专利名称：短瓣金莲花总黄酮和几种高纯度药用物质的制备工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及中药有效成分的分离纯化方法，即提供一种从短瓣金莲花中提取总黄酮并且从总黄酮中分离纯化高纯度荭草苷、牡荆苷和槲皮素-新橙皮糖苷的制备工艺。
背景技术：
金莲花又名旱金莲，是毛茛科植物金莲花(Trollius ledebouri Reichb)的干燥花，以东北、华北和内蒙古为主产。金莲花始见于《本草纲目拾遗》，对革兰氏阳性球菌和革兰氏阴性杆菌、甲型链球菌、卡他氏茵、绿脓杆菌、大肠杆菌、痢疾杆菌等有明显的抑制作用。临床主要用于治疗急性阑尾炎、细菌性痢疾、上呼吸道感染、泌尿系感染等。其主要的化学成分为生物碱、黄酮、有机酸、挥发油等，其中黄酮类化合物为其主要活性成分，如荭草苷(orientin)、牡荆苷(vitexin)和槲皮素-新橙皮糖苷(quercetin-3-O-neohesperidoside)等[辛春兰，潘海峰.金莲花的研究进展.承德医院学报，2003，20(4)348；黄文哲，王磊，等.短瓣金莲花化学成分的研究.中草药，2000，31(10)731；康少文，于永芳，等.金莲花化学成分的研究.中草药，1984，15(6)247]。它们的结构式如下 荭草苷
牡荆苷 槲皮素-新橙皮糖苷用大孔吸附树脂纯化金莲花总黄酮亦有报道，但所得总黄酮含量较低(低于40％)，同时未见有制备色谱技术用于金莲花中高纯度单体化合物分离制备的报道，也未见有相关专利。
目前，国内外多为采用柱色谱法和重结晶等传统的分离制备方法分离植物中的有效单体，费时费力、污染环境[C.L Ky，M.Noirot，S.Hamon，J.Agric.Food.Chem.1997，45786；W.M.Yan，Acta Botanica Sinica，1979，2054；J.J Liu，G.L.Zhao，H.Wang，X.H.Zhang，J.Cent.South.Univ.T.2002，9246]，而且所用固定相对样品有不可逆性吸附作用等不足之处。
因此，人们对采用效果更好的分离技术来解决上述问题存在需求。本发明的目的是提供一种从短瓣金莲花中提取纯度高于60％的总黄酮和几种高纯度药用单体(荭草苷、牡荆苷和槲皮素-新橙皮糖苷)的制备工艺。
高速逆流色谱(High-speed counter-current chromatography HSCCC)是一种较新的液液分配色谱技术，它不用任何固体支撑体或载体而克服了传统分离方法对样品的不可逆性吸附作用，因而样品回收率高，同时还具有应用范围广、仪器操作简单、分离量大等优点，因此被广泛应用于天然产物的分离制备当中。我们采用高速逆流色谱法制备得到纯度高于98％的荭草苷、牡荆苷与纯度为85％的槲皮素-新橙皮糖苷，并通过制备液相色谱进一步纯化得到了纯度高于98％的槲皮素-新橙皮糖苷。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明的技术方案如下一种从短瓣金莲花中提取总黄酮并且从总黄酮中分离纯化高纯度荭草苷、牡荆苷和槲皮素-新橙皮糖苷的方法，具体包括药材提取、总黄酮制备及单体化合物的分离纯化三道工序，其特征在于药材提取工序(1)中，将短瓣金莲花用50％～70％药用乙醇回流提取，减压回收乙醇后获取提取液，总黄酮制备工序(2)中，提取液过大孔吸附树脂，用水和25％～35％药用乙醇洗脱，乙醇洗脱液浓缩干燥后可得总黄酮，单体化合物分离纯化工序(3)中，采用高速逆流色谱法对所得总黄酮进行分离纯化，它包括配制构成高速逆流色谱固定相、流动相的溶剂体系，使逆流色谱仪柱子中充满固定相，然后使柱子转动，再将流动相泵入柱内，由进样阀进入制备好的粗提物样品，根据检测器谱图接收目标成分“I”、“II”、“III”，并应用制备液相色谱再次分离纯化流份“I”得到流份“IV”。
