方式进行的，通过用简单的分光光度法(OD280)监测颗粒洗脱，同时进行SDS-PAGE分析，以便在合并之前评估单个级份的纯度，这样做就足以以高的产量(5-120mg/L细胞培养物)通过常规方法纯化在电泳上纯的颗粒。纯的含有嵌合接头基团的HBc颗粒的球形结构在电子显微照片上清晰可见。
实施例14将合成的肽作为激活的载体与含有嵌合接头基团的HBc颗粒化学连接测定来自例13的表达质粒pKK223-3-HBc152(K78)的含有嵌合接头基团的产物的化学反应性，与类似表达的纯化的“野生型”截短的乙型肝炎核心颗粒(HBc149)进行比较，这种颗粒与HBc152(K78)相同，所不同的是，它缺少所导入的赖氨酸残基接头基团以及侧翼的5个氨基酸。
使用琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷1-羧酸酯(SMCC)，一种水溶性异双功能交联剂将合成的肽(半抗原)化学偶联到含有嵌合接头基团的HBc颗粒上，以便形成激活的载体。SMCC能与巯基和伯氨基起反应，使得合成的肽随后能偶联到所述激活的载体(HBc嵌合颗粒，其伯氨基基团事先业已被SMCC修饰过)上。另外，由SMCC所提供的.Further，the 11.6的间隔臂有助于降低半抗原和HBc载体之间的位阻，从而具有更高的结合效力。
简单地讲，在室温下，在50mM磷酸钠pH 7.5中，让HBc152(K78)和HBc149颗粒分别与超过所有氨基(天然氨基或天然氨基加上来自插入片段的赖氨酸残基的氨基)5倍的SMCC起2反应，以便形成马来酰亚胺激活的HBc颗粒。通过反复用50mM磷酸钠，pH 6.8透析除去未反应的SMCC。HBc颗粒的SMCC衍生化导致了很小的分子量增加，这种增加通过SDS-PAGE无法检测到。不过，PAGE分析的确证实了在所述肽偶联步骤之前HBc蛋白的完整性。
对作为激活载体与嵌合HBc颗粒偶联的合成肽进行设计，以便它们具有N-末端半胱氨酸残基，该半胱氨酸残基能够通过该半抗原的半胱氨酸巯基将肽半抗原定向偶联到所导入的赖氨酸侧链的伯胺上。
表14表示源于人细胞色素P450酶的合成肽，将这种合成肽化学偶联到HBc颗粒激活的载体上，以便形成含有悬垂连接的细胞色素P450决定簇半抗原的HBc嵌合颗粒偶联物***，或者更简单地讲形成HBc嵌合体颗粒偶联物。然后将合成的肽滴加到超过总氨基5倍的马来酰亚胺激活的战略性修饰的HBc152(K78)颗粒中，并让它们在室温下反应2小时。让马来酰亚胺激活的HBc149颗粒与作为对照的两种2D6肽(2D6和2D6-C)起反应。
表14细胞色素P450半抗原

实施例15分析嵌合HBc颗粒偶联物通过SDS-PAGE和免疫印迹分析例14的含有与细胞色素P450决定簇悬垂连接的HBc嵌合颗粒偶联物，确定合成的肽是否业已成功地与HBc偶联。电泳过程的变性条件，将颗粒解离成其组成亚基HBc单体。因为HBc单体的分子量大约为17,000Da，可以方便地分辨与1A1(289-302)、1A2(291-302)、2D6(263-277)或3A4(253-273)肽化学偶联的HBc152(K78)，因为所述肽的相对分子质量大约为2,000Da，并因此会导致HBc蛋白单体的分子量的可见的增加。
根据偶联的和非偶联的带在SDS-PAGE上的相对强度，确定大约50％的HBc152(K78)单体是与半抗原是共价连接的，而仅有5％的“野生型”HBc149颗粒与半抗原连接。在半抗原成功地与所述激活的载体悬垂连接中所观察到的显著增加支持以下结论，即所观察到的连接是通过插入的赖氨酸实现的，而不是通过同样存在于“野生型”中的赖氨酸残基出现的。
在SDS-PAGE中，与较短的C-末端P450-衍生的肽偶联的HBc颗粒(5-和6-聚体)的迁移率的变化不如较长的抑制肽的迁移率的变化明显，不过，在成功地连接的HBc152(K78)单体中可明显看出大约1kDa的迁移。与“野生型”HBc149颗粒相比，嵌合的HBc152(K78)蛋白表现出显著增强的半抗原悬垂连接的能力，野生型颗粒表现出少量的偶联。
在具有180或240个结合的核心蛋白单体的二十面体颗粒的推荐的核心颗粒的模型中[Conway et al.(1997)Nature，38691-94]]，所述核心单体的相对暴露的免疫优势环区的二聚体像狼牙棒上的刺突那样从组装的核心颗粒延伸进入溶液中。“刺突”是在空间上紧密排列在HBc颗粒上。所导入的赖氨酸残基在所述刺突顶端的策略性定位降低了对将半抗原连接在组装的核心颗粒上的反应的空间制约的倾向。
将最多50％的策略性修饰过的HBc单体成功地偶联在了细胞色素P450的合成的肽上。这一数量的悬垂连接相当于平均有一个半抗原连接在每一个核心蛋白二聚体上。所提出的这种半抗原与策略性修饰的HBc颗粒的连接的分配得到了在半变性条件下进行的PAGE结果的支持，在半变性条件下能解离所述颗粒，而又保持了二聚体的结合。
通过免疫印迹检验通过肽偶联制备的HBc-2D6颗粒，以便证实2D6多肽表位的存在。在用抗-HBc抗血清检测时，化学偶联的颗粒产生了两种不同的单体带，分别表示有和没有2D6多肽的单体。只有所述印迹的上部带具有抗-2D6抗血清，因此证实了迁移率偏移与2D6多肽结合之间的相关性。
实施例16策略性赖氨酸插入为了构建具有插入免疫优势、表面暴露的环区(75-85号氨基酸)的每一个位置上的赖氨酸残基的HBc颗粒，通过PCR扩增HBc基因的5′和3′片段，并且通过寡核苷酸引物导入单个赖氨酸密码子。所述寡核苷酸引物和所得到的氨基酸序列如SEQ ID NOs220-241所示。“野生型”序列是SEQ ID NOs218-219。所述HBc嵌合体的长度为150个残基，具有通过在每一种嵌合体和颗粒名称中用编码标明的位置上的添加的赖氨酸。
为了制备位于75-84号位置上的赖氨酸插入片段[HBc150(K75)至HBc150(K84)]，用能识别序列TTAA的限制性内切核酸酶MseI消化成对的PCR片段。通过将所述寡核苷酸引物(含有赖氨酸)连接在221-224号核苷酸的常见MseI限制位点上，恢复修饰过的基因。对于HBc-K85(SEQ ID NOs240-241)，有必要制备两种在共同的XhoI限制位点(CTCGAG)上连接的两种片段，该片段在野生型基因中是不存在的，但是可以导入239-244号位置，而又不改变任何氨基酸。
表15在免疫优势环中插入赖氨酸的HBc变体

为了纯化含有接头基团的HBc嵌合体，用45％的硫酸铵沉淀来自1升发酵液的澄清的细胞裂解物，并且用Sepharose(Pharmacia)CL-4B层析(2.5cm×100cm)对所得到的沉淀进行凝胶过滤。在用这种类型的柱进行分析时，颗粒HBc具有特有的洗脱位置，该位置与在所述颗粒上进行的氨基酸的插入无关。用这种方法分析了为本研究而制备的11种含有接头基团的HBc嵌合颗粒，并且在280nm的吸光度下通过分光光度法测定洗脱曲线。
用构建体[HBc150(K75)、HBc150(K77)，和HBc150(K79)]制备的三种含有接头基团的HBc嵌合颗粒的产量为50-100mg/L，这一产量水平与诸如HBc149颗粒的野生型未修饰过的HBc颗粒的典型产量相当。四种构建体[HBc150(K76)、HBc150(K78)，HBc150(K81)、和HBc150(K82)]的含有接头基团的HBc嵌合颗粒的生产水平较低(1-20mg/L)。最后，四种颗粒[HBc150(K80)、HBc150(K83)、HBc150(K84)和HBc150(K85)]的生产水平被认为几乎无法检测(低于1mg/L)。所述表达产物的产量在下面的表16中示出。
表16来自1升发酵液的纯化的含有赖氨酸的嵌合体HBc颗粒

如上文所述，编码上述嵌合体并且还包括一个C-末端半胱氨酸残基的质粒可以用上文所述或在例1I中所述的PCR技术制备，包括将一个半胱氨酸密码子插入仅靠终止密码子的上游，同时采用上文刚刚披露的制备方法。
实施例17与HIV序列的嵌合体制备重组嵌合体颗粒，其中，631-665号位置的HIV-1 gp41序列存在于HBc的78和79号残基之间。一种制剂包括一个C-末端半胱氨酸残基，而其他的制剂不含，并且其末端是HBc149号位置的缬氨酸(SEQID NOs270 and 271)。使用在例1B中披露的V2载体表达没有末端Cys的颗粒，而以Cys为末端的颗粒是按例1I所披露的方法制备的载体所表达的。以上构建体被分别称为V2.HIV11.1和V16.HIV11.1。在表示时的产量分别为1.6mg/L和12.4mg/L，由此表明了由以Cys为末端的蛋白组装的颗粒的产量提高了将近8倍。
在下面示出了HIV B细胞的表位，以及该表位的编码和互补DNA序列。HIV序列通常以C-末端EL残基为末端，并且始于所添加的N-末端GI残基。因此一共有2个添加的(异源)残基，这2个残基既不是来自HBc序列，也不是来自所插入的肽序列。
插入的B细胞表位序列GIQWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELSEQ ID NO242编码序列5’AATTTGGATGTGGGAAGATCGTGAGATCAACAATTATACCAGCCTGATACATTCTTTAATTGAAGAGTCCCAGAACCAACAGGAGAAAAATGAACAAGAGCTSEQ ID NO243互补序列5’CTTGTTCATTTTTCTCCTGTTGGTTCTGGGACTCTTCAATTAAAGAATGTATCAGGCTGGTATAATTGTTGATCTCACGATCTTCCCACATCCASEQ ID NO244实施例18比较性表达用上文所披露的能表达含有位于HBc的76和77号残基之间的赖氨酸(同时含有位于所添加的赖氨酸的任一侧的两个外源残基)的嵌合分子的HBc150(K77)载体和同样含有位于该蛋白的C-末端的Cys残基的类似载体进行类似的比较性表达研究。后一种载体是通过上文所讨论的技术制备的，使用包括一个编码位于Val-149和终止密码子之间的Cys的密码子的C-末端PCR引物。在成对的表达研究中，前一种载体能以55mg/L的产量表达颗粒，而后一种载体以60mg/L的产量表达颗粒。
实施例19制备C-末端截短的HBc嵌合基因和颗粒使用HBc-NcoI-fwd(如下文所示)和下面的每一种反向引物HBc138+139C-H3-rev，HBc139-H3-rev，和HBc140-H3-rev(如下文所示)扩增HBc基因，以便制备以下HBc基因HBc140，HBc139和HBc138+139C。用NcoI和HindIII裂解PCR产物，并且克隆到同两种相同的酶裂解制备的pKK223-3N上。然后将质粒转化到大肠杆菌菌株TB1中，并且在补充了8ml g/L葡萄糖和50μg/mL氨苄青霉素的500mLTB培养基中生长24小时。通过用SepharoseCL-4B大小柱(Pharmacia)分析粗制大肠杆菌制剂测定颗粒产量，以便将颗粒与特有的洗脱物质结合在一起。
因此，用弗氏压碎器将5克收获的细胞裂解在25mL的50mMTris-HCl缓冲液，pH 8.0，10mM EDTA中。通过在16,000rpm(JA-30.50Ti转子，Beckman)的速度下离心20分钟将裂解物沉积。通过硫酸铵(45％)使颗粒沉淀，并且通过以16,000rpm(JA-30.50Ti转子，Beckman)的速度离心20分钟将由此产生的沉淀物重新悬浮在5mL的50mM Tris-HCl，pH 8.0，10mm EDTA中，并且用20mm Tris-HCl，pH 8.0透析直到可溶。然后将该材料加样到Sepharose CL-4B层析柱(2.5×100cm)上，并且以1mL/分钟的流速洗脱500分钟，在此期间所有材料都被洗脱。在280nm的波长下监测颗粒的洗脱。
根据所述洗脱曲线，发现HBc140形成颗粒，而HBc139不能。通过在一种颗粒的139号位置上添加氨基酸也不能形成颗粒，如果不添加半胱氨酸残基，该颗粒以138号残基终止。用上文所示出的SEQ IDNos275，146，159，160，155，156，153和154的DNA构建载体。
实施例20用于制备供人类使用的HBc颗粒的载体的制备A.载体V17Pf3.1的制备为了以适合人类使用的方式生产颗粒V12.Pf3.1(SEQ ID NOs268和269)，必须使用不需要用氨苄青霉素确保质粒维持的表达系统表达所述颗粒。为了达到这一目的，将编码所述颗粒的基因连同所必需的上游调控插入用卡那霉素作为选择标记的新的质粒中。这种新的质粒(V17.Pf3.1)是用两步克隆方法合成的步骤1用限制酶BamHI和HindIII消化质粒pKK223-3N-V12，以便得到801bp和4869bp的两种DNA片段。另外，用BglII和HindIII裂解市售的质粒pREP4(Qiagen)，以便得到320bp和3420bp的两种片段。连接所述3420bp和801bp的片段，以便产生质粒V17(应当指出的是，BglII和BamHI消化过的DNAs能够通过其共有的‘突出端’序列连接，不过BglII或BamHI都不能裂解所得到的片段)。因此，V17质粒包括HBc149基因，补充与C-末端融合的Pf-UTC序列，以及位于免疫优势环区的EcoRI和SacI限制位点，以便能够将表位插入HBc基因的D78和P79之间。
步骤2第二个步骤是将Pf CS-重复表位的Pf3.1版本插入该基因的免疫优势环区。这一目的是通过用SacI和EcoRI消化V17以便得到15bp和4206bp的DNA片段而实现的。将退火的编码Pf3.1表位的寡核苷酸与4206bp的片段连接在一起，以便得到4275碱基对的质粒V17.Pf3.1。除了编码具有195个氨基酸的疟疾疫苗候选物的基因之外，该质粒还包括编码lac阻遏物(lac I)的基因，以便强制受lac启动子控制的所有基因都受到完全阻遏，直到用异丙基硫代半乳糖酐(IPTG)进行诱导。它还具有卡那霉素抗性基因，以便能够通过向培养基中添加卡那霉素进行阳性筛选。该质粒具有pACYC 184的复制起点，并且不被认为是高拷贝数的质粒。
感兴趣的基因的位置如下

适合V17.Pf3.1的宿主是大肠杆菌BLR，它是大肠杆菌BL21的recA衍生物，并且是用于生产重组蛋白的常用菌株(可以从Novagen购买)。选择大肠杆菌BLR作为表达的宿主生物，是因为它具有较高的遗传学稳定性，并且具有以可溶性形式(不存在于包含体中)生产组装的颗粒的能力。
B.用质粒V17.Pf3.1表达颗粒将含有V17.Pf3.1质粒的大肠杆菌(BLR菌株)划线接种到补充了25μg/mL卡那霉素和10μg/mL四环素的LB琼脂平板上，然后在37℃下培养16-20小时。然后用1个菌落接种装在无菌培养试管中的补充了25μg/mL卡那霉素的3mL的TB-Phy培养基中。在37℃下，在摇床上以大约200rpm的速度摇动培养该试管一夜(大约18小时)。
次日上午，将100mL的TB-Phy的培养基加热到37℃。取出1mL过夜培养物，并用于接种所述烧瓶，然后在37℃下在摇床上以大约200rpm摇晃培养该烧瓶6小时。
用100mL接种物接种发酵罐(BiostatTMUE20)，发酵罐的条件设定如下振荡速度 400rpm温度 37℃通气 空气，10升/分钟pH7.0，不进行控制测定第一份样品的A600值，并且随后每隔20-30分钟测定样品，以便监测A600。通过将62mg IPTG溶解在10-15mL水中制备IPTG溶液。当A600值达到0.5时，通过一个注射器将过滤消毒的IPTG溶液无菌操作地添加到所述发酵罐中。培养一直持续到第二天(例如，大约再培养10-24小时)。
在诱导14小时之后，将发酵罐的温度调到15℃。通过在BeckmanJ2-MC离心机中离心开始收获细胞，采用以下条件转子JA10速度7,500rpm温度4℃时间9分钟通过在液氮中冷冻收获所述细胞。
C.纯化由载体V17.Pf3.1/BLR表达的颗粒将收获细胞的生物物质重新悬浮在50mM磷酸钠，pH 6.8中，并且用弗氏压碎器以16,000psi的压力裂解细胞。通过用BeckmanJ2-MC离心机离心除去细胞碎片，采用以下条件。
转子 JA20速度 15,000rpm温度 4℃时间 30分钟测定所得到的上清液的体积，并且将277g/L的固体硫酸铵缓慢添加到该上清液中。在4℃下搅拌该混合物30分钟。在BeckmanJ2-MC离心机中对该溶液进行离心，采用以下条件。
转子 JA20速度 15,000rpm温度 4℃时间 30分钟然后将沉淀重新悬浮在少量50mM磷酸钠缓冲液中，然后用相同的缓冲液搅拌透析1小时。在BeckmanJ2-MC离心机中对透析溶液进行离心，采用以下条件。
转子 JA20速度 15,000rpm温度 4℃时间 15分钟回收上清液，并且进行凝胶过滤层析。
系统Pharmacia Biotech AKTATMExplorer缓冲液B(洗脱溶剂)50mM磷酸钠缓冲液(pH 6.8).
