专利名称：一种玉米固相2de总蛋白质的制备方法
技术领域：
本发明属于农业领域中粮食作物种质资源的分子生物学基础研究，涉及玉米蛋白质组学研究中的总蛋白提取和纯化方法，特别涉及一种玉米固相2DE总蛋白质的制备方法。
目前种子蛋白质的命名主要是根据T.B.Osborne的分类，按种子蛋白质不同溶解特性进行分类，可将蛋白质分为如下4种类型1.清蛋白这种蛋白质能溶解于水，包括大多数的酶蛋白，通常可用同工酶电泳法进行鉴定。
2.球蛋白这种蛋白质能溶于稀盐溶液，主要存在于膜结合的蛋白体中，严格概念上它也称为贮藏蛋白。目前，我国应用最多的玉米种子盐溶蛋白电泳鉴定是对球蛋白进行品种鉴定。
3.醇溶蛋白这种蛋白质能溶于醇类溶液，也是贮藏蛋白。目前国际上和ISTA广泛应用的小麦和大麦种子醇溶蛋白电泳，就是利用这种蛋白进行品种电泳鉴定。
4.谷蛋白这种蛋白质能溶于稀碱和稀酸溶液中，主要为结构蛋白，目前应用的核酸电泳是对这种蛋白进行品种和遗传鉴定。
上述4种蛋白质的氨基酸成分特征特性方面均表现不同，而且在不同种子中其各种蛋白质类型的比例在不同植物之间也有差异。如小麦、大麦、玉米、黑麦等谷类种子含有较高的醇溶谷蛋白。
植物组织含有大量的蛋白质和碳水化合物，如多糖、单糖、酯肪、色素、核酸(DNA和RNA)，还有小分子量的磷酸苷、核苷等，这些物质的单一或相互作用均能影响固相IEF的正常进行。
另外，提取液中盐的浓度亦是影响固相干胶条IEF正常聚焦的重要因素。它们必须一一清除，才能做好IEF电泳，进而继续进行SDS-聚丙烯酰胺第二维电泳。以玉米为供试材料，制备总蛋白质，尤其要消除酯肪、色素、核酸等含量较多的阻抑蛋白质进行IEF的物质。
然而，固相干胶条2DE研究蛋白质的报道，主要集中在医学研究方面。在农作物方面固相2DE蛋白质组研究鲜为报道，特别是有关玉米蛋白质组制备的简单有效的方法还未见有全面系统的报道，
申请人通过对动物、微生物和人类蛋白质包括氨基酸的提取方法和过程进行了深入的研究，通过比较常规的植物蛋白提取与动物、微生物和人类IEF蛋白质提取的差异，选择出了具有提取和纯化蛋白质共性的试剂和具有排除抑阻物的特异性的试剂；从而可以设计一种玉米固相2DE总蛋白质的制备方法。
为了实现上述目的，本发明技术方案是，首先遴选纯化蛋白质的多效试剂，在此基础上再优化组配提取和纯化的步骤。将常规的先提取蛋白质后纯化的方法，改为纯化和提取同时进行，以减少操作过程，达到少损失蛋白质的目的。尽量少用蛋白酶(也是蛋白质)抑制剂，尽可能不为被提取蛋白质组增加外来蛋白质。并按以下步骤进行1)在植物材料中加植物组织研磨剂I进行研磨，破碎植物组织和细胞，释放蛋白质，并使多种蛋白酶变性失活；2)加植物组织研磨剂II，研磨、浸提，使试剂充分与非蛋白物质结合；3)离心使蛋白质沉淀，弃上液，沉淀风干，获得含有植物部分组织的蛋白质干粉；4)用蛋白质提取液I、II、III，从蛋白质干粉中提取蛋白质；5)离心，上清中含蛋白质，分装，冷冻备用；上述植物组织研磨剂I为40mmol/L Tris；上述植物组织研磨剂II为40mmol/L Tris，15％PVP，4％NP-40，0.075％DTT，D/R-Nase，各0.1g/L；上述蛋白质提纯液I为丙酮，10％乙腈，10％三氯乙酸，0.075％DTT；上述蛋白质提纯液II为丙酮，10％乙腈，0.075％DTT；上述蛋白质提纯液III为丙酮；上述蛋白质提取液I为40mmol/L Tris；上述蛋白质提取液II为7M尿，2M硫尿，3％CHAPS，2％两性电解质pH3-10，1％DTT。
