专利名称：玉米油份含量相关的衣被蛋白复合体(copⅱ)基因位点及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及玉米油份含量相关的衣被蛋白复合体(COPII)基因位点及应用，属于玉米育种和分子生物学领域。
背景技术：
高油玉米的籽粒油份含量超过6%，高油玉米不仅是人类健康食品与优质动物饲料，而且还是重要的工业原料。玉米油富含较多的油酸、亚油酸等不饱和脂肪酸，对人体健康具有重要作用，因此又称为健康油。同时利用高油玉米籽粒作为饲料可以显著提高牲畜的产肉率。而且高油玉米秸杆富含粗蛋白和其他营养成分，也是食草动物良好的青贮饲料。
玉米籽粒油脂常以三酰甘油(TAG)即在甘油骨架上附连三个脂肪酸的形式存在。 其基本过程乙酰辅酶A经乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)催化形成丙二酰单酰辅酶A.这是脂肪酸合成的第一关键步骤，也是调控整个脂肪酸合成的限速步骤。然后脂肪酸合成酶(FAS) 以丙二酰单酰辅酶A为底物进行连续的聚合反应，以每次循环增加2个碳链的频率合成酰基碳链。而不断增加的酰基碳链又与酰基载体蛋白(ACP)结合，ACP负责转运脂肪酸合成途径中的中间产物。经过数次聚合反应后，脂肪酸的合成在酰基-ACP硫酯酶或酰基转移酶的作用下终止。终止聚合反应后，不同碳链长度的酰基ACP，在酰基辅酶A合成酶的作用下生成酰基辅酶A，并从质体转运到内质网或胞质中。最后利用储存在胞质中的酰基辅酶A， 在内质网中通过3种不同的酰基转移酶(甘油-3-磷酸酰基转移酶GPAT、溶磷脂酸酰基转移酶LPAAT、二酰甘油酰基转移酶DGAT)。在甘油上附连脂肪酸以合成三酰甘油，并储存在不连续分布的亚细胞器油体中。另外，脂肪酸合成后经过不同的修饰方式合成长链脂肪酸和多不饱和脂肪酸。
近年来，随着大量植物全基因组测序的完成，植物基因组学的研究已经呈现出由简单质量性状向复杂的数量性状转移的趋势，特别是大量SNP标记的开发以及生物信息学的迅猛发展，应用关联分析方法发掘植物数量性状基因已成为目前国际植物基因组学研究的热点之一。关联分析(Association Analysis),又称连锁不平衡作图(LD Mapping)或关联作图(Association Mapping),是一种以连锁不平衡为基础鉴定某一群体内目标性状与遗传标记或候选基因关系的分析方法(Flint-Garcia et al，2003)。跟连锁分析相比， 关联分析具有以下优点(I)连锁分析需要构建基于两亲本杂交的Fl衍生群体(F2、BC、 RIL等)，关联分析可用现有的群体，大大缩短研究年限；(2)连锁分析每次只能分析同一位点的2个等位基因，关联分析可以同时分析同一位点的多个等位基因；(3)连锁分析所用的群体小，加上群体来自两亲本，在群体内发生的重组次数少，这样往往导致连锁作图的精度低，例如玉米的作图精度一般为10 30cM(Salvi，2005 ;Flint_Garcia，2005，而关联分析的精度可大大提高，例如玉米自交系的精度为1500bp，达到单基因水平(Remington， 2001)。发明内容
本发明的目的之一是通过以下技术方案来实现的
AM508群体由473个普通玉米自交系和35个高油玉米自交系组成(所述的群体材料，均为常见的玉米市售材料，可通过常规商业渠道购买得到)。候选基因重测序材料: 155份我国骨干自交系材料。从授粉15天后的AM508份自交系中随机选择368份自交系， 构建200bp大小插入片段文库，采用90bp末端配对的RNA测序技术进行转录组测序。每个个体的reads数为73. 8±0. 7百万碱基，共产生了 2445. 9Gb的原始数据。
全基因关联分析以AM508群体为材料,利用Illumina MaizeSNP50BeadChip对 56，110个位点进行了基因型检测。从授粉15天后的508份材料中随机选择的368份材料则构建200bp大小插入片段文库，采用90bp末端配对的RNA测序技术进行转录组测序，每个个体的reads数为73. 8±0. 7百万碱基，共产生了 2445. 9Gb的原始序列。