柱Millipore VantageTMVL44×1000柱(直径44mm，高度1000mm，产品目录号96441000)树脂1.51升SepharoseCL-4B，由Pharmacia生产检测仪波长为210、254和280nm的UV级份15mL用缓冲液B以2mL/分钟的速度洗脱所述柱。通过SDS-PAGE确定含有颗粒的级份，并且合并。通过添加氯化钠将合并材料的盐浓度调整到5M。
疏水作用层析系统PharmaciaBiotech AKTATMExplorer(系统号18111241 001152，依阿华大学ID No.540833.)缓冲液A50mM磷酸钠缓冲液(pH 6.8)+5M NaCl.(在使用之前，每天将该缓冲液脱气30分钟)缓冲液B(洗脱溶剂)50mM磷酸钠缓冲液(pH 6.8)(在使用之前，每天将该缓冲液脱气30分钟)用ToyoPearl醚650树脂进行疏水作用层析柱Millipore VantageTMVL44×250柱(直径44mm，高度250mm，产品目录号96440250)树脂200mL Toyopearl醚650 HIC树脂，由Tosohaas生产检测仪210，254，和280nm的UV级份15mL在开始纯化之前用5倍柱体积(CV)的缓冲液A平衡该柱1小时时间，使用20mL/分钟的流速。然后以20mL/分钟的流速将含有5M盐的保留物加样到柱上。用2CV的缓冲液A洗涤该柱，用2CV的10％缓冲液B洗涤该柱，用3CV的40％缓冲液B洗脱，并且用100％缓冲液B洗脱(最后洗脱)。通过SDS-PAGE分析全面分析级份中感兴趣的蛋白。将纯的级份合并在一起，并且通过Bradford测定估算蛋白含量。
用丁基树脂进行疏水作用层析柱Millipore VantageTMVL44×250柱(直径44mm，高度250mm，产品目录号Catalog No.96440250)树脂200mL Toyopearl丁基650-S HIC树脂，由Tosohaas生产检测仪210，254和280nm的UV级份15mL在开始纯化之前，用5倍柱体积(CV)的40％的缓冲液B平衡该柱1小时时间，流速为20mL/分钟。以20mL/分钟的速度对来自醚HIC的合并的级份进行加样。用2CV的40％的缓冲液B洗涤该柱，用2CV的90％B洗涤，并且用4CV WFI洗脱。
通过SDS PAGE分析分析级份中感兴趣的蛋白。将纯的级份合并在一起。
羟基磷灰石柱层析柱Millipore VantageTMVL16×250柱(直径16mm，高度250mm产品目录号96160250)树脂20ml陶瓷羟基磷灰石(产品目录号2200)检测仪215，254和280nm的UV级份15mL用5倍柱体积(CV)的20mM磷酸钠缓冲液平衡该柱，流速为5mL/分钟。将合并的级份进行加样，以5mL/分钟的速度从丁基HIC上洗脱。用20mM的磷酸钠缓冲液洗脱该柱，直到A280降低到本底水平。通过SDS PAGE分析分析级份中的感兴趣的蛋白。将纯化的级份合并在一起。
脱盐柱预装的脱盐柱，HiPrepTM26/10，Pharmacia树脂20mL陶瓷羟基磷灰石(产品目录号158-2200)检测仪215，254和280nm的UV级份15mL用5CV的15mM乙酸缓冲液pH 6.0平衡该柱。将来自羟基磷灰石柱的合并后的级份加样到该柱上，然后用15mM乙酸缓冲液，pH 6.0以20mL/分钟的流速洗脱。通过SDS-PAGE分析级份中感兴趣的蛋白。将纯的级份合并在一起，并且通过Bradford测定估算蛋白含量。测定纯的级份的内毒素含量，并且最终通过0.22微米的滤膜进行最终过滤。
实施例21具有细胞色素P450序列的嵌合体的比较性表达制备重组嵌合颗粒，其中，人细胞色素P4501A1序列的290-302号位置存在于HBc 78和79号残基之间。一种制剂包括一个C-末端Cys残基，而其他的没有，并且其末端是HBc 149号位置的缬氨酸。用在例1B中披露的V2载体表达没有末端Cys的颗粒，而以Cys为末端的颗粒是用胺例1I所披露的方法制备的载体表达的。所述载体分别被称为V2.1A1(290-302)和V16.1A1(290-302)。表达产量分别为2.7mg/g细胞，36mg/L培养物和8.8mg/g，144mg/L，因此说明了末端半胱氨酸修饰对稳定嵌合分子颗粒生产和产量的作用。
在下面示出了P450 1A1肽的序列，同时示出了该表位的编码和互补DNA序列。P450 1A1序列始于N-末端GI，并且止于C-末端EL残基序列，因此，总共只有四个添加的(异源)残基，这些残基既不是来自HBc序列，也不是来自所插入的肽序列。
插入的B细胞表位序列(GI)QEKQLDENANVQL(EL)SEQ ID NO280
编码序列5’CAAGAAAAACAGCTAGACGAAAACGCAAATGTACAGCTCSEQ ID NO74互补序列5’CGAGCTGTACATTTGCGTTTTCGTCTAGCTGTTTTTCTTGSEQ ID NO71实施例22制备表达在C-末端融合的肽前面具有半胱氨酸残基的颗粒的载体。
为了制备在HBc基因的V149后面有单个半胱氨酸，随后是T细胞表位的颗粒，合成了PCR引物(SEQ ID NO282)。将该引物与HBc149/NcoI-F(SEQ ID No67)组合在一起用于扩增HBc基因，以便生产一种形式的HBc，这种HBc具有直接导入V149后面的一个半胱氨酸密码子，以及EcoRI和HindIII限制位点(在导入的半胱氨酸之后)。用NcoI和HindIII裂解478bp的PCR产物，并且克隆到pKK223-3N。
SEQ ID No.281C V V T T E P5′GCAAGCTTACTATTGAATTCCGCAAACAACAGTAGTCTCCGGHindIII EcoRISEQ ID No282然后用EcoRI和HindIII裂解所得到的质粒，并且将退火的编码Pf/CS-UTC(PF/CS326-345；SEQ ID Nos121和122)的寡核苷酸连接到该质粒上。然后用将该质粒用作PCR反应的模板，同时使用引物HBc-P79/SacI-F(SEQ ID No73)和Pf/CS(C17A)(SEQ ID No145)，所得到的PCR产物(307bp)编码HBc的79-149号氨基酸残基，随后是导入的半胱氨酸，再随后是具有C17A突变的Pf/CS-UTC序列，并且其侧翼为SacI(5’)和HindIII(3’)限制位点。用SacI和HindIII裂解过片段，并且与业已用两种相同的酶裂解过的质粒V2.Pf1[编码疟疾(NANP)4表位]连接。
所得到的基因编码具有190个氨基酸残基的HBc嵌合体，该嵌合体具有插入HBc的78和79号氨基酸之间的(NANP)4，(其侧翼分别为来自EcoRI和SacI限制位点的Gly-Ile和Glu-Leu序列)，并且在C-末端具有C17A形式的Pf/CS326-345。因此，所述单个半胱氨酸位于HBc的V149和Gly-Ile接头序列(来自EcoRI限制位点之间)之间，该接头序列位于Pf/CS326-345(C17A)[Pf/CS-UTC(C17A)]T细胞表位的第一个氨基酸前面(参见SEQ ID No.284)。
表达这种杂交颗粒，纯化并通过在37℃下培养数周分析其稳定性。将该颗粒(V12.Pf1(C17A)C150)的稳定性与V12.Pf1的稳定性进行比较，这两种颗粒之间的唯一差别是半胱氨酸的位置。对于V12.Pf1来说，紧随半胱氨酸之后的是位于该蛋白的C-末端的三个氨基酸残基(SVT)(SEQ ID No283)，而对于V12.Pf1(C17A)C150来说，紧随半胱氨酸之后的是22个额外的氨基酸残基(SEQ ID No284)。
V12.Pf1TTVV GI EYLNKIQNSLSTEWSPCSVTSEQ ID No283V12.Pf1(C17A)C150TTVVCGI EYLNKIQNSLSTEWSPASVTSEQ ID No284将半胱氨酸残基插在HBc和T细胞表位(V12.Pf1(C17A)C150)之间的作用是，产生一种与没有C-末端的半胱氨酸的类似颗粒(V12.Pf1(C17A)相比明显更稳定的颗粒。以下事实证实了这种稳定作用与V12.Pf1(C17A)不同，V12.Pf1(C17A)C150更容易纯化，而又不会显著降解单体(在图4和8中比较了这些颗粒的T＝O)；另外，在37℃下培养时，V12.Pf1(C17A)C150比V12.Pf1(C17A)明显更稳定。在37℃下培养14天之后，V12.Pf1(C17A)单体完全降解(图4)，而V12.Pf1(C17A)C150单体仅有部分降解(图8)。
很显然，V12.Pf1(C17A)C150不如V12.Pf1稳定(图8)。以上数据表明，当单个C-末端半胱氨酸残基位于或靠近HBc嵌合体的C-末端的5个残基内时，该半胱氨酸残基的稳定化作用最有效。
实施例23杂合颗粒的分析凝胶过滤分析用25mL Superose6 HR 10/30层析柱(Amersham Pharmacia #17-0537-01)和a Bi℃ADTMSPRINT Perfusion层析系统对纯化的杂交HBc颗粒进行分析凝胶过滤分析。将UV检测仪设定为监测260和280nm的波长。用3倍柱体积(CV；大约75mL)的缓冲液(50mM NaPO4，pH 6.8)以0.75mL/分钟的流速平衡该柱。
用50mM NaPO4，pH 6.8将待分析的颗粒稀释到浓度为1mg/mL。将200微升(μL)样品加样到200μL的环中，并且注射到所述柱上。用50mM NaPO4，pH 6.8以0.75mL/分钟的流速将所述样品从该柱上洗脱。
用上述方法分析若干种含有C-末端半胱氨酸残基的颗粒或不含所述半胱氨酸的类似颗粒。用Bi℃ADTM软件(PerSeptiVeTM)整合280nm轨迹，以便提供下面表17中所示的结果。
表17

*C-末端半胱氨酸稳定化的颗粒测定纯化颗粒的颗粒百分比，然后按上述方法在37℃下，在水溶液中培养。在培养14天之后测定该组合物的稳定性。该分析的结果在下面的表18中示出。
表18

*参见表17的注释。
图8表示在37℃下培养0天、7天和14天之后对表18中的颗粒进行SDS-PAGE分析的结果。在下面的表19中示出了对SDS-PAGE分析进行密度测定分析的结果。
表19

*参见表17的注释。
在BALB/c小鼠体内分析有和没有C-末端氨基酸残基的表18和19中的颗粒以及实施例16中的对照颗粒的免疫原性，通过用20微克溶解在不含有佐剂的磷酸缓冲的盐溶液(pH 7.4)中的相应的颗粒通过腹膜内注射接种所述颗粒，与实施例4所报导的结果形成对比。在免疫接种之后2周，通过ELISA分析血清，用HBc颗粒(抗-HBc)或(NANP)5合成肽[抗-(NANP)n]作为固相捕捉抗原。该研究的结果在下面的表20中示出。
表20

*参见表17的注释。
本研究的数据表明，C-末端半胱氨酸稳定化的颗粒在生产之后不久以及在37℃下培养不同时间之后都更稳定。稳定化的颗粒即使是在没有佐剂的情况下也表现出较高的免疫原性。另外，尽管颗粒状材料存在于诸如V12.Pf1(C17A)的非稳定化材料中，在培养14天之后没有单体嵌合蛋白，并且该材料的存在不会诱导抗最初导入的异源B细胞表位序列-在这里是疟疾免疫原-的抗体。
实施例24含有β-淀粉样蛋白表位序列的嵌合体业已提出用抗42个氨基酸的β-淀粉样前体蛋白片段的抗体作治疗性和预防性疫苗，用来治疗阿尔茨海默病(REF)[Schenk et al.(Jul8，1999)Nature，400(6740)116-117]。该片段的C-末端包括一个极端疏水的区域，因此在嵌合HBc颗粒表面上表达时很有可能出现问题。
因此，除了含有全部42个氨基酸序列的颗粒[V16.β-Am(1-42)]之外，还构建了仅包括较亲水的区域的三种其他颗粒1-17号氨基酸残基[V16β-Am(1-17)]，22-32号氨基酸残基[V16β-Am(22-32)]，和1-32号氨基酸残基[V16β-Am(1-32)]。通过让互补的寡核苷酸退火构建编码颗粒V16β-Am(1-17)和V16β-Am(22-32)颗粒的嵌合基因，并将所构建的基因插入事先用EcoRI和SacI消化的质粒V16中。
β-Am(1-17)-T5’-AATTGATGCGGAATTTCGTCATGACAGCGGCTATGAGGTGCACCATCAGAAACTGGAGCTSEQ ID NO296β-Am(1-17)-B5’-CCAGTTTCTGATGGTGCACCTCATAGCCGCTGTCATGACGAAATTCCGCATCSEQ ID NO297β-Am(22-32)-T5’-AATTGAAGATGTCGGTTCTAACAAGGGGGCAATTATCGAGCTSEQ ID NO298β-Am(22-32)-B5’-CGATAATTGCCCCCTTGTTAGAACCGACATCTTCSEQ ID NO299为了构建含有-42号残基[V16β-Am(1-42)]和1-32号残基[V16β-Am(1-32)]的基因，对寡核苷酸β-Am(1-32/42)-T和β-Am(1-42)-B或β-Am(1-32)-B进行退火，然后通过5轮解链(94℃)和补平(72℃)将末端补平，以便形成完整双链的片段。在100μL的总体积中用Vent聚合酶(NEB)、dNTPs(250μM)和退火的片段(250nM)进行反应。然后将2微升用作2轮PCR反应的模板，以便制备编码1-32和1-42号残基的片段，其侧翼为EcoRI和SacI限制位点(注Leu密码子(CTG)是通过引物“β-Am(L+1-32/42)-5’-PCR”导入的，并且在下面的两种构建体中位于第一个β-Am氨基酸的前面，以便恢复EcoRI位点，用于克隆目的)。
用于制备β-淀粉样蛋白1-32和1-42号残基片段的寡核苷酸
β-Am(1-32/42)-T5’-GCGGGAATTGATGCGGAATTTCGTCATGACAGCGGCTATGA-GGTGCACCATCAGAAACTGGTTTTCTTTGCCGAAGATGTCGSEQ ID NO300β-Am(1-42)-B5’-GCGGAGCTCCGCTATGACAACCCCACCCACCATTAAGCCGA-TAATTGCCCCCTTGTTAGAACCGACATCTTCGGCAAAGAAAASEQ ID NO301β-Am(1-32)-B5’-GCGGAGCTCGATAATTGCCCCCTTGTTAGAACCGACAT-CTTCGGCAAAGAAAASEQ ID NO302用于1-42号残基扩增的PCR引物β-Am(L+1-32/42)-5’-PCR5’-GCGGGAATTCTGGATGCGGAATTTCGTCATGSEQ ID NO303β-Am(1-42)-3’PCR5’-GCGGAGCTCCGCTATGASEQ ID NO304用于1-32号残基扩增的PCR引物β-Am(L+1-32/42)-5’-PCR5’-GCGGGAATTCTGGATGCGGAATTTCGTCATGSEQ ID NO305β-Am(1-32)-3’PCR5’-GCGGAGCTCGATAATTGCSEQ ID NO306
实施例25流感病毒M2构建体最近，Neirynck et al.，(℃t 1999)Nature Med.，5(10)1157-1163和WO 99/07839报导了M2的24个氨基酸的细胞外结构域与缺乏1-4号氨基酸残基的全长HBc颗粒(HBc183)的N-末端的融合。在下面示出了在本文中被称为IM2HBc的该构建体的示意图，其中，将所述24聚体连接在HBc的N-末端。
IM2HBcMSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD-HBc(5-183)SEQ ID NO307在一种说明性的制剂中，将M2表位插入乙型肝炎核心的免疫优势环中，并且用上文所披露的用于这种插入和纯化的技术成功地表达并纯化了并称为ICC-1475的颗粒。同样在免疫优势环(ICC-1473)表达了M2表位的一种突变形式，并且纯化了所得到的颗粒，在该突变形式中，位于天然M217和19号位置上的两个半胱氨酸残基被丙氨酸残基所取代。这两种颗粒在下面示意性地示出。
ICC-1475 HBc(1-78)-GI-SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD-EL-HBc(79-149)SEQ ID NO308ICC-1473 HBc(1-78)-GI-SLLTEVETPIRNEWGARandSSD-EL-HBc(79-149)-CSEQ ID NO309与天然序列(ICC-1475)相比，ICC-1473构建体所产生的纯化颗粒高出大约7倍。尚有待于确定半胱氨酸残基的突变是否会改变这种颗粒的保护效力。不过，与和其他区域(包括N-末端)融合的表位相比，在HBc的免疫优势环上输送的表位通常明显具有更高的免疫原性，并且，所得到的颗粒具有较低的抗HBc免疫原性。
还制备了这样的颗粒，其中，M2 N-末端24聚体表位与C-末端截短的乙型肝炎核心颗粒的N-末端融合。该构建体(ICC-1438)还包括N-末端前-核心序列(SEQ ID NO310)。制备了一种类似构建体，该构建体包括一个位于杂交蛋白(ICC-1492)末端的半胱氨酸残基，在该构建体中，半胱氨酸残基紧随HBc基因的Val-149之后。在下面示意性地示出了上述构建体。
ICC-1438 MGISLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDELLGWLWGI-HBc(2-149)SEQ ID NO310ICC-1492 MGI8LLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDELLGWLWGI-HBc(2-149)-CSEQ ID NO311应当指出的是，为了确保防止从天然HBc起始甲硫氨酸开始的翻译，将编码该残基的密码子诱变成编码异亮氨酸残基的密码。在由EcoRI(GI)和SacI(EL)限制位点编码的残基下面加下划线。前核心序列是加下划线的EL残基和″-HBc(2-149)″之间的序列。
通过本文其他部分披露的SDS-PAGE进行分析，证实了在制备时，与ICC-1492(泳道3)相比，ICC-1438单体结构是不稳定的(泳道2)，在图9中的SDS-PAGE凝胶上用HBc-149(泳道1)，ICC-1475(泳道4)和ICC-1473(泳道5)作为其他的分子量对照。通过对颗粒进行分析凝胶过滤没有发现ICC-1438单体的不稳定性。
预计ICC-1475(图9，泳道4)和ICC-1473(图9，泳道5)具有略低于ICC-1438和ICC-1492的分子量，因为前两种分子包括直接插入免疫优势环的M2表位，并因此缺乏存在于ICC-1438和CC-1498中的前核心序列(SEQ ID NO310)。正如所预料的，ICC-1492比ICC-1475和ICC-1473大；不过，与ICC-1492相同的，保留了C-末端半胱氨酸残基的ICC-1438由于明显的裂解显然不比ICC-1475和ICC-1473大。
还涉及这样一种构建体，它包括与HBc N-末端(结构域I)或环(结构域II)连接的上述M2 N-末端细胞外序列，并且还包括与HBc的环(结构域II)或C-末端(结构域IV)连接的诸如SEQ ID NO10(参见表A)的M2蛋白C-末端序列。上述相关的构建体还包括至少一个稳定化C-末端半胱氨酸残基，正如在本文其他部分所讨论的。
实施例26在猴体内的比较性免疫原性在猕猴体内研究用SeppicTMISA-720(Seppic Inc.，Paris，France)、AlhydrogelTM(Superfos，Denmark)作为佐剂配制的或未配制过的(盐水)由V12.Pf3.1表达的颗粒的比较性免疫原性。
按照生产商的指导制备SeppicTMISA-720制剂。简单地讲，以70∶30 7(w/w)的比例混合ISA-720和V12.Pf3.1颗粒，并且用台式涡旋搅拌器以最大功率涡旋搅拌1分钟。AlhydrogelTM制剂是用超过V12.Pf3.1颗粒8倍的AlhydrogelTM(以重量计)制备的，证实该颗粒在免疫接种之前能够与AlhydrogelTM物理结合。
用20μg V12.Pf3.1颗粒作为免疫原通过肌内注射对两组猴(一组为雄性，一组为雌性)进行免疫。在第0、21、42、56和70天采集动物血样，并且通过ELISA分析血清的抗-NANP抗体效价，在下面的表15中示出的结果表明，与AlhydrogelTM-配制的或未配制过的材料相比，用SeppicTMISA-720配制的V12.Pf3.1颗粒具有较高的免疫原性。当SeppicTMISA-720被用作佐剂时，抗体反应的动力学更快，并且终点效价分别比AlhydrogelTM和盐水高100-1000倍。
表15

实施例27T细胞激活用溶解在SeppicTMMontanideTMISA-720中的V12.Pf3.1颗粒对小鼠进行两次免疫接种。取出脾细胞，并且在存在各种肽的条件下进行刺激。在存在以下肽的条件下UTC(来自恶性疟原虫的通用T细胞表位SEQ IN NO120)、相当于HBc 85-100的p85-100肽、NANP(来自V12.Pf3.1的B细胞表位；NANPNVDP(NANP)3，SEQ ID NO22)，在存在葡萄球菌肠内毒素B(SEB)的条件下，或者在组织培养基(unstim)中培养106个细胞3天。3天之后通过ELISA测定干扰素γ产量。
在下面的表16中示出的结果表明，用V12.Pf3.1免疫能诱导可以导识所述蛋白的UTC成分的T细胞，并启动这种细胞的Th1型反应。
表16

*S.D.＝标准差**ND＝未测定本文所引用的每一份专利和论文都被收作本文参考。冠词″a″或″an″的使用，意在包括一个或一个以上。
以上说明和实施例是说明性质的，而不应当被认为是限定型的。在本发明构思和范围内的其他变化是可行的，并且对于本领域技术人员来说是显然意见的。
序列表<110>A.J.比尔克特<120>具有增强的稳定性的免疫原性HBc嵌合体颗粒<130>4564/83501 ICC-102.2 PCT<140>未授予<141>2001-08-16<150>60/226,867<151>2000-08-22<150>60/225,843<151>2000-08-16<150>USSN未授予<151>2001-08-15<160>313<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>16<212>PRT<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)<400>1Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro1 5 10 15<210>2<211>20<212>PRT<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)<400>2Glu Tyr Leu Asn Lys Ile Gln Asn Ser Leu Ser Thr Glu Trp Ser Pro1 5 10 15Ala Ser Val Thr20<210>3
<211>15<212>PRT<213>肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)<400>3Lys Leu Glu Glu Leu Ser Asp Lys Ile Asp Glu Leu Asp Ala Glu1 5 10 15<210>4<211>35<212>PRT<213>肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)<400>4Gln Lys Lys Tyr Asp Glu Asp Gln Lys Lys Thr Glu Glu Lys Ala Ala1 5 10 15Leu Glu Lys Ala Ala Ser Glu Glu Met Asp Lys Ala Val Ala Ala Val20 25 30Gln Gln Ala35<210>5<211>27<212>PRT<213>Cryptosporidium parvum<400>5Gln Asp Lys Pro Ala Asp Ala Pro Ala Ala Glu Ala Pro Ala Ala Glu1 5 10 15Pro Ala Ala Gln Gln Asp Lys Pro Ala Asp Ala20 25<210>6<211>17<212>PRT<213>1型人免疫缺陷病毒<400>6Arg Lys Arg Ile His Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ile Thr Lys1 5 10 15Asn
<210>7<211>31<212>PRT<213>口蹄疫病毒<400>7Tyr Asn Gly Glu Cys Arg Tyr Asn Arg Asn Ala Val Pro Asn Leu Arg1 5 10 15Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Val Ala Arg Thr Leu Pro20 25 30<210>8<211>10<212>PRT<213>甲型流感病毒<400>8Tyr Arg Asn Leu Leu Trp Leu Thr Glu Lys1 5 10<210>9<211>23<212>PRT<213>甲型流感病毒<400>9Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys1 5 10 15Arg Cys Asn Gly Ser Ser Asp20<210>10<211>23<212>PRT<213>甲型流感病毒<400>10Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys1 5 10 15
Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp20<210>11<211>142<212>PRT<213>鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)<400>11Asp Ile Leu Lys Val Ile Val Asp Ser Met Asn His His Gly Asp Ala1 5 10 15Arg Ser Lys Leu Arg Glu Glu Leu Ala Glu Leu Thr Ala Glu Leu Lys20 25 30Ile Tyr Ser Val Ile Gln Ala Glu Ile Asn Lys His Leu Ser Ser Ser35 40 45Gly Thr Ile Asn Ile His Asp Lys Ser Ile Asn Leu Met Asp Lys Asn50 55 60Leu Tyr Gly Tyr Thr Asp Glu Glu Ile Phe Lys Ala Ser Ala Glu Tyr65 70 75 80Lys Ile Leu Glu Lys Met Pro Gln Thr Thr Ile Gln Val Asp Gly Ser85 90 95Glu Lys Lys Ile Val Ser Ile Lys Asp Phe Leu Gly Ser Glu Asn Lys100 105 110Arg Thr Gly Ala Leu Gly Asn Leu Lys Asn Ser Tyr Ser Tyr Asn Lys115 120 125Asp Asn Asn Glu Leu Ser His Phe Ala Thr Thr Cys Ser Asp130 135 140<210>12<211>19<212>PRT<213>流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)<400>12Cys Ser Ser Ser Asn Asn Asp Ala Ala Gly Asn Gly Ala Ala Gln Phe1 5 10 15Gly Gly Tyr
<210>13<211>11<212>PRT<213>流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)<400>13Asn Lys Leu Gly Thr Val Ser Tyr Gly Glu Glu1 5 10<210>14<211>16<212>PRT<213>流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)<400>14Asn Asp Glu Ala Ala Tyr Ser Lys Asn Arg Arg Ala Val Leu Ala Tyr1 5 10 15<210>15<211>28<212>PRT<213>Moraxella catarrhalis<400>15Leu Asp Ile Glu Lys Asp Lys Lys Lys Arg Thr Asp Glu Gln Leu Gln1 5 10 15Ala Glu Leu Asp Asp Lys Tyr Ala Gly Lys Gly Tyr20 25<210>16<211>28<212>PRT<213>黏膜莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)<400>16Leu Asp Ile Glu Lys Asn Lys Lys Lys Arg Thr Glu Ala Glu Leu Gln1 5 10 15Ala Glu Leu Asp Asp Lys Tyr Ala Gly Lys Gly Tyr20 25
<210>17<211>27<212>PRT<213>黏膜莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)<400>17Ile Asp Ile Glu Lys Lys Gly Lys Ile Arg Thr Glu Ala Leu Leu Ala1 5 10 15Glu Leu Asn Lys Asp Tyr Pro Gly Gln Gly Tyr20 25<210>18<211>25<212>PRT<213>牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)<400>18Gly Val Ser Pro Lys Val Cys Lys Asp Val Thr Val Glu Gly Ser Asn1 5 10 15Glu Phe Ala Pro Val Gln Asn Leu Thr20 25<210>19<211>20<212>PRT<213>牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)<400>19Arg Ile Gln Ser Thr Trp Arg Gln Lys Thr Val Asp Leu Pro Ala Gly1 5 10 15Thr Lys Tyr Val20<210>20<211>21<212>PRT<213>克鲁氏锥虫(Trypanosoma cruzi)<400>20Lys Ala Ala Ile Ala Pro Ala Lys Ala Ala Ala Ala Pro Ala Lys Ala1 5 10 15
Ala Thr Ala Pro Ala20<210>21<211>24<212>PRT<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)<400>21Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn A1a Asn Pro1 5 10 15Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro20<210>22<211>20<212>PRT<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciprum)<400>22Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro1 5 10 15Asn Ala Asn Pro20<210>23<211>20<212>PRT<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)<400>23Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro1 5 10 15Asn Ala Asn Pro20<210>24<211>28<212>PRT<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>24Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro1 5 10 15Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro20 25<210>25<211>20<212>PRT<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)<400>25Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala1 5 10 15Asn Pro Asn Val20<210>26<211>22<212>PRT<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)<400>26Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala1 5 10 15Asn Pro Asn Val Asp Pro20<210>27<211>24<212>PRT<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)<400>27Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala1 5 10 15Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala20
<210>28<211>18<212>PRT<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)<400>28Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro1 5 10 15Asn Val<210>29<211>20<212>PRT<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)<400>29Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro1 5 10 15Asn Val Asp Pro20<210>30<211>22<212>PRT<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)<400>30Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro1 5 10 15Asn Val Asp Pro Asn Ala20<210>31<211>16<212>PRT<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)<400>31Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Val1 5 10 15
<210>32<211>18<212>PRT<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)<400>32Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Val1 5 10 15Asp Pro<210>33<211>20<212>PRT<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)<400>33Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Val1 5 10 15Asp Pro Asn Ala20<210>34<211>19<212>PRT<213>间日疟原虫(Plasmodium vivax)<400>34Gly Asp Arg Ala Asp Gly Gln Pro Ala Gly Asp Arg Ala Asp Gly Gln1 5 10 15Pro Ala Gly<210>35<211>18<212>PRT<213>间日疟原虫(Plasmodium vivax)<400>35Arg Ala Asp Asp Arg Ala Ala Gly Gln Pro Ala Gly Asp Gly Gln Pro1 5 10 15
Ala Gly<210>36<211>18<212>PRT<213>间日疟原虫(Plasmodium vivax)<400>36Ala Asn Gly Ala Gly Asn Gln Pro Gly Ala Asn Gly Ala Gly Asp Gln1 5 10 15Pro Gly<210>37<211>18<212>PRT<213>间日疟原虫(Plasmodium vivax)<400>37Ala Asn Gly Ala Asp Asn Gln Pro Gly Ala Asn Gly Ala Asp Asp Gln1 5 10 15Pro Gly<210>38<211>18<212>PRT<213>间日疟原虫(Plasmodium vivax)<400>38Ala Asn Gly Ala Gly Asn Gln Pro Gly Ala Asn Gly Ala Asp Asn Gln1 5 10 15Pro Gly<210>39<211>18<212>PRT<213>间日疟原虫(Plasmodium vivax)
<400>39Ala Asn Gly Ala Asp Asn Gln Pro Gly Ala Asn Gly Ala Asp Asp Gln1 5 10 15Pro Gly<210>40<211>22<212>PRT<213>间日疟原虫(Plasmodium vivax)<400>40Ala Pro Gly Ala Asn Gln Glu Gly Gly Ala Ala Ala Pro Gly Ala Asn1 5 10 15Gln Glu Gly Gly Ala Ala20<210>41<211>16<212>PRT<213>贝氏疟原虫(Plasmodium berghei)<400>41Asp Pro Pro Pro Pro Asn Pro Asn Asp Pro Pro Pro Pro Asn Pro Asn1 5 10 15<210>42<211>24<212>PRT<213>约氏疟原虫(Plasmodium yoelii)<400>42Gln Gly Pro Gly Ala Pro Gln Gly Pro Gly Ala Pro Gln Gly Pro Gly1 5 10 15Ala Pro Gln Gly Pro Gly Ala Pro20<210>43<211>15<212>PRT
<213>表兄链球菌(Streptococcus sobrinus)<400>43Lys Pro Arg Pro Ile Tyr Glu Ala Lys Leu Ala Gln Asn Gln Lys1 5 10 15<210>44<211>16<212>PRT<213>表兄链球菌(Streptococcus sobrinus)<400>44Ala Lys Ala Asp Tyr Glu Ala Lys Leu Ala Gln Tyr Glu Lys Asp Leu1 5 10 15<210>45<211>9<212>PRT<213>弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri)<400>45Lys Asp Arg Thr Leu Ile Glu Gln Lys1 5<210>46<211>15<212>PRT<213>呼吸道合胞病毒<400>46Cys Ser Ile Cys Ser Asn Asn Pro Thr Cys Trp Ala Ile Cys Lys1 5 10 15<210>47<211>25<212>PRT<213>痢疾内变形虫(Entamoeba histolytica)<400>47Val Glu Cys Ala Ser Thr Val Cys Gln Asn Asp Asn Ser Cys Pro Ile1 5 10 15Ile Ala Asp Val Glu Lys Cys Asn Gln20 25
<210>48<211>34<212>PRT<213>Schistosoma japonicum<400>48Asp Leu Gln Ser Glu Ile Ser Leu Ser Leu Glu Asn Gly Glu Leu Ile1 5 10 15Arg Arg Ala Lys Ser Ala Glu Ser Leu Ala Ser Glu Leu Gln Arg Arg20 25 30Val Asp<210>49<211>34<212>PRT<213>Schistosoma mansoni<400>49Asp Leu Gln Ser Glu Ile Ser Leu Ser Leu Glu Asn Ser Glu Leu Ile1 5 10 15Arg Arg Ala Lys Ala Ala Glu Ser Leu Ala Ser Asp Leu Gln Arg Arg20 25 30Val Asp<210>50<211>16<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒<400>50Gly Pro Lys Glu Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Cys1 5 10 15<210>51<211>17<212>PRT<213>白喉棒杆菌(Corynebacterium diphtheriae)
<400>51Phe Gln Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly1 5 10 15Cys<210>52<211>25<212>PRT<213>布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)<400>52Val Glu Ile Gls Glu Gly Thr Val Thr Leu Lys Arg Glu Ile Asp Lys1 5 10 15Asn Gly Lys Val Thr Val Ser Leu Cys20 25<210>53<211>19<212>PRT<213>布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)<400>53Thr Leu Ser Lys Asn Ile Ser Lys Ser Gly Glu Val Ser Val Glu Leu1 5 10 15Asn Asp Cys<210>54<211>11<212>PRT<213>甲型流感病毒<400>54Ser Ser Val Ser Ser Phe Glu Arg Phe Glu Cys1 5 10<210>55<211>21<212>PRT
<213>克鲁氏锥虫(Trypanosoma cruzi)<400>55Ser His Asn Phe Thr Leu Val Ala Ser Val Ile Ile Glu Glu Ala Pro1 5 10 15Ser Gly Asn Thr Cys20<210>56<211>16<212>PRT<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)<400>56Ser Val Gln Ile Pro Lys Val Pro Tyr Pro Asn Gly Ile Val Tyr Cys1 5 10 15<210>57<211>16<212>PRT<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)<400>57Asp Phe Asn His Tyr Tyr Thr Leu Lys Thr Gly Leu Glu Ala Asp Cys1 5 10 15<210>58<211>18<212>PRT<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)<400>58Pro Ser Asp Lys His Ile Glu Gln Tyr Lys Lys Ile Lys Asn Ser Ile1 5 10 15Ser Cys<210>59<211>20<212>PRT<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>59Glu Tyr Leu Asn Lys Ile Gln Asn Ser Leu Ser Thr Glu Trp Ser Pro1 5 10 15Cys Ser Val Thr20<210>60<211>19<212>PRT<213>间日疟原虫(Plasmodium vivax)<400>60Tyr Leu Asp Lys Val Arg Ala Thr Val Gly Thr Glu Trp Thr Pro Cys1 5 10 15Ser Val Thr<210>61<211>16<212>PRT<213>表兄链球菌(Streptococcus sobrinus)<400>61Lys Pro Arg Pro Ile Tyr Glu Ala Lys Leu Ala Gln Asn Gln Lys Cys1 5 10 15<210>62<211>17<212>PRT<213>表兄链球菌(Streptococcus sobrinus)<400>62Ala Lys Ala Asp Tyr Glu Ala Lys Leu Ala Gln Tyr Glu Lys Asp Leu1 5 10 15Cys<210>63<211>16<212>PRT<213>淋巴脉络丛脑膜炎病毒
<400>63Arg Pro Gln Ala Ser Gly Val Tyr Met Gly Asn Leu Thr Ala Gln Cys1 5 10 15<210>64<211>16<212>PRT<213>破伤风梭菌(Clostridium tetani)<400>64Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Cys1 5 10 15<210>65<211>18<212>DNA<213>质粒pKK223<400>65ggtgcatgca aggagatg18<210>66<211>55<212>DNA<213>质粒pKK223<400>66gcgaagcttc ggatcccatg gttttttcct ccttatgtga aattgttatc cgctc 55<210>67<211>24<212>DNA<213>乙型肝炎病毒<400>67ttgggccatg gacatcgacc ctta 24<210>68<211>29<212>DNA<213>乙型肝炎病毒
<400>68gcggaattcc ttccaaatta acacccacc29<210>69<211>38<212>DNA<213>乙型肝炎病毒<400>69cgcgaattca aaaagagctc gatccagcgt ctagagac 38<210>70<211>31<212>DNA<213>乙型肝炎病毒<400>70cgcaagctta aacaacagta gtctccggaa g 31<210>71<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明人细胞色素450<400>71cgagctgtac atttgcgttt tcgtctagct gtttttcttg40<210>72<211>31<212>DNA<213>乙型肝炎病毒<400>72gcggaattcc atcttccaaa ttaacaccca c 31<210>73<211>39<212>DNA<213>乙型肝炎病毒
<400>73cgcgaattca aaaagagctc ccagcgtcta gagacctag 39<210>74<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明人细胞色素450<400>74caagaaaaac agctagacga aaacgcaaat gtacagctc 39<210>75<211>42<212>DNA<213>乙型肝炎病毒<400>75cgcaagctta gagctcttga attccaacaa cagtagtctc cg 42<210>76<211>288<212>DNA<213>乙型肝炎病毒<400>76cgcgagctcc cagcgtctag agacctag 28<210>77<211>17<212>DNA<213>质粒pKK223<400>77gtatcaggct gaaaatc 17<210>78<211>19<212>PRT<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>78Ile Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn1 5 10 15Pro Glu Leu<210>79<211>57<212>DNA<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)<400>79aattaacgct aatccgaacg ctaatccgaa cgctaatccg aacgctaatc cggagct 57<210>80<211>49<212>DNA<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)<400>80ccggattagc gttcggatta gcgttcggat tagcgttcgg attagcgtt 49<210>81<211>31<212>PRT<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)<400>81Ile Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn1 5 10 15Pro Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Glu Leu20 25 30<210>82<211>93<212>DNA<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)<400>82aattaacgct aatccgaacg ttgacccgaa cgctaatccg aacgctaatc cgaacgctaa 60tccgaacgtt gacccgaacg ctaatccgga gct 93