工序(1)药材提取取干燥金莲花药材用50％～70％乙醇回流提取2次，每次2小时，过滤，合并滤液，减压浓缩(60℃)至无醇味，为浓缩后的提取液。
工序(2)总黄酮制备取浓缩后的提取液加适量水混悬后，过大孔吸附树脂，用水和25％～35％乙醇洗脱，乙醇洗脱流份减压浓缩干燥(60℃)后可得纯度高于60％的金莲花总黄酮。
工序(3)单体化合物分离纯化应用高速逆流色谱对总黄酮进行分离纯化，它包括配制构成固定相、流动相的溶剂体系，使逆流色谱仪柱子中充满固定相，然后使柱子转动，再将流动相泵入柱内，所用溶剂体系由乙酸乙酯、正丁醇、水组成，用量比为2∶1∶3，由进样阀进样，根据检测谱图接收目标成分“I”、“II”、“III”。此法可制备含有85％槲皮素-新橙皮糖苷的流份“I”与纯度高于98％的流份“II”(荭草苷)、流份“III”(牡荆苷)。
制备液相分离纯化应用制备液相色谱对经高速逆流色谱分离纯化所得流份“I”进行进一步纯化，可得纯度高于98％的槲皮素-新橙皮糖苷，即流份“IV”。
分离物的纯度检测与结构鉴定，采用高效液相色谱法对分得组分进行纯度检测(峰面积归一化法)，挥干溶剂后进行MS、1HNMR和13CNMR分析，根据所得数据进行结构确认。
本发明是采用高速逆流色谱和制备液相色谱结合对中药粗提物进行分离纯化，简便、快速，同时也避免了样品损失。克服了传统制备方法操作繁琐、分离周期长等缺点，并具有制备量大、分离效率高、产品纯度好、简便易行等优点，易于推广使用。
图1为金莲花总黄酮制备流程2为金莲花总黄酮半制备型高速逆流色谱(HSCCC)的色谱3为槲皮素-新橙皮糖苷制备液相色谱的色谱4-1为金莲花总黄酮高效液相色谱(HPLC)的色谱4-2为高速逆流分离所得流份“II”(荭草苷)高效液相色谱(HPLC)的色谱4-3为高速逆流分离所得流份“III”(牡荆苷)高效液相色谱(HPLC)的色谱4-4为高速逆流份离所得流份“I”(含槲皮素-新橙皮糖苷的流份)高效液相色谱(HPLC)的色谱4-5为制备液相色谱流份“IV”(槲皮素-新橙皮糖苷)高效液相色谱(HPLC)的色谱图。
具体实施例方式
下面结合具体实施例及附图对本发明进行说明实施例1如图1金莲花总黄酮制备流程图所示1.药材提取称取干燥金莲花药材300g，用10倍量60％乙醇回流提取2次，每次2小时，过滤，合并滤液，减压浓缩(60℃)至无醇味，得浓缩后的提取液。
2.总黄酮制备取浓缩后的提取液，加水混悬后(总体积为900ml)。加入到装有500g经预处理过的1300大孔吸附树脂的层析柱上，上样完毕后吸附1.0小时。用1200ml水洗脱(弃去)。再用2000ml 30％药用乙醇洗脱，乙醇洗脱流份减压浓缩后，真空干燥(60℃)，得总黄酮粉末16.7g，提取得率为5.57％，总黄酮纯度为61.6％。
3.单体化合物的分离纯化3.1应用高速逆流色谱(深圳同田生化有限公司产品)分离纯化总黄酮。溶剂体系及用量体积比为乙酸乙酯∶正丁醇∶水＝2∶1∶3，上相为固定相，下相为流动相，逆流色谱柱体积为300ml，固定相保留率47％，流速2.0ml/min，转速800rpm，检测波长254nm，取总黄酮粉末500mg溶解于15ml下相中，进样后在此情况下记录的色谱图见图2。
