专利名称：具有抗人类获得性免疫系统综合症病毒活性的糖结合蛋白的制作方法
技术领域：
本发明是一种来自海洋无脊椎动物海绵(Craniella australiensis)的具有抗人类获得性免疫系统综合症病毒活性和促有丝分裂活性的(凝集素)糖结合蛋白，具体地说是一种在人类获得性免疫系统综合症病毒急性感染期，慢性感染时细胞融合过程中该糖结合蛋白具有抗人类获得性免疫系统综合症病毒活性。其结构类似物可成为一种潜在的抗爱滋病药物导向化合物。同时，它具有在体外促进小鼠脾细胞有丝分裂活性。它又可做为一种有丝分裂剂应用在细胞学的研究中。
背景技术：
海洋无脊椎动物由于其大多数运动性较差，物理防御能力较弱(如移动等)。在长期的进化过程中，化学防御能力得到了很好的发展。它们具有很多有特别生理活性的二级代谢产物。如O′Keefe B.R.等人从海棉Niphateserecta中分离出具有抗HIV活性的蛋白质[文献11997年245卷《欧洲生物化学杂志》“从海棉Niphates erecta中分离出具有抗HIV活性的蛋白质”]。还有抗肿瘤物质(抗Ehrlich肿瘤化合物)，leukemia P-388，强心剂，病毒逆转录酶抑制剂，抗HSV-I、FELV、F-59、P-28病毒物质，抗菌物质等从海洋微生物中分离出来。
通过大量对人类获得性免疫系统综合症病毒的研究，人们逐渐把目光放在小肽，蛋白质，糖结合蛋白，多糖，酶抑制剂等物质上。而这些物质在海洋生物中有着丰富的来源，其中糖结合蛋白(凝集素)是非常重要的和有应用前景的物质。
促有丝分裂剂是一种在细胞研究中很有用途的试剂。有很多糖结合蛋白具有这方面的功能。有很多已经商品化，如伴刀豆蛋白。不同的促有丝分裂剂可以给出细胞表面不同的糖结构信息。
发明内容
本发明的目的是提供一种来自海洋无脊椎动物海绵(Craniellaaustraliensis)的抗人类获得性免疫系统综合症病毒活性的糖结合蛋白，按照其结构类似物可成为一种潜在的抗爱滋病药物导向化合物；它又可做为一种有丝分裂剂应用在细胞学的研究中。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为一种具有抗人类获得性免疫系统综合症病毒活性的糖结合蛋白其中的蛋白质N末端为苏氨酸-丝氨酸-丝氨酸-半胱氨酸-谷氨酰胺-丝氨酸-异亮氨酸-缬氨酸-缬氨酸-谷氨酸(TSSCQSIVVE)；
序列表(Thr-Ser-Ser-Cys-Gln-Ser-Ile-Val-Val-Glu)TSSCQSIVVE序列特征长度10个氨基酸链型单链拓扑结构线形来源海绵(Craniella australiensis)与氨基酸有关的特征关键词TSSCQSIVVE，N-末端或其它该糖结合蛋白的氨基酸含量(摩尔/100摩尔)天冬氨酸5％，天冬酰胺3.8％，苏氨酸20.8％，丝氨酸4.4％，谷氨酰10.2％，谷氨酸5.6％脯氨酸7.9％，甘氨酸0.4％，丙氨酸4.2％，半胱氨酸0.6％，缬氨酸1％，异亮氨酸3.5％，亮氨酸6.2％，酪氨酸3.4％，苯丙氨酸4.1％组氨酸6.1％精氨酸0，甲硫氨酸5.7％赖氨酸6.6％；其N末端具有苏氨酸-丝氨酸-丝氨酸-半胱氨酸-谷氨酰胺-丝氨酸-异亮氨酸-缬氨酸-缬氨酸-谷氨酸的序列；其糖在凝血活性的抑制反应中同时表现为从猪胃中提取的粘蛋白(PSM，porcinestomach mucin(type III))特异性，钙离子非依赖型，含糖量为28％；经SDS聚丙酰胺凝胶电泳检测，糖结合蛋白分子量为54000道尔顿，含三个亚基18000道尔顿，亚基共含有163个氨基酸；该糖结合蛋白的糖与氨基酸O健连接；其组成的单糖为D型；该糖结合蛋白的飞行质谱本(M+H)+的m/z为17.8kDa；等电聚焦电泳检测，该糖结合蛋白pI为5.6。