<210>83<211>91<212>DNA<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)<400>83ggagctccgg attagcgttc gggtcaacgt tcggattagc gttcggatta gcgttcggat 60tagcgttcgg gtcaacgttc ggattagcgt t 91<210>84<211>23<212>PRT<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)<400>84Ile Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn1 5 10 15Pro Asn Ala Asn Pro Glu Leu20<210>85<211>69<212>DNA<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)<400>85aattaacgcg aatccgaacg tggatccgaa tgccaaccct aacgccaacc caaatgcgaa 60cccagagct 69<210>86<211>61<212>DNA<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)<400>86ctgggttcgc atttgggttg gcgttagggt tggcattcgg atccacgttc ggattcgcgt 60t 61<210>87<211>23<212>PRT<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>87Ile Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp1 5 10 15Pro Asn Ala Asn Pro Glu Leu20<210>88<211>69<212>DNA<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)<400>88aattaacgcg aatccgaatg ccaaccctaa cgccaaccca aacgtggatc cgaatgcgaa 60cccagagct 69<210>89<211>61<212>DNA<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)<400>89ctgggttcgc attcggatcc acgtttgggt tggcgttagg gttggcattc ggattcgcgt 60t 61<210>90<211>31<212>PRT<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)<400>90Ile Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn1 5 10 15Pro Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Glu Leu20 25 30<210>91<211>93<212>DNA<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)<400>91
aattaacgcg aatccgaacg tggatccaaa tgccaaccct aacgctaatc caaacgccaaa 60cccgaatgtt gaccccaatg ccaatccgga gct 93<210>92<211>85<212>DNA<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)<400>92ccggattggc attggggtca acattcgggt tggcgtttgg attagcgtta gggttggcat 60ttggatccac gttcggattc gcgtt85<210>93<211>23<212>PRT<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)<400>93Ile Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn1 5 10 15Ala Asn Pro Asn Val Glu Leu20<210>94<211>69<212>DNA<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)<400>94aattaatccg aacgtggatc caaatgccaa ccctaacgct aatccaaacg ccaacccgaa 60tgttgagct 69<210>95<211>61<212>DNA<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)<400>95caacattcgg gttggcgttt ggattagcgt tagggttggc atttggatcc acgttcggat 60t 61<210>96
<211>25<212>PRT<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)<400>96Ile Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn1 5 10 15Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro Glu Leu20 25<210>97<211>75<212>DNA<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)<400>97aattaatccg aacgtggatc caaatgccaa ccctaacgct aatccaaacg ccaacccgaa 60tgttgaccct gagct 75<210>98<211>67<212>DNA<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)<400>98cagggtcaac attcgggttg gcgtttggat tagcgttagg gttggcattt ggatccacgt 60tcggatt67<210>99<211>27<212>PRT<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)<400>99Ile Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn1 5 10 15Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Glu Leu20 25<210>100<211>81<212>DNA
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)<400>100aattaatccg aacgtggatc caaatgccaa ccctaacgct aatccaaacg ccaacccgaa 60tgttgaccct aatgctgagc t81<210>101<211>73<212>DNA<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)<400>101cagcattagg gtcaacattc gggttggcgt ttggattagc gttagggttg gcatttggat 60ccacgttcgg att 73<210>102<211>21<212>PRT<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)<400>102Ile Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn1 5 10 15Pro Asn Val Glu Leu20<210>103<211>63<212>DNA<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)<400>103aattaacgtg gatccaaatg ccaaccctaa cgctaatcca aacgccaacc cgaatgttga 60gct63<210>104<211>55<212>DNA<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)<400>104caacattcgg gttggcgttt ggattagcgt tagggttggc atttggatcc acgtt 55
<210>105<211>23<212>PRT<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)<400>105Ile Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn1 5 10 15Pro Asn Val Asp Pro Glu Leu20<210>106<211>69<212>DNA<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)<400>106aattaacgtg gatccaaatg ccaaccotaa cgctaatcca aacgccaacc cgaatgttga 60ccctgagct 69<210>107<211>61<212>DNA<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)<400>107cagggtcaac attcgggttg gcgtttggat tagcgttagg gttggcattt ggatccacgt 60t 61<210>108<211>25<212>PRT<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)<400>108Ile Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn1 5 10 15Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Glu Leu20 25<210>109
<211>75<212>DNA<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)<400>109aattaacgtg gatccaaatg ccaaccctaa cgctaatcca aacgccaacc cgaatgttga 60ccctaatgct gagct 75<210>110<211>67<212>DNA<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)<400>110cagcattagg gtcaacattc gggttggcgt ttggattagc gttagggttg gcatttggat 60ccacgtt67<210>111<211>19<212>PRT<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)<400>111Ile Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn1 5 10 15Val Glu Leu<210>112<211>57<212>DNA<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)<400>112aattgatcca aatgccaacc ctaacgctaa tccaaacgcc aacccgaatg ttgagct 57<210>113<211>49<212>DNA<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)<400>113caacattcgg gttggcgttt ggattagcgt tagggttggc atttggatc 49
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agcttactag gtaacggagc acggagacca ttcggtggac agagagttct ggattttgtt 60cagatattc 69<210>123<211>24<212>PRT<213>间日疟原虫(Plasmodium vivax)<400>123Ile Pro Ala Gly Asp Arg Ala Asp Gly Gln Pro Ala Gly Asp Arg Ala1 5 10 15Ala Gly Gln Pro Ala Gly Glu Leu20<210>124<211>72<212>DNA<213>间日疟原虫(Plasmodium vivax)<400>124aattccggct ggtgaccgtg cagatggcca gccagcgggt gaccgcgctg caggccagcc 60ggctggcgagct 72<210>125<211>64<212>DNA<213>间日疟原虫(Plasmodium vivax)<400>125cgccagccgg ctggcctgca gcgcggtcac ccgctggctg gccatctgca cggtcaccag 60ccgg 64<210>126<211>21<212>PRT<213>间日疟原虫(Plasmodium vivax)<400>126Ile Asp Arg Ala Ala Gly Gln Pro Ala Gly Asp Arg Ala Asp Gly Gln1 5 10 15Pro Ala Gly Glu Leu20
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<400>131cccctggttg atcacccgcg ccgtttgccc ccggctgatt accggcgccg ttcgc 55<210>132<211>21<212>PRT<213>间日疟原虫(Plasmodium vivax)<400>132Ile Ala Asn Gly Ala Asp Asn Gln Pro Gly Ala Asn Gly Ala Asp Asp1 5 10 15Gln Pro Gly Glu Leu20<210>133<211>63<212>DNA<213>间日疟原虫(Plasmodium vivax)<400>133aattgcgaac ggcgccgata atcagccggg tgcaaacggg gcggatgacc aaccaggcga 60gct63<210>134<211>55<212>DNA<213>间日疟原虫(Plasmodium vivax)<400>134cgcctggttg gtcatccgcc ccgtttgcac ccggctgatt atcggcgccg ttcgc 55<210>135<211>39<212>PRT<213>间日疟原虫(Plasmodium vivax)<400>135Ile Ala Asn Gly Ala Gly Asn Gln Pro Gly Ala Asn Gly Ala Gly Asp1 5 10 15Gln Pro Gly Ala Asn Gly Ala Asp Asn Gln Pro Gly Ala Asn Gly Ala20 25 30
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<210>140<211>67<212>DNA<213>间日疟原虫(Plasmodium vivax)<400>140ccgctgcacc gccttcttga ttggctcctg gcgctgcagc cccaccttcc tggttggcgc 60ccggcgc67<210>141<211>21<212>PRT<213>间日疟原虫(Plasmodium vivax)<400>141Ile Glu Tyr Leu Asp Lys Val Arg Ala Thr Val Gly Thr Glu Trp Thr1 5 10 15Pro Cys Ser Val Thr20<210>142<211>69<212>DNA<213>间日疟原虫(Plasmodium vivax)<400>142aattgaatat ctggataaag tgcgtgcgac cgttggcacg gaatggactc cgtgcagcgt 60gacctaata 69<210>143<211>69<212>DNA<213>间日疟原虫(Plasmodium vivax)<400>143agcttattag gtcacgctgc acggagtcca ttccgtgcca acggtcgcac gcactttatc 60cagatattc 69<210>144<211>10<212>PRT<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>144Thr Val Ser Ala Pro Ser Trp Glu Thr Ser1 5 10<210>145<211>42<212>DNA<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)<400>145gccaagctta ctaggtaacg gaggccggag accattcggt gg 42<210>146<211>44<212>DNA<213>间日疟原虫(Plasmodium vivax)<400>146cgcgaattca agcgaacggc gccgataatc agccggcggg tgca 44<210>147<211>8<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>147Cys Val Val Thr Thr Glu Pro Leu1 5<210>148<211>37<212>DNA<213>乙型肝炎病毒<400>148cgcaagctta ctagcaaaca acagtagtct ccggaag 37<210>149<211>7<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>149
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cgcaagctta taggataggg gcatttggtg g 31<210>155<211>6<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>155Ile Pro Ala Asn Pro Pro1 5<210>156<211>28<212>DNA<213>乙型肝炎病毒<400>156gcgaagctta gataggggca tttggtgg 28<210>157<211>6<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>157Pro Ala Asn Pro Pro Arg1 5<210>158<211>28<212>DNA<213>乙型肝炎病毒<400>158cgcaagctta aggggcattt ggtggtct 28<210>159<211>7<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>159Cys Pro Ala Asn Pro Pro Arg
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<210>165<211>7<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>165Asn Pro Pro Arg Tyr Ala Pro1 5<210>166<211>31<212>DNA<213>乙型肝炎病毒<400>166cgcaagctta atttggtggt ctataagctg g 31<210>167<211>8<212>PRT<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)<400>167Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro1 5<210>168<211>6<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>168Asn Tyr Lys Lys Pro Lys1 5<210>169<211>7<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>169Lys Arg Gly Pro Arg Thr His
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<223>人工序列说明Hepatitis Bvirus PCR primer with an NcoI restriction site<400>203ttgggccatg gacatcgacc ctta 24<210>204<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明具有EcoRI限制位点的乙型肝炎病毒PCR引物<400>204gcggagctct ttttccaaat taattaacac ccac 34
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<223>人工序列说明具有EcoRI和SacI限制位点以及插入的赖氨酸密码子的乙型肝炎病毒PCR引物<400>205cgcgagctcg atccagcgtc tagagagacc 30<210>206<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明具有HindIII限制位点的乙型肝炎病毒PCR引物<400>206cgcaagctta aacaacagta gtctccggaa g 31<210>207<211>14<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>207Cys Gln Glu Lys Gln Leu Asp Glu Asn Ala Asn Val Gln Leu1 5 10<210>208<211>13<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>208Cys Ser Lys Lys Gly Pro Arg Ala Ser Gly Asn Leu Ile1 5 10<210>209<211>21
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<223>人工序列说明细胞色素P-450片段<400>212Cys Arg Phe Ser Ile Asn1 5
<210>213<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明细胞色素P-450片段<400>213Cys Ala Val Pro Arg1 5<210>214<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明细胞色素P-450片段<400>214Cys Val Ile Pro Arg Ser1 5<210>215<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明细胞色素P-450片段<400>215Cys Phe Ile Pro Val1 5<210>216<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明细胞色素P-450片段
<400>216Cys Thr Val Ser Gly Ala1 5<210>217<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明细胞色素P-450片段<400>217Cys Thr Leu Ser Gly Glu1 5<210>218<211>20<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>218Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp Leu Val1 5 10 15Val Ser Tyr Val20<210>219<211>63<212>DNA<213>乙型肝炎病毒<400>219gctacctggg tgggtgttaa tttggaagat ccagcgtcta gagacctagt agtcagttat 60gtc63<210>220<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明在乙型肝炎核心的75号氨基酸插入的K<400>220Thr Trp Val Gly Val Lys Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp Leu1 5 10 15Val Val Ser Tyr Val20<210>221<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明插入赖氨酸密码子aaa以产生HBc-K75突变<400>221gctacctggg tgggtgttaa aaatttggaa gatccagcgt c 41<210>222<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明在乙型肝炎核心的76号氨基酸插入的K<400>222Thr Trp Val Gly Val Asn Lys Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp Leu1 5 10 15Val Val Ser Tyr Val20<210>223<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明插入赖氨酸密码子aaa以产生HBc-K76突变<400>223ttaataaatt ggaagatcca gcgtcta 27
<210>224<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明在乙型肝炎核心的77号氨基酸插入的K<400>224Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Lys Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp Leu1 5 10 15Val Val Ser Tyr Val20<210>225<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明插入赖氨酸密码子aaa以产生HBc-K77突变<400>225ttaatttgaa agaagatcca gcgtcta 27<210>226<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明在乙型肝炎核心的78号氨基酸插入的K<400>226Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Lys Asp Pro Ala Ser Arg Asp Leu1 5 10 15Val Val Ser Tyr Val20<210>227<211>32