具体的操作步骤是按上述溶剂体积比配制溶剂体系，在分液漏斗中充分振摇后静止分层，分取上下相，上相为固定相，下相为流动相。先使逆流色谱仪柱子中充满固定相，然后使主机转动，再泵入流动相，由进样阀进样，根据检测器谱图接收目标成分“I”、“II”、“III”。
分离物的纯度检测与结构鉴定，采用高效液相色谱法对分得组分进行纯度检测(峰面积归一化法)，挥干溶剂后进行MS、1HNMR和13CNMR分析，根据所得数据进行结构确认。
经高效液相分析表明流份“II”、“III”为单一色谱峰，峰纯度分别为99.6％、98.1％，流份“I”中峰纯度为85.1％。经结构鉴定表明流份“II”为荭草苷，“III”为牡荆苷。
3.2应用制备液相色谱分离纯化流份“I”。色谱条件为0.1％醋酸水溶液∶四氢呋喃∶异丙醇∶乙腈(460∶30∶20∶10)；流速3.0ml/min；色谱柱YWG C18(10.0×200mm i.d.10μm)，柱温30℃，检测波长254nm。根据检测器谱图接收目标成分，即流份“IV”，对该流份进行高效液相分析表明其为单一色谱峰，峰纯度为98.3％。制备液相色谱图见图3。经结构鉴定表明流份“IV”为槲皮素-新橙皮糖苷。
HPLC分析条件色谱柱Hypersil C18(4.0×200mm i.d.5μm)；流动相0.05％磷酸水溶液∶四氢呋喃∶异丙醇∶乙腈(420∶30∶20∶30)；流速0.5ml/min；柱温30℃，检测波长254nm。在此条件下总黄酮、高速逆流色谱及制备液相色谱分离部分色谱图见图4-1至图4-5(峰1为槲皮素-新橙皮糖苷，峰2为荭草苷，峰3为牡荆苷)。其中图4-1为总黄酮色谱图，图4-2为HSCCC分离流份“II”(荭草苷)色谱图，图4-3为HSCCC分离流份“III”(牡荆苷)色谱图，图4-4为流份“I”(高速逆流份离所得含槲皮素-新橙皮糖苷的流份)色谱图，图4-5为制备液相色谱流份“IV”(槲皮素-新橙皮糖苷)色谱图。
结构鉴定对分离得到的槲皮素-新橙皮糖苷、荭草苷和牡荆苷在VarianINOVA-500型核磁共振仪和Varian MAT-212型质谱仪上，进行1HNMR、13CNMR和MS分析，所得数据如下。
荭草苷，黄色粉末，UVλmax(nm MeOH)345，270，255。ESI-MS448(M+)，430(M-H2O)，412(M-2H2O)，394(M-3H2O)，299(苷元+CH2+)。1HNMR(500MHz，DMSO-d6)δ4.92(1H，d，J＝10.0Hz，H-1″)，6.51(1H，s，H-6)，6.88(1H，s，H-3)，7.10(1H，d，J＝8.0Hz，H-5＇)，7.50～7.94(2H，m，H-2′，6′)，13.55(1H，brs，5-OH)。13CNMR(500MHz，DMSO-d6)δ163.01(C-2)，103.99(C-3)，182.03(C-4)，160.47(C-5)，98.31(C-6)，164.16(C-7)，104.65(C-8)，156.27(C-9)，102.41(C-10)，121.97(C-1′)，114.07(C-2′)，145.95(C-3′)，149.90(C-4′)，115.78(C-5′)，119.45(C-6′)，73.50(C-1″)，70.90(C-2″)，78.88(C-3″)，70.83(C-4″)，82.04(C-5″)，61.76(C-6″)。