使用高质量的SNP，分别对这两个群体采用线性混合模型校正群体层化效应和亲缘关系后与油脂相关性状进行了高密度标记的全基因组关联分析。为了综合这两个群体的结果，本研究研究使用了统一的阈值筛选显著性的位点(建议水平显著性阈值为1/N =1.78X IO-6以及5%基因组显著性阈值为0. 05/N = 8. 94X10^)。为了在较多的显著关联信号中鉴定到唯一可能的因果突变基因，计算同一染色体上的显著性信号位点间两两的连锁不平衡，过滤掉r2小于O. 02的标记。在定位到的单一的显著性信号中。
衣被蛋白复合体基因(COPII)位于玉米第8条染色体(GRMZM2G003022)。利用368 份材料关联分析结果发现，位于玉米参考基因组上chr8. S_38521846的SNP位点，突变为G/ T，其中G为主要等位基因，T为最小等位基因，最小等位基因的频率为O. 06，该SNP位点与玉米油份显著相关，该SNP位点与玉米衣被蛋白复合体基因(COPII)基因(GRMZM2G003022) 紧密连锁。
玉米基因序列通过比对B73参考序列获得,利用Primer Premier 5和Primer 3 设计引物扩增全长，利用MUSCLE软件和BioEdit软件进行多序列处理和比对，利用TASSEL2.O. I软件提取SNP和InDel，同时通过1000次排列检验计算多态性间的r2值，采用F测验计算两个显著性信号位点间两两的连锁不平衡。根据COPII基因的InDel_20功能位点开发的标记序列如下
PCR分子标记序列
5' -GCCGAGGTCCAGCCGTAGT-3'
5' -GGCGAGGCCTGGAGAGAA-3,
测序引物序列
ZmCOPII Rl
5' -AAATACCTAACCGCGACGAC-3'
5' -GCCATCATCAATCCAGGG-3'
ZmCOPII R2
5' -CACAGTGCCATTTCGATCA-3'
5' -TAATACCAAGGGCAACCTCTAC-3'
ZmCOPII R3
5' -TGGAAACAAGTCGCCTACC-3'
5' -AGTGTAGGCCATGTCTGGTG-3'
ZmCOPII R4
5' -TGTGGCACGGGAGTTTTC-3'
5' -GGCTTTACCCTCAATATCGTCT-3'
下面结合附图对本发明的具体实施例作进一步详细的说明。
图Ia展示的是ZmCOPII基因内多态性位点与不同地区的油脂表型的关联分析的结果。X轴为该基因的长度(bp)，其起始密码子定义为lbp。Y轴为对线性混合模型计算得到的显著性P值取负的以10为底的对数值。
图Ib ZmCOPII基因的结构及其功能结构域图示。填充的黑色方块表示外显子，无色的方块表示UTR区域，黑色虚线展示本研究中已测序的区域。黄色的椭圆形显示的是该基因的功能域。InDel_20表示O或20bp的插入。R1、R2、以及R3、R4为用以测序的扩增序列片段。图Ic为显著关联区域内的标记间两两配对的连锁不平衡展示图。每一个方块内的颜色对应于脚注中不同颜色所代表的r2值。紫色星形指示了最显著相关位点的位置。
图Id授粉15天后ZmCOPII基因表达水平与油脂含量的相关性分析图。X轴为标准化后的ZmCOPII基因的表达水平，Y轴为油脂的含量。r值为泊松相关系数值
图Ie InDel_20位点不同等位基因型对应的标准化后的ZmCOPII基因的表达水平。P值为双尾检测的显著性结果。
图If k22/单340F2 :3群体QTL定位结果，X轴为遗传图谱的位置，Y轴为LOD值。 灰线代表显著性阈值(L0D = 2. 5)。
具体实施方式
以下将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述；应当理解，优选实施例仅为了说明本发明，而不是为了限制本发明的保护范围。
