专利名称：增强抗菌肽稳定性及其应用的方法
技术领域：
本发明涉及生物工程技术领域，尤其是一种增强抗菌肽稳定性及其应用的方法。
背景技术：
全世界每年由农作物病害引起的经济损失损失高达七千亿美元(Borlaug NE，2000，The Green Revolution Revisited and the RoadAhead，Special 30thAnniversary Lecture，The Norwegian Nobel Institute，Oslo，Norway)。使用化学农药带来的污染已引起公众的广泛关注。通过基因工程手段增强植物的抗病性成为控制作物病害的新型策略之一。大量体外实验证实，抗菌肽如蛙皮素(magainin)、杀菌肽(cecropin)等具有广谱抗菌活性，转抗菌肽基因植株显示较高的抗病力.然而，抗菌肽容易受到植物体内蛋白酶的降解，转基因植株的抗菌活性不稳定，限制了该策略的实际应用(Osusky M，2004，Transgenic Res.13181-190)。人们试图通过突变的方式去除抗菌肽中蛋白酶敏感位点，以提高magainin的稳定性，但在转基因植株中仍然难以检测到重组多肽的存在(Li Q，2001，Planta，212635-639)。
发明内容
为了克服抗菌肽容易被植物体内酶降解，不稳定的缺点。本发明提供了一种增强抗菌肽稳定性及其应用的方法，该方法能够使抗菌肽在植物体内稳定存在，使转抗菌肽基因植物具有较高的，稳定的抗病力。
本发明为了达到上述目的，本发明提供了一种增强抗菌肽稳定性及其应用的方法，在抗菌肽的N-末端融合一四肽、其具有SEQ ID NO1的序列。
所述的SEQ ID NO1突变序列在抗菌肽修饰加工中的应用。该方法能够使抗菌肽在植物体内稳定存在，使转抗菌肽基因植物具有较高的，稳定的抗病力。
本发明所采用的技术方案是在抗菌肽的氮末端融合一个主要由疏水性氨基酸组成的四肽LLGD。新融合多肽由于氮末端疏水相互作用形成寡聚体，因而能在植物体内稳定存在。采用引物设计的方法将该四肽的碱基序列融合到抗菌肽基因的上游，并将其插入到植物表达载体pBin438中，通过根瘤农杆菌介导的叶盘法，将该基因转入烟草的基因组中，该融合多肽能在植物中稳定表达，该转化植株有较强的抗菌能力。
本发明的有益效果是该抗菌肽一方面能在植物体内稳定存在，一方面其抗菌活性不受影响，利于抗菌肽的实际应用。
具体实施例方式
实施例1蛙皮素融合基因的合成；根据蛙皮素多肽和加入的四肽氨基酸序列，选择植物偏好密码子合成部分互补的两条寡核苷酸链，再用Over lap PCR法将两条寡核苷酸链扩增出完整的双链蛙皮素融合基因片段(SEQ ID NO2)，该片段两端分别含有一个限制性内切酶切割位点。其编码的氨基酸序列如SEQID NO3所示。
实施例2.转基因植株的获得；融合基因片段和植物表达载体pBin438分别用BamH I和Sal I双酶切，回收融合基因片段和载体，T4DNA连接酶进行体外连接，转化感受态DH5α，在kan抗性板上挑选阳性克隆，小量提取质粒，经酶切鉴定确证。用冻融法将重组质粒转入农杆菌LBA4404.取烟草无菌苗的嫩叶片，用刀切成约0.5厘米的小方块，在含有表达载体的农杆菌悬液中浸泡5-10分钟，然后用无菌滤纸吸干，将叶片摆放在共培养的培养基中，(上面铺两层无菌滤纸)于25℃避光共培养3天后，将叶片转移到选择培养基中，于25℃光照培养箱(光照12小时，黑暗12小时)中培养至抗性芽的出现。将2-3厘米长的抗性芽移到生根的培养基中，一星期逐渐长出根。待小苗长到5-6厘米高时，移栽到含有营养土的小塑料钵中。
实施例3烟草蛋白的提取及Western blot分析；取新鲜的烟草叶片，加液氮研成粉末，再加入提取缓冲(50mmol/LTris-HCl(pH7.5)，50mmol/L NaCl，400mmol/L蔗糖，5mmol/L EDTA，1mmol/L DTT)，研成匀浆，每0.5g叶片加入0.5mL蛋白提取缓冲液，煮沸3分钟，10000r/min离心10分钟(4℃)后，取上清液备用。15％SDS-PAGE分离植物蛋白，一抗为鼠抗蛙皮素多克隆抗体，二抗为HRP-标记的羊抗鼠1gG，Western blot分析按照常规程序进。所有的被检测植株都检测到目标多肽，且多以多聚体的形式存在。
实施例4
抗菌实验；供试菌种为Pseudomonas aeruginosa接种于3ml LB基中，27℃振荡培养12小时，6000×g离心5min，去上清，沉淀用pH7.4的酸缓冲液冲洗两次，稀释成105个集落形成单位(CFU)/mL备用。500μg转基因烟草叶片蛋白粗提液加入200μL的菌悬液中，27℃振荡培养24小时，取100μL反应混合物平铺于LB平板上，培养16小时，计CFU数。结果发现6株未转化烟草平均CFU为本1913±97个，蛙皮素转基因植株为1645±104个，转蛙皮素融合基因植株为887±43个。
序列表SEQ ID NO1的信息序列长度4个氨基酸残基序列类型氨基酸分子类型肽序列描述SEQ ID NO11 LLGDSEQ ID NO2的信息序列长度84bp序列类型核酸分子类型cDNA序列描述SEQ ID NO21 CTCCTGCAAG ACCAGATTCA GAAGTTCCTC CACAGCGCAC51 AAAAGTTCCA AAAGGCGTTC GTACAAGAGA TCATGAACAA
81 GAGCSEQ ID NO3的信息序列长度28个氨基酸残基序列类型氨基酸分子类型肽序列描述SEQ ID NO21 LLGDGIGKFLHSAGKFGKAFVGEIMNKS
权利要求
1.增强抗菌肽稳定性及其应用的方法，其特征在于在抗菌肽的N-末端融合一四肽、其具有SEQ ID NO1的序列。
2.根据权利要求1所述的增强抗菌肽稳定性及其应用的方法，其特征在于所述的SEQ ID NO1突变序列在抗菌肽修饰加工中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种增强抗菌肽稳定性及其应用的方法，在抗菌肽的N－末端接上4个氨基酸残基，构成融合抗菌肽，编码此多肽的融合基因可以合成，并插入植物表达载体，可以产生此融合基因转化的植物该融合多肽能抵抗植物体内酶的降解，转化植物显示疾病抵抗力。
文档编号C07K1/00GK1765930SQ20041009022
公开日2006年5月3日 申请日期2004年10月26日 优先权日2004年10月26日
发明者杨应华 申请人:杨应华