牡荆苷，黄色粉末，UVλmax(nm MeOH)330，301(肩)，269。ESI-MS432(M+)，414(M-H2O)，396(M-2H2O)，283(苷元+CH2+)。1HNMR(500MHz，DMSO-d6)δ3～4(6H，m，糖上质子)，4.94(1H，d，J＝10.0Hz，H-1″)，6.54(1H，s，H-6)，7.04(1H，s，H-3)，7.15(2H，d，J＝8.0Hz，H-3′，5′)，8.26(2H，d，H-2′，6′)，10.35(1H，s，4′-OH)，10.83(1H，s，7-OH)，13.17(1H，s，5-OH)。13CNMR(500MHz，DMSO-d6)δ162.98(C-2)，104.51(C-3)，182.73(C-4)，156.64(C-5)，98.95(C-6)，164.31(C-7)，104.56(C-8)，160.28(C-9)，105.07(C-10)，122.07(C-1′)，128.99(C-2′，6′)，115.01(C-3′，5′)，161.32(C-4′)，73.93(C-1″)，71.03(C-2″)，79.01(C-3″)，70.20(C-4″)，81.99(C-5″)，61.76(C-6″)。
槲皮素-新橙皮糖苷，黄色粉末，ESI-MS610(M+)，301(苷元)。1HNMR(500MHz，DMSO-d6)δ1.44(3H，d，rha-CH3)，3.90～4.47(10H，m，糖上质子)，5.27(1H，d，rha-C1-H)，5.93(1H，d，GluC1-H)，6.55(1H，d，J＝2Hz，H-6)，6.59(1H，d，J＝2.0Hz，H-8)，7.28(1H，d，J＝8.0Hz，H-5′)，8.04(1H，dd，J＝2.0Hz，J＝8.0Hz，H-6′)，8.26(2H，d，H-2′)。13CNMR(500MHz，DMSO-d6)δ146.94(C-2)，134.08(C-3)，177.88(C-4)，156.32(C-5)，98.28(C-6)，164.02(C-7)，93.44(C-8)，160.94(C-9)，103.27(C-10)，135.96(C-1′)，115.84(C-2′)，147.95(C-3′)，145.18(C-4′)，115.16(C-5′)，120.15(C-6′)，99.4(C-1″)，77.6(C-2″)，77.4(C-3″)，69.6(C-4″)，77.1(C-5″)，60.5(C-6″)，100.7(C-1)，70.6(C-2)，71.3(C-3)，70.9(C-4)，71.7(C-5)，18.1(C-6)。
实施例21.称取干燥金莲花药材300g，用10倍量50％乙醇回流提取2次，每次2小时，过滤，合并滤液，减压浓缩(60℃)至无醇味，得浓缩后的提取液。
2.取浓缩后的提取液，加水混悬后总体积为900ml。加入到装有500g经预处理过的AB-8型大孔吸附树脂的层析柱上，上样完毕后吸附1.0小时。用1400ml水洗脱(弃去)。再用2200ml 25％药用乙醇洗脱，乙醇洗脱流份减压浓缩后，真空干燥(60℃)，得粉末量16.3g，得率为5.43％，总黄酮纯度为62.2％。
3.总黄酮中槲皮素-新橙皮糖苷、荭草苷和牡荆苷的分离纯化、纯度检测以及结构鉴定的方法、步骤及其结果同实例1。
实施例31.称取干燥金莲花药材300g，用10倍量70％乙醇回流提取2次，每次2小时，过滤，合并滤液，减压浓缩(60℃)至无醇味，得浓缩后的提取液。