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明插入赖氨酸密码子aaa以产生HBc-K78突变<400>227ttaatttgga aaaagatcca gcgtctagag ac32<210>228<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明在乙型肝炎核心的79号氨基酸插入的K<400>228Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Lys Pro Ala Ser Arg Asp Leu1 5 10 15Val Val Ser Tyr Val20<210>229<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明插入赖氨酸密码子aaa以产生HBc-K79突变<400>229ttaatttgga agataaacca gcgtctagag acctag36<210>230<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明在乙型肝炎核心的80号氨基酸插入的K
<400>230Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Lys Ala Ser Arg Asp Leu1 5 10 15Val Val Ser Tyr Val20<210>231<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明插入赖氨酸密码子aaa以产生HBc-K80突变<400>231ttaatttgga agatccaaaa gcgtctagag acctagtag 39<210>232<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明在乙型肝炎核心的81号氨基酸插入的K<400>232Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala Lys Ser Arg Asp Leu1 5 10 15Val Val Ser Tyr Val20<210>233<211>43<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明插入赖氨酸密码子aaa以产生HBc-K81突变<400>233ttaatttgga agatccagcg aaatctagag acctagtagt cag43
<210>234<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明在乙型肝炎核心的82号氨基酸插入的K<400>234Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Lys Arg Asp Leu1 5 10 15Val Val Ser Tyr Val20<210>235<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明插入赖氨酸密码子aaa以产生HBc-K82突变<400>235ttaatttgga agatccagcg tctaaaagag acctagtagt cagtt 45<210>236<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明在乙型肝炎核心的83号氨基酸插入的K<400>236Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Lys Asp Leu1 5 10 15Val Val Ser Tyr Val20<210>237<211>50<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明插入赖氨酸密码子aaa以产生HBc-K83突变<400>237ttaatttgga agatccagcg tctagaaaag acctagtagt cagttatgtc 50<210>238<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明在乙型肝炎核心的84号氨基酸插入的K<400>238Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp Lys Leu1 5 10 15Val Val Ser Tyr Val20<210>239<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明插入赖氨酸密码子aaa以产生HBc-K84突变<400>239ttaatttgga agatccagcg tctagagaca aactagtagt cagttatgtc 50<210>240<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明在乙型肝炎核心的85号氨基酸插入的K<400>240Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp Leu Lys1 5 10 15
Val Val Ser Tyr Val20<210>241<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明插入赖氨酸密码子aaa以产生HBc-K85突变<400>241ctcgagagac ctaaaagtag tcagttatgt c 31<210>242<211>36<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>242Gly Ile Gln Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser1 5 10 15Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn20 25 30Glu Gln Glu Leu35<210>243<211>102<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明人细胞色素P450<400>243aatttggatg tgggaagatc gtgagatcaa caattatacc agcctgatac attctttaat 60tgaagagtcc cagaaccaac aggagaaaaa tgaacaagag ct 102<210>244<211>94<212>DNA
<213>乙型肝炎病毒<400>244cttgttcatt tttctcctgt tggttctggg actcttcaat taaagaatgt atcaggctgg 60tataattgtt gatctcacga tcttcccaca tcca 94<210>245<211>6<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>245Met Asp Ile Asp Pro Tyr1 5<210>246<211>217<212>PRT<213>岩黄鼠(Spermophilus variegatus)<400>246Met Tyr Leu Phe His Leu Cys Leu Val Phe Ala Cys Val Pro Cys Pro1 5 10 15Thr Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Asp Met Asp20 25 30Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ser Ser Tyr Gln Leu Leu Asn Phe35 40 45Leu Pro Leu Asp Phe Phe Pro Asp Leu Asn Ala Leu Val Asp Thr Ala50 55 60Ala Ala Leu Tyr Glu Glu Glu Leu Thr Gly Arg Glu His Cys Ser Pro65 70 75 80His His Thr Ala Ile Arg Gln Ala Leu Val Cys Trp Glu Glu Leu Thr85 90 95Arg Leu Ile Thr Trp Met Ser Glu Asn Thr Thr Glu Glu Val Arg Arg100 105 110Ile Ile Val Asp His Val Asn Asn Thr Trp Gly Leu Lys Val Arg Gln115 120 125Thr Leu Trp Phe His Leu Ser Cys Leu Thr Phe Gly Gln His Thr Val
130 135 140Gln Glu Phe Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Ala Pro145 150 155 160Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu His Thr165 170 175Val Ile Arg Arg Arg Gly Gly Ser Arg Ala Ala Arg Ser Pro Arg Arg180 185 190Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg195 200 205Arg Ser Gln Ser Pro Ala Ser Asn Cys210 215<210>247<211>183<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>247Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu1 5 10 15Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp20 25 30Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys35 40 45Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu50 55 60Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala65 70 75 80Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys85 90 95Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg100 105 110Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr115 120 125
Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro130 135 140Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr145 150 155 160Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser165 170 175Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys180<210>248<211>185<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>248Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu1 5 10 15Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp20 25 30Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys35 40 45Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu50 55 60Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Gln Asp Pro Ala65 70 75 80Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys85 90 95Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg100 105 110Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr115 120 125Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro I1e Leu Ser Thr Leu Pro130 135 140Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Asp Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg145 150 155 160
Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg165 170 175Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys180 185<210>249<211>185<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>249Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu1 5 10 15Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp20 25 30Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys35 40 45Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu50 55 60Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Pro Ala65 70 75 80Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Val Gly Leu Lys85 90 95Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg100 105 110Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr115 120 125Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro130 135 140Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Asp Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg145 150 155 160Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Pro Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg165 170 175Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys
180 185<210>250<211>183<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>250Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu1 5 10 15Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp20 25 30Thr Ala Ala Ala Leu Tyr Arg Asp Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys35 40 45Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Asp50 55 60Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Thr Asn Leu Glu Asp Pro Ala65 70 75 80Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Val Gly Leu Lys85 90 95Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg100 105 110Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr115 120 125Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro130 135 140Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr145 150 155 160Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser165 170 175Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys180<210>251<211>183
<212>PRT<213>美洲旱獭(Marmota monax)<400>251Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ser Ser Tyr Gln Leu Leu1 5 10 15Asn Phe Leu Pro Leu Asp Phe Phe Pro Asp Leu Asn Ala Leu Val Asp20 25 30Thr Ala Thr Ala Leu Tyr Glu Glu Glu Leu Thr Gly Arg Glu His Cys35 40 45Ser Pro His His Thr Ala Ile Arg Gln Ala Leu Val Cys Trp Asp Glu50 55 60Leu Thr Lys Leu Ile Ala Trp Met Ser Ser Asn Ile Thr Ser Glu Gln65 70 75 80Val Arg Thr Ile Ile Val Asn His Val Asn Asp Thr Trp Gly Leu Lys85 90 95Val Arg Gln Ser Leu Trp Phe His Leu Ser Cys Leu Thr Phe Gly Gln100 105 110His Thr Val Gln Glu Phe Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr115 120 125Pro Ala Pro Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro130 135 140Glu His Thr Val Ile Arg Arg Arg Gly Gly Ala Arg Ala Ser Arg Ser145 150 155 160Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro165 170 175Arg Arg Arg Arg Ser Gln Cys180<210>252<211>26<212>PRT<213>原牛(Bos taurus)<400>252Ser Thr Pro Pro Leu Pro Trp Pro Trp Ser Pro Ala Ala Leu Arg Leu
1 5 10 15Leu Gln Arg Pro Pro Glu Glu Pro Ala Ala20 25<210>253<211>17<212>PRT<213>埃博拉病毒<400>253Ala Thr Gln Val Glu Gln His His Arg Arg Thr Asp Asn Asp Ser Thr1 5 10 15Ala<210>254<211>17<212>PRT<213>埃博拉病毒<400>254His Asn Thr Pro Val Tyr Lys Leu Asp Ile Ser Glu Ala Thr Gln Val1 5 10 15Glu<210>255<211>17<212>PRT<213>埃博拉病毒<400>255Gly Lys Leu Gly Leu Ile Thr Asn Thr Ile Ala Gly Val Ala Val Leu1 5 10 15Ile<210>256<211>10<212>PRT
<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明柔性接头臂<400>256Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr1 5 10<210>257<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明柔性接头臂<400>257Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly1 5<210>258<211>513<212>DNA<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)<220>
<221>CDS<222>(1)..(513)<400>258atg gac atc gac cct tat aaa gaa ttt gga gct act gtg gag tta ctc48Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu1 5 10 15tcg ttt ttg cct tct gac ttc ttt cct tca gta cga gat ctt cta gat96Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp20 25 30acc gcc tca gct ctg tat cgg gaa gcc tta gag tct cct gag cat tgt144Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys35 40 45tca cct cac cat act gca ctc agg caa gca att ctt tgc tgg ggg gaa192Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu50 55 60
cta atg act cta gct acc tgg gtg ggt gtt aat ttg gaa gat gga att240Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Gly Ile65 70 75 80aac gct aat ccg aac gct aat ccg aac gct aat ccg aac gct aat ccg288Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro85 90 95gag ctc cca gcg tct aga gac cta gta gtc agt tat gtc aac act aat336Glu Leu Pro Ala Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn100 105 110atg ggc cta aag ttc agg caa ctc ttg tgg ttt cac att tct tgt ctc384Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu115 120 125act ttt gga aga gaa aca gtt ata gag tat ttg gtg tct ttc gga gtg432Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val130 135 140tgg att cgc act cct cca gct tat aga cca cca aat gcc cct atc cta480Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu145 150 155 160tca aca ctt ccg gag act act gtt gtt tag taa513Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val165 170<210>259<211>169<212>PRT<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)<400>259Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu1 5 10 15Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp20 25 30Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys35 40 45Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu50 55 60Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Gly Ile65 70 75 80Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro85 90 95