具体工艺步骤是
(1)研磨①称取植物组织；②按1g植物组织加200μl的比例，加入植物组织研磨剂I，研磨；③按1g植物组织加1ml的比例，加入植物组织研磨剂II，研磨；④在4℃条件下静置40min；(2)纯化①按上述研磨液体积的3倍加蛋白质提纯液I，振动，摇均匀，-20℃过夜；②沉淀蛋白质，在40000g，4℃，离心1h，弃上液；③在蛋白质沉淀中加入蛋白质提纯液II，使其充分溶解，振动，摇均匀，-20℃静置1h；④沉淀蛋白质，4℃，40000g离心1h，弃上液；⑤在蛋白质沉淀中加入蛋白质提纯液III，使其溶解，振动，搖均匀，-20℃静置1h；⑥真空干燥后，-20℃保存备用。
(3)提取①准确称量纯化后的蛋白质干粉；②按1∶2.5的比例加入蛋白质提取液I，充分振动，4℃浸提1h；③加入10倍于植物组织蛋白质提取液I量的蛋白质提取液II，充分振动，4℃浸提过夜；④分离蛋白质，4℃下，40000g离心1h；⑤吸取上清，分装，-20℃保存备用。
本发明的玉米固相2DE总蛋白质的制备方法，在操作过程中保证了蛋白质组中蛋白质的损失被降低到最低程度，不含植物组织细胞裂解酶和蛋白质酶抑制剂，提取的蛋白质盐离子浓度低，脂肪、多糖、色素等浓度亦很低，能满足2DE对蛋白质纯度的要求。具有如下特点1)不含植物组织细胞裂解酶和蛋白质酶抑制剂，不增加蛋白质组中的有关蛋白质丰度；2)蛋白质的纯化始于植物细胞的破碎过程，因此减少了纯化的步骤，降低了蛋白质损失的机率；3)蛋白质的纯化早于蛋白质的提取过程，在低浓度蛋白质的情况下，其操作过程中的蛋白质损失(如试管壁的粘污)低于高浓度蛋白质情况下的损失；4)蛋白质的纯化和提取，始终是在抑制各种蛋白质分解酶的情况下进行，减少了各种酶对蛋白质的水解。
具体实施例方式
以下结合发明人给出的具体实施例对本发明作进一步的详细描述。该实施例仅是本发明较佳的实施例，本发明不限于这些实施例。
实施例玉米籽粒蛋白质组的制备1)取浸泡3h～24h的玉米籽粒，1粒，剥胚，置于1.5ml离心管中；2)在1.5ml离心管中加入20μl研磨剂I，在冰水中研磨，冲击200次；3)加50μl研磨剂II，再研磨，冲击100次，4℃下静置40min；4)加0.75ml蛋白质提纯液I，-20℃过夜；5)在4℃下，40000g离心1h，弃上液；6)加蛋白质提纯液II 1ml溶解沉淀，充分混合后静置1h；7)在4℃下，40000g离心1h，弃上液；8)加蛋白质提纯液III 1ml溶解沉淀，充分混合后静置0.5h；
9)在4℃下，40000g离心40min；10)真空干燥后，-20℃保存备用；11)准确称取实施例中经真空干燥后的初提干燥蛋白质粉0.02g，置入试管中；12)加100μl，蛋白质提取液I，充分振动，浸提2h；13)加900μl蛋白质提取液II，室温提取2h，4℃过夜；14)室温(10℃～15℃)下，40000g离心40min；15)上清液分装，-20℃保存备用。
对上述实施例提取的玉米籽粒蛋白质溶液10μl加1ml蒸馏水的比例稀释后，在可见紫外分光光度计上测定，其蛋白质含量高，杂质少(260nm与280nm比例小于0.7)，核酸含量低(参见表1)，能满足2DE电泳对蛋白质纯度的要求。
表1蛋白质及核酸含量的测定
对上述实施例提取的玉米籽粒蛋白质进行IEF，按照Ettan Ipgphor等电聚焦系统操作指南进行，在30V，20℃，水化固相干胶条时，电流正常值为1μA；正式聚焦后最高电压可达7000V～8000V，聚焦电压时间积可达30000VhT以上。