2.取浓缩后的提取液，加水混悬后总体积为900ml。加入到装有500g经预处理过的AB-8型大孔吸附树脂的层析柱上，上样完毕后吸附1.0小时。用1400ml水洗脱(弃去)。再用2000ml 35％药用乙醇洗脱，乙醇洗脱流份减压浓缩后，真空干燥(60℃)，得总黄酮粉末量18.6g，得率为6.20％，总黄酮纯度为63.3％。
3.总黄酮中槲皮素-新橙皮糖苷、荭草苷和牡荆苷的分离纯化、纯度检测以及结构鉴定的方法、步骤及其结果同实例1。
权利要求
1.一种从短瓣金莲花中提取总黄酮并且从总黄酮中分离纯化高纯度荭草苷、牡荆苷和槲皮素-新橙皮糖苷的方法，具体包括药材提取、总黄酮制备及单体化合物的分离纯化三道工序，其特征在于药材提取工序(1)中，将短瓣金莲花用50％～70％药用乙醇回流提取，减压回收乙醇后获得提取液，总黄酮制备工序(2)中，提取液过大孔吸附树脂，用水和25％～35％药用乙醇洗脱，乙醇洗脱液浓缩干燥后可得总黄酮，单体化合物分离纯化工序(3)中，采用高速逆流色谱法对所得总黄酮进行分离纯化，它包括配制构成高速逆流色谱固定相、流动相的溶剂体系，使逆流色谱仪柱子中充满固定相，然后使柱子转动，再将流动相泵入柱内，由进样阀进入制备好的总黄酮样品，根据检测器谱图接收目标流份“I”、“II”、“III”，并应用制备液相色谱对流份“I”进一步纯化，得到流份“IV”。
2.按照权利要求1所述的一种从短瓣金莲花中提取总黄酮并且从总黄酮中分离纯化高纯度荭草苷、牡荆苷和槲皮素-新橙皮糖苷的方法，其特征在于药材提取工序(1)中，将短瓣金莲花用10倍量60％药用乙醇回流提取2次，减压回收乙醇后得到提取液。
3.按照权利要求1所述的一种从短瓣金莲花中提取总黄酮并且从总黄酮中分离纯化高纯度荭草苷、牡荆苷和槲皮素-新橙皮糖苷的方法，其特征在于总黄酮制备工序(2)中大孔吸附树脂型号可以为1300或AB-8型大孔吸附树脂，用水和30％药用乙醇洗脱，乙醇洗脱液浓缩干燥后可得总黄酮。
4.按照权利要求1所述的一种从短瓣金莲花中提取总黄酮并且从总黄酮中分离纯化高纯度荭草苷、牡荆苷和槲皮素-新橙皮糖苷的方法，其特征在于单体化合物分离纯化工序(3)中，应用高速逆流色谱法对总黄酮进行分离纯化，所用的两相溶剂系统为乙酸乙酯∶正丁醇∶水，两相溶剂系统乙酸乙酯∶正丁醇∶水的最佳配比为2∶1∶3。
5.按照权利要求1或4所述的一种从短瓣金莲花中提取总黄酮并且从总黄酮中分离纯化高纯度荭草苷、牡荆苷和槲皮素-新橙皮糖苷的方法，其特征在于应用制备液相色谱对高速逆流色谱所得流份“I”进一步纯化，得到纯品。
全文摘要
本发明提供从短瓣金莲花中提取总黄酮并且从总黄酮中分离纯化高纯度荭草苷、牡荆苷和槲皮素－新橙皮糖苷的方法，包括药材提取、总黄酮制备及单体化合物的分离纯化三道工序，将短瓣金莲花用50％～70％药用乙醇回流提取，减压回收乙醇后获取提取液，提取液过大孔吸附树脂，用水和25％～35％药用乙醇洗脱，醇洗脱液浓缩干燥后得总黄酮，用高速逆流色谱法(HSCCC)和制备液相色谱对总黄酮分离纯化，得到纯度高于98％的荭草苷、牡荆苷、槲皮素－新橙皮糖苷。具有简便、快速、制备量大、样品损失少等优点，易于推广使用。
文档编号C07H1/08GK1660864SQ20041009312
公开日2005年8月31日 申请日期2004年12月16日 优先权日2004年12月16日
发明者范国荣, 周欣, 彭金咏, 曲丽萍, 吴玉田, 柴逸峰 申请人:中国人民解放军第二军医大学