Glu Leu Pro Ala Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn100 105 110Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu115 120 125Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val130 135 140Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu145 150 155 160Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val165<210>260<211>513<212>DNA<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)<220>
<221>CDS<222>(1)..(513)<400>260atg gac atc gac cct tat aaa gaa ttt gga gct act gtg gag tta ctc48Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu1 5 10 15tcg ttt ttg cct tct gac ttc ttt cct tca gta cga gat ctt cta gat96Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp20 25 30acc gcc tca gct ctg tat cgg gaa gcc tta gag tct cct gag cat tgt144Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys35 40 45tca cct cac cat act gca ctc agg caa gca att ctt tgc tgg ggg gaa192Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu50 55 60cta atg act cta gct acc tgg gtg ggt gtt aat ttg gaa gga att aac240Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Gly Ile Asn65 70 75 80gct aat ccg aac gct aat ccg aac gct aat ccg aac gct aat ccg gag288Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Glu85 90 95ctc gat cca gcg tct aga gac cta gta gtc agt tat gtc aac act aat336
Leu Asp Pro Ala Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn100 105 110atg ggc cta aag ttc agg caa ctc ttg tgg ttt cac att tct tgt ctc384Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu115 120 125act ttt gga aga gaa aca gtt ata gag tat ttg gtg tct ttc gga gtg432Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val130 135 140tgg att cgc act cct cca gct tat aga cca cca aat gcc cct atc cta480Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu145 150 155 160tca aca ctt ccg gag act act gtt gtt tag taa513Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val165 170<210>261<211>169<212>PRT<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)<400>261Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu1 5 10 15Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp20 25 30Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys35 40 45Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu50 55 60Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Gly Ile Asn65 70 75 80Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Glu85 90 95Leu Asp Pro Ala Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn100 105 110Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu115 120 125Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val130 135 140Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu145 150 155 160Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val165
<210>262<211>519<212>DNA<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)<220>
<221>CDS<222>(1)..(519)<400>262atg gac atc gac cct tat aaa gaa ttt gga gct act gtg gag tta ctc48Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu1 5 10 15tcg ttt ttg cct tct gac ttc ttt cct tca gta cga gat ctt cta gat96Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp20 25 30acc gcc tca gct ctg tat cgg gaa gcc tta gag tct cct gag cat tgt144Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys35 40 45tca cct cac cat act gca ctc agg caa gca att ctt tgc tgg ggg gaa192Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu50 55 60cta atg act cta gct acc tgg gtg ggt gtt aat ttg gaa gat cca gcg240Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala65 70 75 80tct aga gac cta gta gtc agt tat gtc aac act aat atg ggc cta aag288Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys85 90 95ttc agg caa ctc ttg tgg ttt cac att tct tgt ctc act ttt gga aga336Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg100 105 110gaa aca gtt ata gag tat ttg gtg tct ttc gga gtg tgg att cgc act384Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr115 120 125cct cea gct tat aga cca cca aat gcc cct atc cta tca aca ctt ccg432Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro130 135 140
gag act act gtt gtt gga att gaa tat ctg aac aaa atc cag aac tct480Glu Thr Thr Val Val Gly Ile Glu Tyr Leu Asn Lys Ile Gln Asn Ser145 150 155 160ctg tcc acc gaa tgg tct ccg tgc tcc gtt acc tag taa519Leu Ser Thr Glu Trp Ser Pro Cys Ser Val Thr165 170<210>263<211>171<212>PRT<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)<400>263Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu1 5 10 15Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp20 25 30Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys35 40 45Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu50 55 60Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala65 70 75 80Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys85 90 95Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg100 105 110Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr115 120 125Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro130 135 140Glu Thr Thr Val Val Gly Ile Glu Tyr Leu Asn Lys Ile Gln Asn Ser145 150 155 160Leu Ser Thr Glu Trp Ser Pro Cys Ser Val Thr165 170<210>264<211>516<212>DNA<213>恶性疟原虫(PlasmKodium falciparum)<220>
<221>CDS
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<210>265<211>170<212>PRT<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)<400>265Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu1 5 10 15Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp20 25 30Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys35 40 45Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu50 55 60Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Gly Ile65 70 75 80Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro85 90 95Glu Leu Pro Ala Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn100 105 110Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu115 120 125Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val130 135 140Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu145 150 155 160Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val Cys165 170<210>266<211>579<212>DNA<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)<220>
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acc gcc tca gct ctg tat cgg gaa gcc tta gag tct cct gag cat tgt144Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys35 40 45tca cct cac cat act gca ctc agg caa gca att ctt tgc tgg ggg gaa192Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu50 55 60cta atg act cta gct acc tgg gtg ggt gtt aat ttg gaa gat gga att240Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Gly Ile65 70 75 80aac gct aat ccg aac gct aat ccg aac gct aat ccg aac gct aat ccg288Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro85 90 95gag ctc cca gcg tct aga gac cta gta gtc agt tat gtc aac act aat336Glu Leu Pro Ala Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn100 105 110atg ggc cta aag ttc agg caa ctc ttg tgg ttt cac att tct tgt ctc384Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu115 120 125act ttt gga aga gaa aca gtt ata gag tat ttg gtg tct ttc gga gtg432Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val130 135 140tgg att cgc act cct cca gct tat aga cca cca aat gcc cct atc cta480Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu145 150 155 160tca aca ctt ccg gag act act gtt gtt gga att gaa tat ctg aac aaa528Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val Gly Ile Glu Tyr Leu Asn Lys165 170 175atc cag aac tct ctg tcc acc gaa tgg tct ccg tgc tcc gtt acc tag576Ile Gln Asn Ser Leu Ser Thr Glu Trp Ser Pro Cys Ser Val Thr180 185 190taa579<210>267<211>191<212>PRT
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acc gcc tca gct ctg tat cgg gaa gcc tta gag tct cct gag cat tgt144Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys35 40 45tca cct cac cat act gca ctc agg caa gca att ctt tgc tgg ggg gaa192Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu50 55 60cta atg act cta gct acc tgg gtg ggt gtt aat ttg gaa gat gga att240Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Gly Ile65 70 75 80aac gcg aat ccg aac gtg gat ccg aat gcc aac cct aac gcc aac cca288Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro85 90 95aat gcg aac cca gag ctc cca gcg tct aga gac cta gta gtc agt tat336Asn Ala Asn Pro Glu Leu Pro Ala Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr100 105 110gtc aac act aat atg ggc cta aag ttc agg caa ctc ttg tgg ttt cac384Val Asn Thr Asn Met Glu Leu Lys Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His115 120 125att tct tgt ctc act ttt gga aga gaa aca gtt ata gag tat ttg gtg432Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val130 135 140tct ttc gga gtg tgg att cgc act cct cca gct tat aga cca cca aat480Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn145 150 155 160gcc cct atc cta tca aca ctt ccg gag act act gtt gtt gga att gaa528Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val Gly Ile Glu165 170 175tat ctg aac aaa atc cag aac tct ctg tcc acc gaa tgg tct ccg tgc576Tyr Leu Asn Lys Ile Gln Asn Ser Leu Ser Thr Glu Trp Ser Pro Cys180 185 190tcc gtt acc tag taa591Ser Val Thr195<210>269<211>195<212>PRT
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)<400>269Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu1 5 10 15Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp20 25 30Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys35 40 45Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu50 55 60Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Gly Ile65 70 75 80Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro85 90 95Asn Ala Asn Pro Glu Leu Pro Ala Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr100 105 110Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His115 120 125Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val130 135 140Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn145 150 155 160Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val Gly Ile Glu165 170 175Tyr Leu Asn Lys Ile Gln Asn Ser Leu Ser Thr Glu Trp Ser Pro Cys180 185 190Ser Val Thr195<210>270<211>561<212>DNA<213>1型人免疫缺陷病毒<220>
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20 25 30acc gcc tca gct ctg tat cgg gaa gcc tta gag tct cct gag cat tgt144Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys35 40 45tca cct cac cat act gca ctc agg caa gca att ctt tgc tgg ggg gaa192Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu50 55 60cta atg act cta gct acc tgg gtg ggt gtt aat ttg gaa gat gga att240Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Gly Ile65 70 75 80caa tgg atg gaa tgg gat cgt gag atc aac aat tat acc agc ctg ata288Gln Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu Ile85 90 95cat tct tta att gaa gag tcc cag aac caa cag gag aaa aat gaa caa336His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu Gln100 105 110gag ctc cca gcg tct aga gac cta gta gtc agt tat gtc aac act aat384Glu Leu Pro Ala Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn115 120 125atg ggc cta aag ttc agg caa ctc ttg tgg ttt cac att tct tgt ctc432Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu130 135 140act ttt gga aga gaa aca gtt ata gag tat ttg gtg tct ttc gga gtg480Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val145 150 155 160tgg att cgc act cct cca gct tat aga cca cca aat gcc cct atc cta528Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu165 170 175tca aca ctt ccg gag act act gtt gtt tag taa561Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val180 185<210>271<211>185<212>PRT<213>1型人免疫缺陷病毒