所述的糖结合蛋白，其可按如下方法制备获得1).在3-5℃时，将海绵(Craniella australiensis)用含NaCl(重量浓度0.9％NaCl)的pH 6-9、0.01-0.1M磷酸缓冲液抽提；2)将磷酸抽提液加入交联的卵粘蛋白-粘蛋白(重量比3∶1)亲和层析柱上，水洗脱，洗脱液浓缩冻干；3)将冻干粉溶于磷酸缓冲液中，溶液加到Sephadex G-200分子筛层析上；检测洗脱峰的凝血活性，将具有冷凝血活性的洗脱成份冻干燥，得到糖结合蛋白。
所述的糖结合蛋白，也其可按如下方法制备获得按照糖结合蛋白的N末端氨基酸序列，用3′RACE法扩增cDNA全长，1)液氮研磨海绵，用TRIzol试剂提取总RNA，并检测其完整性；2)cDNA的3′末端的克隆按照Clontech公司的SMART RACE cDNA扩增试剂盒说明书进行，用去除RNA酶的DNAase I去除总RNA中的DNA污染；以3′RACE CDS PrimerA和1μg海绵总RNA合成3′-RACE-ReadycDNA；逆转录产物用通用引物混合物和根据5′端序列设计的3′RACE基因特异引物，以3′-RACE-Ready cDNA为模板按照试剂盒说明书扩增目的基因全长；扩增产物经1％琼脂糖电泳检测并纯化后连接到PMD18-T载体上，转化大肠杆菌Novanblue，蓝白斑筛选及酶切鉴定长度为489bp；其中根据5′端核苷酸序列应用Primer premier 5设计正义基因特异引物(GSP)，序列如下Sense primer5′ACNWSNWSNTGYCARWSNATHGTNG 3′起止碱基1-20bp，GC％45.0引物序列RACE通用引物(Long)5′-ctaatacgactcactatagggcaagcagtggtatcaacgcagagt-3′RACE通用引物(Short)5′-ctaatacgactcactatagggc-3′3′RACE CDS Primer A5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)30N-1N-3′3)将该cDNA转入到酵母菌中，表达的糖蛋白特征为权利要求1所述的糖结合蛋白。
本发明具有如下优点1.低细胞毒性。本发明来自海绵的抗人类获得性免疫系统综合症病毒活性的糖结合蛋白，在对人类T淋巴细胞系C8166的体外毒性检测中，在150毫克/毫升浓度时，没有观察到细胞毒性。
2.高抗人类获得性免疫系统综合症病毒活性。在对人类T淋巴细胞系C8166急性感染人类获得性免疫系统综合症病毒(HIV-1IIIB)时，以及在慢性感染的细胞系H9/HIV-1IIIB和人类T淋巴细胞系C8166体外检测中均表现出很好的抗人类获得性免疫系统综合症病毒活性。
3.通过该糖结合蛋白的N末端10个氨基酸序列，采用分子生物学的实验方法，在酵母菌中表达出该糖蛋白；该方法可获得大量的专一表达的该糖结合蛋白；并不受海绵来源的限制。其结构类似物可成为一种潜在的抗爱滋病药物导向化合物。它亦可做为一种有丝分裂有丝分裂剂，应用在细胞学的研究中。
图1为本发明糖结合蛋白的飞行质谱图。
具体实施例方式
实施例1在3-5℃时，将23克海绵用含0.9％NaCl的50毫升0.01-0.1M磷酸缓冲液抽提，缓冲液pH 6-9；采用交联的卵粘蛋白-粘蛋白(3∶1)亲和层析，缓冲液为0.01-0.1M磷酸缓冲液，pH 6-9，采用水洗脱。洗脱液浓缩冻干。将冻干粉溶于0.01-0.1M磷酸缓冲液中，pH 6-9。1.5毫升该溶液加到分子筛层析SephadexG-200(1.8×98cm)上。检测洗脱峰的凝血活性，将具有冷凝血活性的洗脱成份冻干燥，制得该糖结合蛋白。