AM508群体由473个普通玉米自交系和35个高油玉米自交系组成，已在参考文献 Yang, X. H. et al. Characterization of a global germplasm collection and its potential utilization for analysis of complex quantitative traits in maize. Mol. Breeding 121,417-431 公开过。
候选基因重测序材料155份我国骨干自交系材料，已在参考文献Yang, X. H. et al. Genetic analysis and characterization of a new maize association mapping panel for quantitative trait loci dissection. Theor. Appl. Genet. 121, 417-431 (2010a).公开过。
转录组测序材料从授粉15天后的AM508份自交系中随机选择368份自交系，构建200bp大小插入片段文库，采用90bp末端配对的RNA测序技术进行转录组测序。每个个体的reads数为73. 8±0. 7百万碱基，共产生了 2445. 9Gb的原始数据。
表型变异
AM508群体包含508个自交系(其中包括35个高油品系)油含量相关的变异丰富，软脂肪酸含量差异2. 3倍，硬脂肪酸含量差异达8倍。软脂肪酸(16: 0，15. 7% )、硬脂肪5酸(18:0,2. 1%)、油酸(18:1，28.0%)、亚麻油酸(18:2,51. 2% )和亚麻酸(18:3,1.4%) 这五种脂肪酸占98. 4%的油含量。4个环境联合检测发现十个油份相关性状的遗传力均在 90%以上。
全基因关联分析
以AM508 群体为材料,利用 Illumina MaizeSNP50BeadChip 对 56，110 个位点进行了基因型检测。从授粉15天后的508份材料中随机选择的368份材料则构建200bp大小插入片段文库，采用90bp末端配对的RNA测序技术进行转录组测序，每个个体的reads数为73. 8±0. 7百万碱基，共产生了 2445. 9Gb的原始序列。
研究使用了 106万个高质量的SNP，分别对这两个群体采用线性混合模型校正群体层化效应和亲缘关系后与油脂相关性状进行了高密度标记的全基因组关联分析。为了综合这两个群体的结果，本研究研究使用了统一的阈值筛选显著性的位点(建议水平显著性阈值为1/N = 1.78X10-6以及5%基因组显著性阈值为0. 05/N = 8. 94Χ1(Γ8)。为了在较多的显著关联信号中鉴定到唯一可能的因果突变基因，计算同一染色体上的显著性信号位点间两两的连锁不平衡，过滤掉r2小于O. 02的标记。在定位到的单一的显著性信号中，有若干个位点位于或者临近于(50Kb)被前人证实报道过的已知基因内，它们在本研究中再次得到了验证。与已知的油脂代谢相关基因较远的关联位点很可能是与油脂代谢相关基因紧密连锁，则距离最近的油脂代谢基因很可能就是本研究的候选基因。
衣被蛋白复合体基因(COPII)位于玉米第8条染色体(GRMZM2G003022)。利用368 份材料关联分析结果发现，该基因位于chr8. S_38521846的SNP位点，突变为G/T，其中G为主要等位基因，T为最小等位基因，最小等位基因的频率为O. 06，该位点与玉米油份显著相关，该SNP位点与玉米油分含量显著关联，解释17. 6%的表型变异。
候选基因重测序
玉米基因序列通过比对B73参考序列获得(www. maizesequence. org),利用 Premier 5(www. PremierBiosoft. com)和 Primer 3(http://frodo. wi. mit. edu/ primer3/)设计引物扩增全长，利用MUSCLE软件和BioEdit软件进行多序列处理和比对，利用TASSEL 2. O. I软件提取SNP和InDel，同时通过1000次排列检验计算多态性间的r2值， 采用F测验计算两个显著性信号位点间两两的连锁不平衡。