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acc gcc tca gct ctg tat cgg gaa gcc tta gag tct cct gag cat tgt144Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys35 40 45tca cct cac cat act gca ctc agg caa gca att ctt tgc tgg ggg gaa192Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu50 55 60cta atg act cta gct acc tgg gtg ggt gtt aat ttg gaa gat gga att240Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Gly Ile65 70 75 80caa tgg atg gaa tgg gat cgt gag atc aac aat tat acc agc ctg ata288Gln Typ Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu Ile85 90 95cat tct tta att gaa gag tcc cag aac caa cag gag aaa aat gaa caa336His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu Gln100 105 110gag ctc cca gcg tct aga gac cta gta gtc agt tat gtc aac act aat384Glu Leu Pro Ala Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn115 120 125atg ggc cta aag ttc agg caa ctc ttg tgg ttt cac att tct tgt ctc432Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser cys Leu130 135 140act ttt gga aga gaa aca gtt ata gag tat ttg gtg tct ttc gga gtg480Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val145 150 155 160tgg att cgc act cct cca gct tat aga cca eca aat gcc cct atc cta528Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu165 170 175tca aca ctt ccg gag act act gtt gtt tgc tag taa564Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val Cys180 185<210>273<211>186<212>PRT<213>1型人免疫缺陷病毒<400>273Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1 5 10 15Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp20 25 30Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys35 40 45Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu50 55 60Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Gly Ile65 70 75 80Gln Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu Ile85 90 95His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu Gln100 105 110Glu Leu Pro Ala Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn115 120 125Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu130 135 140Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val145 150 155 160Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu165 170 175Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val Cys180 185<210>274<211>651<212>DNA<213>岩黄鼠(Spermophilus variegatus)<400>274atgtatcttt ttcacctgtg ccttgttttt gcctgtgttc catgtcctac tgttcaagcc 60tccaagctgt gccttggatg gctttgggac atggacatag atccctataa agaatttggt 120tcttcttatc agttgttgaa ttttcttcct ttggactttt ttcctgatct caatgcattg 180gtggacactg ctgctgctct ttatgaagaa gaattaacag gtagggagca ttgttctcct 240catcatactg ctattagaca ggccttagtg tgttgggaag aattaactag attaattaca 300tggatgagtg aaaatacaac agaagaagtt agaagaatta ttgttgatca tgtcaataat 360acttggggac ttaaagtaag acagacttta tggtttcatt tatcatgtct tacttttgga 420caacacacag ttcaagaatt tttggttagt tttggagtat ggattagaac tccagctcct 480tatagaccac ctaatgcacc cattttatca actcttccgg aacatacagt cattaggaga 540agaggaggtt caagagctgc taggtccccc cgaagacgca ctccctctcc tcgcaggaga 600aggtctcaat caccgcgtcg cagacgctct caatctccag cttccaactg c 651<210>275<211>549<212>DNA
<213>乙型肝炎病毒<400>275atggacatcg acccttataa agaatttgga gctactgtgg agttactctc gtttttgcct 60tctgacttct ttccttcagt acgagatctt ctagataccg cctcagctct gtatcgggaa 120gccttagagt ctcctgagca ttgttcacct caccatactg cactcaggca agcaattctt 180tgctgggggg aactaatgac tctagctacc tgggtgggtg ttaatttgga agatccagcg 240tctagagacc tagtagtcag ttatgtcaac actaatatgg gcctaaagtt caggcaactc 300ttgtggtttc acatttcttg tctcactttt ggaagagaaa cagttataga gtatttggtg 360tctttcggag tgtggattcg cactcctcca gcttatagac caccaaatgc ccctatccta 420tcaacacttc cggagactac tgttgttaga cgacgaggca ggtcccctag aagaagaact 480ccctcgcctc gcagacgaag gtctcaatcg ccgcgtcgca gaagatctca atctcgggaa 540tctcaatgt 549<210>276<211>554<212>DNA<213>乙型肝炎病毒<400>276atggacattg acccttataa agaatttgga gctactgtgg agttactctc gtttttgcct 60tctgacttct ttccttccgt acgagatctc ctagacaccg cctcagctct gtatcgagaa 120gccttagagt ctcctgagca ttgctcacct caccatactg cactcaggca agccattctc 180tgctgggggg aattgatgac tctagctacc tgggtgggta ataatttgca agatccagca 240tccagagatc tagtagtcaa ttatgttaat actaacatgg gtttaaagat caggcaacta 300ttgtggtttc atatatcttg ccttactttt ggaagagaga ctgtacttga atatttggtc 360tctttcggag tgtggattcg cactcctcca gcctatagac caccaaatgc ccctatctta 420tcaacacttc cggaaactac tgttgttaga cgacgggacc gaggcaggtc ccctagaaga 480agaactccct cgcctcgcag acgcagatct caatcgccgc gtcgcagaag atctcaatct 540cgggaatctc aatgt 555<210>277<211>555<212>DNA<213>乙型肝炎病毒<400>277atggacattg acccttataa agaatttgga gctactgtgg agttactctc gtttttgcct 60tctgacttct ttccttccgt cagagatctc ctagacaccg cctcagctct gtatcgagaa 120gccttagagt ctcctgagca ttgctcacct caccatactg cactcaggca agccattctc 180tgctgggggg aattgatgac tctagctacc tgggtgggta ataatttgga agatccagca 240tctagggatc ttgtagtaaa ttatgttaat actaacgtgg gtttaaagat caggcaacta 300ttgtggtttc atatatcttg ccttactttt ggaagagaga ctgtacttga atatttggtc 360tctttcggag tgtggattcg cactcctcca gcctatagac caccaaatgc ccctatctta 420tcaacacttc cggaaactac tgttgttaga cgacgggacc gaggcaggtc ccctagaaga 480agaactccct cgcctcgcag acgcagatct ccatcgccgc gtcgcagaag atctcaatct 540
cgggaatctc aatgt 555<210>278<211>549<212>DNA<213>乙型肝炎病毒<400>278atggacattg acccttataa agaatttgga gctactgtgg agttactctc gtttttgcct 60tctgacttct ttccttccgt acgagatctt ctagataccg ccgcagctct gtatcgggat 120gccttagagt ctcctgagca ttgttcacct caccatactg cactcaggca agcaattctt 180tgctggggag acttaatgac tctagctacc tgggtgggta ctaatttaga agatccagca 240tctagggacc tagtagtcag ttatgtcaac actaatgtgg gcctaaagtt cagacaatta 300ttgtggtttc acatttcttg tctcactttt ggaagagaaa cggttctaga gtatttggtg 360tcttttggag tgtggattcg cactcctcca gcttatagac caccaaatgc ccctatccta 420tcaacgcttc cggagactac tgttgttaga cgacgaggca ggtcccctag aagaagaact 480ccctcgcctc gcagacgaag atctcaatcg ccgcgtcgca gaagatctca atctcgggaa 540tctcaatgt 549<210>279<211>549<212>DNA<213>美洲旱獭(Marmota monax)<400>279atggctttgg ggcatggaca tagatcctta taaagaattt ggttcatctt atcagttgtt 60gaattttctt cctttggact tctttcctga tcttaatgct ttggtggaca ctgctactgc 120cttgtatgaa gaagaactaa caggtaggga acattgctct ccgcaccata cagctattag 180acaagcttta gtatgctggg atgaattaac taaattgata gcttggatga gctctaacat 240aacttctgaa caagtaagaa caatcattgt aaatcatgtc aatgatacct ggggacttaa 300ggtgagacaa agtttatggt ttcatttgtc atgtctcact ttcggacaac atacagttca 360agaattttta gtaagttttg gagtatggat caggactcca gctccatata gacctcctaa 420tgcacccatt ctctcgactc ttccggaaca tacagtcatt aggagaagag gaggtgcaag 480agcttctagg tcccccagaa gacgcactcc ctctcctcgc aggagaagat ctcaatcacc 540gcgtcgcag 549<210>280<211>13<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明人细胞色素P450<400>280
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<223>人工序列说明乙型肝炎病毒核心的修饰部分<400>281Cys Val Val Thr Thr Glu Pro1 5<210>282<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明乙型肝炎病毒核心的修饰部分<400>282gcaagcttac tattgaaattc cgcaaacaac agtagtctcc gg42<210>283<211>26<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明乙型肝炎病毒核心的修饰部分<400>283Thr Thr Val Val Gly Ile Glu Tyr Leu Asn Lys Ile Gln Asn Ser Leu1 5 10 15Ser Thr Glu Trp Ser Pro Cys Ser Val Thr20 25
<210>284<211>27<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明乙型肝炎病毒核心的修饰部分<400>284Thr Thr Val Val Cys Gly Ile Glu Tyr Leu Asn Lys Ile Gln Asn Ser1 5 10 15Leu Ser Thr Glu Trp Ser Pro Ala Ser Val Thr20 25<210>285<211>51<212>DNA<213>质粒pKK223<400>285ttcacacagg aaacagaatt cccggggatc cgtcgacctg cagccaagct t 51<210>286<211>38<212>DNA<213>质粒pKK223<400>286ttcacataag gaggaaaaaa cattgggatc cgaagctt 38<210>287<211>20<212>PRT<213>约氏疟原虫(Plasmodium yoelii)<400>287Glu Phe Val Lys Gln Ile Ser Ser Gln Leu Thr Glu Glu Trp Ser Gln1 5 10 15Cys Ser Val Thr20<210>288
<211>14<212>PRT<213>大肠杆菌(Escherichia coli)<400>288Cys Cys Glu Leu Cys Cys Tyr Pro Ala Cys Ala Gly Cys Asn1 5 10<210>289<211>18<212>PRT<213>大肠杆菌(Escherichia coli)<400>289Asn Thr Phe Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Tyr Pro Ala Cys Ala Gly1 5 10 15Cys Asn<210>290<211>18<212>PRT<213>大肠杆菌(Escharichia coli)<400>290Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Tyr Pro Ala Cys Ala Gly1 5 10 15Cys Asn<210>291<211>10<212>PRT<213>流感病毒<400>291Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly Asp Pro Cys1 5 10<210>292<211>9<212>PRT
<213>流感病毒<400>292Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly Cys1 5<210>293<211>42<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>293Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys1 5 10 15Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile20 25 30Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala35 40<210>294<211>11<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>294Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile1 5 10<210>295<211>33<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>295Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys1 5 10 15Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile20 25 30Gly
<210>296<211>60<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>296aattgatgcg gaatttcgtc atgacagcgg ctatgaggtg caccatcaga aactggagct 60<210>297<211>52<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>297ccagtttctg atggtgcacc tcatagccgc tgtcatgacg aaattccgca tc 52<210>298<211>42<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>298aattgaagat gtcggttcta acaagggggc aattatcgag ct 42<210>299<211>34<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>299cgataattgc ccccttgtta gaaccgacat cttc 34<210>300<211>82<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>300gcgggaattg atgcggaatt tcgtcatgac agcggctatg aggtgcacca tcagaaactg 60gttttctttg ccgaagatgt cg 82<210>301
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<210>310<211>35<212>PRT<213>流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)<400>310Met Gly Ile Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu1 5 10 15Trp Gly Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Glu Leu Leu Gly Trp Leu20 25 30Trp Gly Ile35<210>311<211>35<212>PRT<213>流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)<400>311Met Gly Ile Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu1 5 10 15Trp Gly Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Glu Leu Leu Gly Trp Leu20 25 30Trp Gly Ile35<210>312<211>23<212>PRT<213>甲型流感病毒<400>312Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ala1 5 10 15Arg Ala Asn Asp Ser Ser Asp20<210>313<211>19<212>PRT
<213>甲型流感病毒<400>313Glu Gln Gln Ser Ala Val Asp Ala Asp Asp Ser His Phe Val Ser Ile1 5 10 15Glu Leu Glu
权利要求
1.一种长度最多达大约515个氨基酸残基的重组嵌合体乙型肝炎核心(HBc)蛋白分子，该分子(a)包括具有HBc分子的N-末端150个氨基酸残基中的至少大约130个的HBc序列，该序列包括肽键结合的异源表位或用于存在于HBc免疫优势环中的偶联表位的异源接头残基，或具有N-末端150个HBc氨基酸残基中的至少大约135个残基的序列，(b)包括HBc序列的C-末端残基到该分子C-末端的1-10个半胱氨酸残基，这些残基存在于所述嵌合体分子的C-末端的大约30个残基[C-末端半胱氨酸残基]内，和(c)包括具有HBc的135号位置残基到HBc C-末端的至少5个氨基酸残基的序列，所述嵌合体分子(i)在HBc序列中包括不超过20％保守取代的氨基酸残基，和(ii)在宿主细胞中表达时，自我组装成基本上不能结合核酸的颗粒，并且这种颗粒比由缺乏上述C-末端半胱氨酸残基或者在嵌合体中存在的C-末端半胱氨酸残基被另一种残基所取代的在其他方面相同的HBc嵌合体形成的颗粒更稳定。
2.如权利要求1的重组HBc嵌合体蛋白分子，其中，所述肽键结合的异源表位或用于偶联表位的异源接头残基是异源表位。
3.如权利要求2的重组HBc嵌合体蛋白分子，其中，所述异源表位是B细胞表位。
4.如权利要求3的重组HBc嵌合体蛋白分子，它包括与HBc的1-4号氨基酸残基之一形成肽键结合的第二个异源表位。
5.如权利要求3的重组HBc嵌合体蛋白分子，其中，所述B细胞表位与HBc序列的76-85号氨基酸残基之间的一个位置形成肽键结合，并且存在HBc序列的76-85号位置的至少5个残基。
6.如权利要求5的重组HBc嵌合体蛋白分子，其中，存在76-85号氨基酸残基之间的HBc序列，但是被所述B细胞表位所间断。
7.如权利要求2的重组HBc嵌合体蛋白分子，还包括肽键结合的异源T细胞表位。
8.如权利要求7的重组HBc嵌合体蛋白分子，其中，所述T细胞表位与C-末端HBc氨基酸残基形成肽键结合。
9.如权利要求8的重组HBc嵌合体蛋白分子，其中，所述C-末端半胱氨酸残基存在于HBc嵌合体蛋白分子的C-末端的5个氨基酸残基内。