该糖结合蛋白，其蛋白质特征在于N末端为苏氨酸-丝氨酸-丝氨酸-半胱氨酸-谷氨酰胺-丝氨酸-异亮氨酸-缬氨酸-缬氨酸-谷氨酸(TSSCQSIVVE)；该糖结合蛋白的氨基酸含量(摩尔/100摩尔)天冬氨酸5％，天冬酰胺3.8％，苏氨酸20.8％，丝氨酸4.4％，谷氨酰10.2％，谷氨酸5.6％脯氨酸7.9％，甘氨酸0.4％，丙氨酸4.2％，半胱氨酸0.6％，缬氨酸1％，异亮氨酸3.5％，亮氨酸6.2％，酪氨酸3.4％，苯丙氨酸4.1％组氨酸6.1％精氨酸0，甲硫氨酸5.7％赖氨酸6.6％；其糖特征在于在凝血活性的抑制反应中同时表现为从猪胃中提取的粘蛋白(PSM，porcinestomach mucin(type III))特异性，钙离子非依赖型，含糖量为28％。糖结合蛋白分子量为54000道尔顿，含三个亚基18000道尔顿。亚基共含有163个氨基酸。该糖结合蛋白的飞行质谱本(M+H)+的m/z为17.8kDa。
实施例2根据N端糖结合蛋白氨基酸序列所设计的引物，及跟据所设计的引物转录出基因序列，经基因工程菌得到的该该糖蛋白粗品；再经交联的卵粘蛋白-粘蛋白亲和层析和分子筛层析，得到纯品；具体过程如下按照N末端氨基酸序列苏氨酸-丝氨酸-丝氨酸-半胱氨酸-谷氨酰胺-丝氨酸-异亮氨酸-缬氨酸-缬氨酸-谷氨酸，用3′RACE法扩增cDNA全长1).根据N端氨基酸序列按标准翻译准则推导出5′端核苷酸序列5′ACNWSNWSNTGYCARWSNATHGTNGTNGAR 3′2).根据(1)的5′端核苷酸序列应用Primer premier 5设计正义基因特异引物(GSP)，序列如下Sense primer5′ACNWSNWSNTGYCARWSNATHGTNG 3′起止碱基1-20bp，GC％45.03).引物序列RACE通用引物(Long)5′-ctaatacgactcactatagggcaagcagtggtatcaacgcagagt-3′RACE通用引物(Short)5′-ctaatacgactcactatagggc-3′3′RACE CDS Primer A5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)30N-1N-3′4).总RNA提取，定量与完整性检测液氮研磨海绵，用TRIzol试剂(Invitrogen)提取总RNA，(1)RNA定量分析测260、280nm处的吸光值，计算A260/A280的值以估计总RNA的纯度。通过A260的值计算总RNA的量。(2)RNA完整性检测在1％甲醛变性琼脂糖凝胶上分离总RNA，有两条清晰的带，且大分子量(28SrRNA)的亮度近似为小分子量(18SrRNA)的亮度的2倍，则说明总RNA完整。
5).cDNA的3′末端的克隆cDNA 3′末端快速扩增按照Clontech公司的SMART RACE cDNA扩增试剂盒说明书进行。用去除RNA酶的DNAase I(Pharmacia Biotech)去除总RNA中的DNA污染。以3′RACE CDS Primer A和1μg海绵总RNA合成cDNA(3′-RACE-Ready cDNA)，2.5μL逆转录产物用通用引物混合物RACE通用引物(Long和short)和根据5′端序列设计的3′RACE基因特异引物(Sense primer)，以3′-RACE-Ready cDNA为模板按照试剂盒说明书扩增目的基因全长。扩增产物经1％琼脂糖电泳检测并纯化后连接到PMD18-T载体上，转化大肠杆菌Novanblue，蓝白斑筛选及酶切鉴定后，由宝生物工程(大连)有限公司测序。长度为489bp。