权利要求
1.一种玉米固相2DE总蛋白质的制备方法，其特征在于，首先遴选出纯化蛋白质的具有多效性的单一试剂；其次优化组配成工作液，试剂包括植物组织研磨剂I、II，蛋白质提纯液I、II、III和蛋白质提取液I、II；第三将纯化和提取同时进行，按以下步骤进行1)在植物材料中加植物组织研磨剂I进行研磨，破碎植物组织和细胞，释放蛋白质，并使多种蛋白酶变性失活；2)加植物组织研磨剂II，研磨、浸提，使试剂充分与非蛋白物质结合；3)离心，使蛋白质沉淀，弃上液，风干，获得含有植物部分组织的蛋白质干粉；4)用蛋白质提取液从蛋白质干粉中提取蛋白质；5)离心，上清中含蛋白质，分装，冷冻备用；上述植物组织研磨剂I为40mmol/L Tris；上述植物组织研磨剂II为40mmol/L Tris，15％PVP，4％NP-40，0.075％DTT，D/R-Nase，各0.1g/L；上述蛋白质提纯液I为丙酮，10％乙腈，10％三氯乙酸，0.075％DTT；上述蛋白质提纯液II为丙酮，10％乙腈，0.075％DTT；上述蛋白质提纯液III为丙酮；上述蛋白质提取液I为40mmol/L Tris；上述蛋白质提取液II为7M尿，2M硫尿，3％CHAPS，2％两性电解质pH3-10，1％DTT。
2.如权利要求1所述的玉米固相2DE总蛋白质的制备方法，其特征在于，所述纯化和提取具体工艺步骤是(1)研磨①称取植物组织；②按1g植物组织加200μl的比例，加入植物组织研磨剂I，研磨；③按1g植物组织加1ml的比例，加入植物组织研磨剂II，研磨；④在4℃条件下静置40min；(2)纯化①按上述研磨剂体积的3倍加蛋白质提纯液I，振动摇均匀，-20℃过夜；②沉淀蛋白质，在40000g，4℃，离心1h，弃上液；③在蛋白质沉淀中加入蛋白质提纯液II，使其充分溶解，振动摇匀，-20℃静置1h；④沉淀蛋白质，4℃，40000g离心1h，弃上液；⑤在蛋白质沉淀中加入蛋白质提纯液III，使其溶解，振动摇匀，-20℃静置1h；⑥真空干燥后，-20℃保存备用。(3)提取①准确称量纯化后的蛋白质干粉；①按1∶2.5的比例加入蛋白质提取液I，充分振动，使蛋白质溶解，4℃浸提1h；③加10倍于蛋白质提取液I溶液量的蛋白质提取液II，充分振动，4℃浸提过夜；④分离蛋白质，4℃下，40000g离心1h；⑤吸取上清，分装，-20℃保存备用。
全文摘要
本发明涉及玉米固相2DE总蛋白质的制备方法，首先遴选出纯化蛋白质的具有多效性的单一试剂；其次优化组配成研磨剂、纯化剂和提取剂；第三将纯化和提取同时进行。制备过程为1)在植物材料中加植物组织研磨剂破碎植物组织和细胞，释放蛋白质，并使绝大多数蛋白酶变性失活；2)加研磨剂浸提，使不同试剂充分与不同非蛋白物质结合；3)加蛋白质提取液，离心，使蛋白质与非蛋白物质分离，沉淀；风干，获得含有植物部分组织的蛋白质干粉；4)提取液提取蛋白质；5)离心，上清中含蛋白质，分装，冷冻备用。本发明不含植物组织细胞裂解酶和蛋白质酶抑制剂，提取的蛋白质盐离子浓度低，脂肪、多糖、色素等浓度亦很低，能满足2DE对蛋白质纯度的要求。
文档编号C07K1/14GK1456572SQ03134230
公开日2003年11月19日 申请日期2003年6月2日 优先权日2003年6月2日
发明者李维平, 王波, 赵文明 申请人:西安交通大学