测序引物序列
ZmCOPII Rl
5' -AAATACCTAACCGCGACGAC-3'
5' -GCCATCATCAATCCAGGG-3'
ZmCOPII R2
5' -CACAGTGCCATTTCGATCA-3'
5' -TAATACCAAGGGCAACCTCTAC-3'
ZmCOPII R3
5' -TGGAAACAAGTCGCCTACC-3'
5' -AGTGTAGGCCATGTCTGGTG-3'
ZmCOPII R4
5' -TGTGGCACGGGAGTTTTC-3'
5' -GGCTTTACCCTCAATATCGTCT-3'
根据COPII基因的功能位点InDel_20开发的标记序列如下
PCR分子标记序列
5' -GCCGAGGTCCAGCCGTAGT-3'
5' -GGCGAGGCCTGGAGAGAA-3'
重测序结果显示，COPII基因在5’ UTR区域具有一个20bp的InDel多态性，利用 AM508群体进行关联分析显示，该位点与油分含量显著关联，并解释9. 75%的表型变异。通过QTL定位研究也得到相同的结论。
玉米COPII基因多态性位点及AM508群体关联分析结果
权利要求
1.玉米油份含量相关的衣被蛋白复合体(COPII)基因位点分子标记，其特征在于，所述的相关分子标记具体位点位于玉米参考基因组(WWW. maizesequence. org,5a. 60版)chr8. S_38521846的SNP，该位点突变为G/T，以及位于玉米COPII基因(GRMZM2G003022)5> UTR区域InDel_20位点，上述位点与玉米油分含量显著相关。
2.如权利要求I所述的分子标记的应用，其特征在于，该应用包括以下步骤 a)由473个普通玉米自交系和35个高油玉米自交系组成AM508群体； b)从授粉15天后的AM508份自交系中随机选择368份自交系,构建200bp大小插入片段文库，采用90bp末端配对的RNA测序技术进行转录组测序。
3.如权利要求I所述的玉米衣被蛋白复合体(COPII)基因分子标记的特异性扩增引物序列，其特征在于所述COPII基因的InDel_20功能位点开发的PCR分子标记序列为5' -GCCGAGGTCCAGCCGTAGT-3'5' -GGCGAGGCCTGGAGAGAA-3'。
4.如权利要求I或2所述的玉米油份含量相关的衣被蛋白复合体(COPII)基因位点分子标记的应用，其特征在于玉米基因序列通过比对B73参考序列获得，利用Primer 5和Primer 3设计引物扩增全长，利用MUSCLE软件和BioEdit软件进行多序列处理和比对，利用TASSEL 2.0. I软件提取SNP和InDel，同时通过1000次排列检验计算多态性间的r2值，采用F测验计算两个显著性信号位点间两两的连锁不平衡。
5.如权利要求I或2所述的与玉米油份相关的SNP位点及玉米衣被蛋白复合体(COPII)基因功能分子标记在玉米育种的应用。
全文摘要
本发明涉及与玉米油份含量相关的衣被蛋白复合体(COPII)基因位点及应用，属于分子育种领域。本发明的玉米油份相关的位点为玉米参考基因组(www.maizesequence.org，5a.60版)位于chr8.S_38521846的SNP位点，该位点突变为G/T；以及位于玉米衣被蛋白复合体COPII基因(GRMZM2G003022)5’UTR区域InDel_20位点。可将分子标记用于玉米品种或品系的基因型检测，以判断该品种或品系油份含量的大小。本发明采用分子标记辅助选择不仅准确性高，加快选择进度，提高了育种效率。
文档编号C12Q1/68GK102978203SQ20121044471
公开日2013年3月20日 申请日期2012年11月9日 优先权日2012年11月9日
发明者严建兵, 杨小红, 李建生, 李慧 申请人:华中农业大学