10.如权利要求1的重组HBc嵌合体蛋白分子，其中，所述嵌合体包括从1号位置到至少140号位置的未间断的HBc氨基酸残基序列，和位于HBc嵌合体蛋白分子C-末端的一个半胱氨酸残基。
11.如权利要求10的重组HBc嵌合体蛋白分子，其中，所述嵌合体包括从1号位置到149号位置的未间断的HBc氨基酸残基序列。
12.如权利要求1的重组HBc嵌合体蛋白分子，其中，所述嵌合体包括用于偶联表位的异源接头残基。
13.如权利要求12的重组HBc嵌合体蛋白分子，其中，所述用于偶联表位的异源接头残基与HBc序列的76-85号氨基酸残基之间的一个位置形成肽键结合，并且存在HBc序列的76-85号位置的至少4个残基。
14.如权利要求13的重组HBc嵌合体蛋白分子，其中，存在76-85号氨基酸残基之间的HBc序列，但是被所述用于偶联表位的异源接头残基所间断。
15.如权利要求14的重组HBc嵌合体蛋白分子，其中，所述嵌合体包括从1号位置到至少140号位置的HBc氨基酸序列，和位于HBc嵌合体蛋白分子C-末端的单个半胱氨酸残基。
16.如权利要求15的重组HBc嵌合体蛋白分子，其中，所述嵌合体包括从1号位置到149号位置的HBc氨基酸残基序列。
17.如权利要求16的重组HBc嵌合体蛋白分子，其中，所述用于偶联表位的异源接头残基选自赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸和酪氨酸残基。
18.一种长度为大约135-大约515个氨基酸残基的重组乙型肝炎核心(HBc)蛋白嵌合体分子，它包括4个肽键连接的氨基酸残基序列结构域，从N-末端开始这些结构域被命名为结构域I、II、III、和IV，其中(a)结构域I包括大约71-大约100个氨基酸残基，其序列至少包括HBc的从5号位置到75号位置的残基的序列，并且选择性地包括一个异源表位，该表位包括与HBc的1-4号残基之一形成肽键结合的最多大约30个氨基酸残基，(b)结构域II包括与结构域I的HBc75号残基形成肽键结合的大约5-大约250个氨基酸残基，其中(i)HBc的76-85号位置的序列中的0-全部残基与对HBc来说是异源的1个-大约245个氨基酸残基形成肽键结合，并且构成一个异源表位或用于偶联表位的异源接头残基，或(ii)HBc的76-85号位置的序列不含异源残基，或(iii)缺乏76-85号残基中的一个或多个；(c)结构域III是与结构域II的85号残基形成肽键结合的从86号位置到135号位置的HBc序列，和(d)结构域IV包括(i)与结构域III的135号残基形成肽键结合的HBc氨基酸残基序列的从136号位置到149号位置的0-14个残基，(ii)位于从该嵌合体分子的C-末端开始的大约30个残基内的1-10个半胱氨酸残基[C-末端半胱氨酸残基]，和(iii)与从150号位置到C-末端的HBc异源的序列中的0-大约100个氨基酸残基，其前提是，结构域IV包括至少6个氨基酸残基，其中包括上述(ii)的1-10个半胱氨酸残基，所述嵌合体分子在宿主细胞中表达时，自我组装成基本上不结合核酸的颗粒，并且这种颗粒比由缺乏上述C-末端半胱氨酸残基或者在嵌合体分子中存在的C-末端半胱氨酸残基被另一种残基所取代的在其他方面相同的HBc嵌合体产生的颗粒更稳定，并且具有一种氨基酸残基序列，其中在该嵌合体的HBc序列中不超过约10％的氨基酸残基被取代。
19.如权利要求18的重组HBc嵌合体蛋白分子，它包括两个异源表位。
20.如权利要求19的重组HBc嵌合体蛋白分子，其中，所述两个异源表位存在于结构域I和II、II和IV或I和IV中。
21.如权利要求19的重组HBc嵌合体蛋白分子，其中，所述两个异源表位之一是B细胞表位。
22.如权利要求19的重组HBc嵌合体蛋白分子，其中，所述两个异源表位之一是T细胞表位。
23.如权利要求19的重组HBc嵌合体蛋白分子，其中，所述两个异源表位之一是B细胞表位，并且另一个是T细胞表位。
24.如权利要求18的重组HBc嵌合体蛋白分子，其中，所述结构域I包括与HBc的1-4号残基之一形成肽键结合的异源表位。
25.如权利要求24的重组HBc嵌合体蛋白分子，其中，所述结构域II的异源表位是B细胞表位。
26.如权利要求25的重组HBc嵌合体蛋白分子，其中，所述与HBc的150号位置到C-末端异源的序列是与HBc的140-149号残基之一形成肽键结合的T细胞表位。
27.如权利要求18的重组HBc嵌合体蛋白分子，其中，所述用于偶联表位的异源接头残基或异源表位是异源表位。
28.如权利要求27的重组HBc嵌合体蛋白分子，其中，所述异源表位包括最多达大约245个氨基酸残基。
29.如权利要求28的重组HBc嵌合体蛋白分子，其中，所述异源表位是B细胞表位。
30.如权利要求27的重组HBc嵌合体蛋白分子，其中，所述异源表位包括6-大约50个氨基酸残基。
31.如权利要求27的重组HBc嵌合体蛋白分子，其中，所述异源表位包括20-大约30个氨基酸残基。
32.如权利要求27的重组HBc嵌合体蛋白分子，其中，所述结构域IV包括位于从该嵌合体分子的C-末端开始的大约30个残基内的1-大约5个半胱氨酸残基。
33.如权利要求27的重组HBc嵌合体蛋白分子，其中，存在76-85号氨基酸残基之间的HBc序列，但是被所述异源表位所间断。
34.如权利要求18的重组HBc嵌合体蛋白分子，其中，所述C-末端半胱氨酸残基位于嵌合体蛋白分子的C-末端的大约5个氨基酸残基内。
35.如权利要求18的重组HBc嵌合体蛋白分子，其中，所述与HBc的150号位置到C-末端异源的序列是与HBc的140-149号残基之一形成肽键结合的T细胞表位。
36.如权利要求18的重组HBc嵌合体蛋白分子，其中，所述用于偶联表位的异源接头残基或异源表位是用于偶联表位的异源接头残基。
37.如权利要求36的重组HBc嵌合体蛋白分子，其中，所述用于偶联表位的异源接头残基选自赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸和酪氨酸残基。
38.如权利要求37的重组HBc嵌合体蛋白分子，它包括位于HBc嵌合体蛋白分子C-末端的单个半胱氨酸残基。
39.如权利要求18的重组HBc嵌合体蛋白分子，其中，所述嵌合体包括直到至少140号位置的未间断的HBc氨基酸残基序列。
40.如权利要求39的重组HBc嵌合体蛋白分子，其中，所述未间断的HBc氨基酸残基序列包括1号残基。
41.如权利要求39的重组HBc嵌合体蛋白分子，其中，所述未间断的HBc氨基酸残基序列包括149号残基。
42.一种长度为大约175-大约240个氨基酸残基的重组乙型肝炎核心(HBc)蛋白嵌合体分子，它包括4个肽键连接的氨基酸残基序列结构域，从N-末端开始这些结构域被命名为结构域I、II、III、和IV，其中(a)结构域I包括HBc的大约1号位置到75号位置的残基的序列，(b)结构域II包括与结构域I的HBc75号残基形成肽键结合的5-大约55个氨基酸残基，其中，HBc的76-85号位置的序列中的至少4个残基与对HBc来说是异源的6-大约50个氨基酸残基形成肽键结合，并且构成一个异源表位，(c)结构域III是与结构域II的85号残基形成肽键结合的从86号位置到135号位置的HBc序列，和(d)结构域IV包括(i)与结构域III的135号残基形成肽键结合的HBc氨基酸残基序列的从136号位置到149号位置的5-14个残基，(ii)位于从该嵌合体分子的C-末端开始的大约30个残基内的一个半胱氨酸残基[C-末端半胱氨酸残基]，和(iii)与HBc从150号位置到C-末端异源的序列中的0-大约50个氨基酸残基，所述嵌合体在宿主细胞中表达时，自我组装成的颗粒在280与260nm的波长下所表现出的吸光度比例为大约1.2-大约1.6，并且这种颗粒比由缺乏上述C-末端半胱氨酸残基或者在嵌合体分子中存在的C-末端半胱氨酸残基被另一种残基所取代的在其他方面相同的HBc嵌合体产生的颗粒更稳定，并且具有一种氨基酸残基序列，其中在该嵌合体的HBc序列中不超过约5％的氨基酸残基被取代。
43.如权利要求42的重组HBc嵌合体蛋白分子，其中，所述结构域II的异源表位是B细胞表位。
44.如权利要求43的重组HBc嵌合体蛋白分子，其中，所述异源表位包括15-大约50个氨基酸残基。
45.如权利要求43的重组HBc嵌合体蛋白分子，其中，所述异源表位包括20-大约30个氨基酸残基。
46.如权利要求43的重组HBc嵌合体蛋白分子，其中，存在76-85号氨基酸残基之间的HBc序列，但是被所述异源表位所间断。
47.如权利要求43的重组HBc嵌合体蛋白分子，其中，所述B细胞表位是存在于选自下列一组病原体中的氨基酸序列肺炎链球菌，Cryptosporidium parvum，HIV，口蹄疫病毒，流感病毒，鼠疫耶尔森氏菌，流感嗜血菌，粘膜炎莫拉氏菌，牙龈卟啉单胞菌，科鲁氏锥虫，恶性疟原虫，间日疟原虫，贝氏疟原虫，约氏疟原虫，表兄链球菌，弗氏志贺氏菌，RSV，痢疾内变形虫，Schistosoma japonicum，Schistosoma mansoni，牛抑制素和埃博拉病毒。
48.如权利要求43的重组HBc嵌合体蛋白分子，其中，所述与HBc的150号位置到C-末端异源的序列是与HBc的140-149号残基之一形成肽键结合的T细胞表位。
49.如权利要求48的重组HBc嵌合体蛋白分子，其中，所述T细胞表位来源于将所涉及的嵌合体用作它的免疫原的生物。
50.如权利要求43的重组HBc嵌合体蛋白分子，其中，所述C-末端半胱氨酸残基位于嵌合体蛋白分子的C-末端的约5个氨基酸残基内。
51.一种由重组乙型肝炎核心(HBc)嵌合蛋白分子组成的免疫原性颗粒，所述嵌合蛋白(i)在N-末端、HBc免疫原性环或C-末端具有一个或多个免疫原性表位，或(ii)具有用于免疫原性环中的偶联表位的异源接头残基，并且包括位于或靠近C-末端的一个半胱氨酸残基，所述颗粒基本上不结合核酸，并且与由不含所述半胱氨酸残基的其他方面相同的蛋白组成的颗粒相比，具有增强的稳定性。
52.如权利要求51的免疫原性颗粒，它具有1.2-大约1.7的280/260吸光度比例。
53.如权利要求51的免疫原性颗粒，它的重组HBc嵌合蛋白在N-末端具有一个免疫原性表位。
54.如权利要求51的免疫原性颗粒，它的重组HBc嵌合蛋白在C-末端具有一个免疫原性表位。
55.如权利要求51的免疫原性颗粒，它的重组HBc嵌合蛋白在免疫原性环中具有一个免疫原性表位。
56.如权利要求1的免疫原性颗粒，它的重组HBc嵌合蛋白具有一个B细胞免疫原性表位。
57.如权利要求51的免疫原性颗粒，它的重组HBc嵌合蛋白具有一个T细胞免疫原性表位。
58.如权利要求51的免疫原性颗粒，它的重组HBc嵌合蛋白具有一个B细胞和T细胞免疫原性表位。
59.如权利要求51的免疫原性颗粒，它的重组HBc嵌合蛋白具有一个用于HBc免疫原性环中的偶联表位的异源接头残基。
60.如权利要求59的免疫原性颗粒，其中，所述用于偶联表位的异源接头残基选自赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸和酪氨酸残基。
61.如权利要求60的免疫原性颗粒，其中，所述用于偶联表位的异源接头残基与一种半抗原偶联。
62.如权利要求61的免疫原性颗粒，其中，所述半抗原是寡糖。
63.一种由多个重组嵌合乙型肝炎核心(HBc)蛋白分子组成的免疫原性颗粒；所述重组嵌合HBc蛋白分子的长度最多达大约515个氨基酸残基，它(a)包括具有HBc分子的N-末端150个氨基酸残基中的至少大约130个的HBc序列，该序列包括肽键结合的异源表位或用于存在于HBc免疫优势环中的偶联表位的异源接头残基，或具有N-末端150个HBc氨基酸残基中的至少大约135个残基的序列，(b)包括HBc序列的C-末端残基到该分子C-末端的1-10个半胱氨酸残基，这些残基存在于所述嵌合体分子的C-末端的大约30个残基[C-末端半胱氨酸残基]内，和(c)包括具有从HBc的135号位置残基到HBc C-末端的至少6个氨基酸残基的序列，所述嵌合体分子在HBc序列中含有不超过10％的保守取代的氨基酸残基，所述颗粒基本上不结合核酸，并且这种颗粒比由缺乏上述C-末端半胱氨酸残基或者在嵌合体分子中存在的C-末端半胱氨酸残基被另一种残基所取代的在其他方面相同的HBc嵌合体产生的颗粒更稳定，并且具有一种氨基酸残基序列，其中在该嵌合体的HBc序列中不超过约20％的氨基酸残基被取代。
64.如权利要求63的免疫原性颗粒，它在280与260nm的波长下所表现出的吸光度比例为大约1.4-大约1.6。
65.如权利要求63的免疫原性颗粒，其中，所述重组嵌合HBc蛋白分子的长度大约为175-大约240个氨基酸残基。
66.如权利要求63的免疫原性颗粒，其中，所述肽键结合的异源表位或用于偶联表位的异源接头残基是一种异源表位。
67.如权利要求66的免疫原性颗粒，其中，所述异源表位是B细胞表位。
68.如权利要求63的免疫原性颗粒，其中，所述重组嵌合HBc蛋白分子的长度最多达大约435个氨基酸残基。
69.如权利要求63的免疫原性颗粒，它包括与HBc的1-4号残基之一形成肽键结合的第二个异源表位。
70.如权利要求68的免疫原性颗粒，其中，所述B细胞表位与HBc序列的76-85号氨基酸残基之间的一个位置形成肽键结合，并且存在HBc序列的76-85号位置的至少5个残基。
71.如权利要求70的免疫原性颗粒，其中，存76-85号氨基酸残基之间的HBc序列，但是被所述B细胞表位所间断。
72.如权利要求68的免疫原性颗粒，还包括一个肽键结合的异源T细胞表位。
73.如权利要求72的免疫原性颗粒，其中，所述T细胞表位与C-末端HBc氨基酸残基形成肽键结合。
74.如权利要求73的免疫原性颗粒，其中，所述C-末端半胱氨酸残基存在于HBc嵌合体蛋白分子的C-末端的5个氨基酸内。
75.如权利要求63的免疫原性颗粒，其中，所述重组嵌合体HBc蛋白分子的长度大约为135-大约515个氨基酸残基，并且包括4个肽键连接的氨基酸残基序列结构域，从N-末端开始这些结构域被命名为结构域I、II、III、和IV，其中(a)结构域I包括大约71-大约100个氨基酸残基，其序列至少包括HBc的从5号位置到75号位置的残基的序列，并且选择性地包括一个异源表位，该表位包括与HBc的1-4号残基之一形成肽键结合的最多大约30个氨基酸残基，(b)结构域II包括与结构域I的HBc75号残基形成肽键结合的大约5-大约250个氨基酸残基，其中(i)HBc的76-85号位置的序列中的0-全部残基与对HBc来说是异源的1个-大约245个氨基酸残基形成肽键结合，并且构成一个异源表位或用于偶联表位的异源接头残基，或(ii)HBc的76-85号位置的序列不含异源残基，(c)结构域III是与结构域II的85号残基形成肽键结合的从86号位置到135号位置的HBc序列，和(d)结构域IV包括(i)与结构域III的135号残基形成肽键结合的HBc氨基酸残基序列的136号位置到149号位置的0-14个残基，(ii)位于从该嵌合体分子的C-末端开始的大约30个残基内的1-10个半胱氨酸残基[C-末端半胱氨酸残基]，和(iii)与从150号位置到C-末端的HBc异源的序列中的0-大约100个氨基酸残基，其前提是，结构域IV包括至少6个氨基酸残基，其中包括上述(ii)的1-10个半胱氨酸残基，所述嵌合HBc蛋白具有一种氨基酸残基序列，其中HBc序列中不超过约10％的氨基酸残基被取代。
76.如权利要求75的免疫原性颗粒，它包括所述用于结构域II中的偶联表位的异源接头残基，还包括一个与所述异源接头残基连接的半抗原。
77.如权利要求76的免疫原性颗粒，其中，所述半抗原是B细胞免疫原。
78.如权利要求63的免疫原性颗粒，其中，所述重组嵌合体HBc蛋白分子的长度大约为大约175-大约240个氨基酸残基，并且它包括4个肽键连接的氨基酸残基序列结构域，从N-末端开始这些结构域被命名为结构域I、II、III、和IV，其中(a)结构域I包括HBc的大约1号位置到75号位置的残基的序列，(b)结构域II包括与结构域I的HBc75号残基形成肽键结合的大约5-大约55个氨基酸残基，其中，HBc的76-85号位置的序列中的至少4个残基与对HBc来说是异源的6-大约50个氨基酸残基形成肽键结合，并且构成一个异源表位，(c)结构域III是与结构域II的85号残基形成肽键结合的从86号位置到135号位置的HBc序列，和(d)结构域IV包括(i)与结构域III的135号残基形成肽键结合的HBc氨基酸残基序列的从136号位置到149号位置的5-14个残基，(ii)位于从该嵌合体分子的C-末端开始的大约30个残基内的1-大约5个半胱氨酸残基[C-末端半胱氨酸残基]，和(iii)与HBc从150号位置到C-末端异源的序列中的0-大约50个氨基酸残基，所述颗粒在280与260nm的波长下所表现出的吸光度比例为大约1.4-大约1.6，并且所述嵌合HBc蛋白具有一种氨基酸残基序列，其中HBc序列中不超过约5％的氨基酸残基被取代。
79.一种疫苗或接种物，它包括被溶解或分散在可以药用的稀释剂中的免疫原性有效量的免疫原性颗粒，其中，所述免疫原性颗粒由多个重组嵌合乙型肝炎核心(HBc)蛋白分子组成，其中，所述重组嵌合HBc蛋白分子的长度最多达大约515个氨基酸残基，它(a)包括具有HBc分子的N-末端150个氨基酸残基中的至少大约130个的HBc序列，该序列包括肽键结合的异源表位或用于存在于HBc免疫优势环中的偶联表位的异源接头残基，或具有N-末端150个HBc氨基酸残基中的至少大约135个残基的序列，(b)包括从HBc序列的C-末端残基到该分子C-末端的1-10个半胱氨酸残基，这些残基存在于所述嵌合体分子的C-末端的大约30个残基[C-末端半胱氨酸残基]内，和(c)包括具有从HBc的135号位置残基到HBc C-末端的至少5个氨基酸残基的序列，所述嵌合体分子在HBc序列中含有不超过20％的保守取代的氨基酸残基，所述颗粒基本上不结合核酸，并且这种颗粒比由缺乏上述C-末端半胱氨酸残基或者在嵌合体分子中存在的C-末端半胱氨酸残基被另一种残基所取代的在其他方面相同的HBc嵌合体产生的颗粒更稳定。
80.如权利要求79的疫苗或接种物，其中，所述重组嵌合HBc蛋白分子的长度为大约135-大约515个氨基酸残基，并且包括4个肽键连接的氨基酸残基序列结构域，从N-末端开始这些结构域被命名为结构域I、II、III、和IV，其中(a)结构域I包括大约71-大约100个氨基酸残基，其序列至少包括HBc的从5号位置到75号位置的残基的序列，并且选择性地包括一个异源表位，该表位包括与HBc的1-4号残基之一形成肽键结合的最多大约30个氨基酸残基，(b)结构域II包括与结构域I的HBc75号残基形成肽键结合的大约5-大约250个氨基酸残基，其中(i)HBc的76-85号位置的序列中的至少4个残基与对HBc来说是异源的1个-大约245个氨基酸残基形成肽键结合，并且构成一个异源表位或用于偶联表位的异源接头残基，或(ii)HBc的76-85号位置的序列不含异源残基；(c)结构域III是与结构域II的85号残基形成肽键结合的从86号位置到135号位置的HBc序列，和(d)结构域IV包括(i)与结构域III的135号残基形成肽键结合的HBc氨基酸序列的136号位置到149号位置的0-14个残基，(ii)位于从该嵌合体分子的C-末端开始的大约30个残基内的1-10个半胱氨酸残基[C-末端半胱氨酸残基]，和(iii)与从150号位置到C-末端的HBc异源的序列中的0-大约100个氨基酸残基，其前提是，结构域IV包括至少6个氨基酸残基，其中包括上述(ii)的1-10个半胱氨酸残基，所述重组嵌合HBc蛋白分子具有一种氨基酸残基序列，其中HBc序列中不超过约5％的氨基酸残基被取代。
81.如权利要求80的疫苗或接种物，它包括所述用于结构域II中的偶联表位的异源接头残基，还包括一个与所述异源接头残基连接的半抗原。
82.如权利要求79的疫苗或接种物，其中，所述重组嵌合体HBc蛋白分子的长度大约为175-大约240个氨基酸残基，并且包括4个肽键连接的氨基酸残基序列结构域，从N-末端开始这些结构域被命名为结构域I、II、III、和IV，其中(a)结构域I包括HBc的1-75号位置的残基的序列，(b)结构域II包括与结构域I的HBc75号残基形成肽键结合的大约5-大约55个氨基酸残基，其中，HBc的76-85号位置的序列中的至少4个残基与对HBc来说是异源的6-大约50个氨基酸残基形成肽键结合，并且构成一个异源表位，(c)结构域III是与结构域II的85号残基形成肽键结合的从86号位置到135号位置的HBc序列，和(d)结构域IV包括(i)与结构域III的135号残基形成肽键结合的HBc氨基酸残基序列的从136号位置到149号位置的5-14个残基，和(ii)与HBc从150号位置到C-末端异源的序列中的0-大约50个氨基酸残基，所述颗粒在280与260nm的波长下所表现出的吸光度比例为大约1.4-大约1.6。
83.如权利要求79的疫苗或接种物，它是适合肠胃外施用的。
84.如权利要求79的疫苗或接种物，它是适合粘膜免疫接种的。
85.如权利要求79的疫苗或接种物，其中，所述重组嵌合HBc蛋白分子颗粒存在于伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌或鼠伤寒沙门氏菌-大肠杆菌杂交体的减毒株中。
86.如权利要求79的疫苗或接种物，其中，所述重组嵌合HBc蛋白分子颗粒存在于植物组织中。
87.如权利要求79的疫苗或接种物，它还包括一种佐剂。
88.如权利要求87的疫苗或接种物，其中，所述所述佐剂是明矾。
89.如权利要求87的疫苗或接种物，其中，所述佐剂是选自胞壁酰二肽，7-取代的-8-氧或8-硫-鸟苷衍生物，单磷酸脂A，铝或钙盐。
90.如权利要求87的疫苗或接种物，其中，所述佐剂是与所述免疫原性颗粒和所述可以药用的稀释剂乳化的油。
91.如权利要求90的疫苗或接种物，其中，所述乳液是具有水相和油相的油包水乳液。
92.如权利要求90的疫苗或接种物，其中，所述乳液是具有水相和油相的水包油乳液。
93.如权利要求92的疫苗或接种物，其中，所述乳液的油相包括角鲨烯。
94.如权利要求92的疫苗或接种物，其中，所述乳液的油相包括角鲨烷。
95.如权利要求90的疫苗或接种物，其中，所述乳液的水相和油相是由山梨聚糖或二缩甘露醇C12-C24脂肪酸酯乳化剂乳化的。
96.如权利要求95的疫苗或接种物，其中，所述乳化剂是二缩甘露醇C12-C24脂肪酸酯。
97.如权利要求96的疫苗或接种物，其中，所述二缩甘露醇C12-C24脂肪酸酯的C12-C24脂肪酸是油酸。
98.一种编码权利要求1的重组HBc蛋白分子的核酸或其变体、类似物或互补体。
99.一种编码权利要求18的重组HBc蛋白分子的核酸或其变体、类似物或互补体。
100.一种编码权利要求42的重组HBc蛋白分子的核酸或其变体、类似物或互补体。
101.一种核酸分子，它包括一个与限定编码权利要求1的重组HBc蛋白分子的基因或其变体、类似物或互补体的核酸片段操作性连接的载体，和适合在相容的宿主生物中驱动所述基因表达的启动子。
102.一种核酸分子，它包括一个与限定编码权利要求18的重组HBc蛋白分子的基因或其变体、类似物或互补体的核酸片段操作性连接的载体，和适合在相容的宿主生物中驱动所述基因表达的启动子。
103.一种核酸分子，它包括一个与限定编码权利要求42的重组HBc蛋白分子的基因或其变体、类似物或互补体的核酸片段操作性连接的载体，和适合在相容的宿主生物中驱动所述基因表达的启动子。
104.一种用权利要求101的重组核酸分子转化的宿主细胞。
105.如权利要求104的转化的宿主细胞，其中，所述宿主细胞选自CHO、VERO、或COS细胞、大肠杆菌、酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母、伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌-大肠杆菌杂交体。
106.一种用权利要求102的重组核酸分子转化的宿主细胞。
107.如权利要求106的转化的宿主细胞，其中，所述宿主细胞选自CHO、VERO、或COS细胞、大肠杆菌、酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母、伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌-大肠杆菌杂交体。
108.一种用权利要求102的重组核酸分子转化的宿主细胞。
109.如权利要求108的转化的宿主细胞，其中，所述宿主细胞选自CHO、VERO、或COS细胞、大肠杆菌、酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母、伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌-大肠杆菌杂交体。
110.一种在接种的宿主动物体内诱导免疫反应的方法，该方法包括以下步骤用权利要求79的疫苗或接种物接种宿主动物，并且维持接种的动物一段足以使所述动物产生免疫反应的时间。
111.一种在接种的宿主动物体内诱导免疫反应的方法，该方法包括以下步骤用权利要求80的疫苗或接种物接种宿主动物，并且维持接种的动物一段足以使所述动物产生免疫反应的时间。
112.一种在接种的宿主动物体内诱导免疫反应的方法，该方法包括以下步骤用权利要求82的疫苗或接种物接种宿主动物，并且维持接种的动物一段足以使所述动物产生免疫反应的时间。
113.一种在接种的宿主动物体内诱导免疫反应的方法，该方法包括以下步骤用权利要求87的疫苗或接种物接种宿主动物，并且维持接种的动物一段足以使所述动物产生免疫反应的时间。
114.一种在接种的宿主动物体内诱导免疫反应的方法，该方法包括以下步骤用权利要求88的疫苗或接种物接种宿主动物，并且维持接种的动物一段足以使所述动物产生免疫反应的时间。
115.一种在接种的宿主动物体内诱导免疫反应的方法，该方法包括以下步骤用权利要求92的疫苗或接种物接种宿主动物，并且维持接种的动物一段足以使所述动物产生免疫反应的时间。
全文摘要
披露了一种嵌合的、羧基末端截短的乙型肝炎病毒核壳蛋白(HBc)，这种蛋白是通过工程方法产生的，以便具有增强的自我组装颗粒的稳定性，并且展示免疫原性表位。所述免疫原性表位的展示是在HBc的免疫原性环中展示的，而增强的自我组装颗粒的稳定性是通过在该嵌合体分子的羧基末端附近存在至少一个异源半胱氨酸残基而获得的。还披露了生产和使用这种嵌合体的方法。
文档编号C07H21/04GK101052414SQ01817391
公开日2007年10月10日 申请日期2001年8月16日 优先权日2000年8月16日
发明者A·J·比尔克特 申请人:塞尔德克斯医疗有限公司