6).将该cDNA转入到酵母菌中，表达的糖蛋白特征经破碎酵母菌体，得到该糖蛋白粗品。用0.01-0.1M磷酸缓冲液，pH 6-9，抽提。盐(0.9％NaCl)抽提液，采用交联的卵粘蛋白-粘蛋白(3∶1)亲和层析，缓冲液为0.01-0.1M磷酸缓冲液，pH 6-9，采用水洗脱。洗脱液浓缩冻干。将冻干粉溶于0.01-0.1M磷酸缓冲液中，pH 6-9。1.5毫升该溶液加到分子筛层析Sephadex G-200(1.8×98cm)上。检测洗脱峰的凝血活性，将具有冷凝血活性的洗脱成份冻干燥，制得该糖结合蛋白。
应用例1 对人类T淋巴细胞系C8166细胞毒性检测，结果如表1所示；表1
C8166细胞系于该糖结合蛋白混合，在37℃，5％CO2培养三天，采用MTT(3，(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyl tetrazolium bromide)比色法检测细胞毒性。该糖结合蛋白在500毫克/毫升细胞存活率大于50％。
应用例2 对人类获得性免疫系统综合症病毒(HIV-1IIIB)诱导致病变作用的抑制试验，结果如表2所示；表2
50μl培养液倍比稀释的该糖结合蛋白加入HIV-1稀释上清50μl，混合，37℃预处理1h，然后加入C8166细胞50μl(3×104个)及50μl含有相应浓度化合物的培养液，M.O.I.为0.03。同时设置不含化合物的对照孔。37℃，5％CO2培养三天，倒置显微镜下(100×)计数合胞体的形成。EC50(50％Effective Concentration)为抑制合胞体形成50％时的化合物浓度。糖结合蛋白EC50浓度为16.41毫克/毫升。
应用例3 对小鼠脾细胞的促有丝分裂活性试验，结果如表3所示；
表3
C8166细胞系于该糖结合蛋白混合，在37℃，5％CO2培养三天，采用MTT(3，(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyl tetrazolium bromide)比色法检测细胞毒性。该糖结合蛋白在500毫克/毫升细胞存活率大于50％。
应用例4将该糖结合蛋白和辣根过氧化物酶相结合，成功地应用在标记粘蛋白在大肠癌，大肠良性病变中的表达。采用高清晰度彩色医学图文分析系统，对42例大肠癌组织、40例大肠良性病变组织和10例正常肠组织用该糖结合蛋白和辣根过氧化物酶相结合制成的探针进行粘蛋白表达分析。结果发现粘蛋白在大肠癌，大肠良性病变中的平均灰度均显著低于正常组织(p＜0.001)，大肠癌组织中平均灰度均低于大肠良性病变。
糖结合蛋白SEQUENCE LISTING<110>中国科学院大连化学物理研究所<120>具有抗人类获得性免疫系统综合症病毒活性的糖结合蛋白<130>
<160>1<170>Patent In version 3.1<210>1<211>10<212>PRT<213>海绵(Craniella australiensis)<220>
<221>ACETYLATION<222>(1)..(10)<223>
<400>1Thr Ser Ser Cys Gln Ser Ile Val Val Glu1 5 10
权利要求
1.一种具有抗人类获得性免疫系统综合症病毒活性的糖结合蛋白，其特征在于其中的蛋白质N末端为苏氨酸-丝氨酸-丝氨酸-半胱氨酸-谷氨酰胺-丝氨酸-异亮氨酸-缬氨酸-缬氨酸-谷氨酸。
2.按照权利要求1所述的糖结合蛋白，其特征在于糖结合蛋白分子量为54000道尔顿，含三个亚基18000道尔顿；亚基共含有163个氨基酸。
3.按照权利要求1所述的糖结合蛋白，其特征在于该糖结合蛋白的氨基酸摩尔含量天冬氨酸5％，天冬酰胺3.8％，苏氨酸20.8％，丝氨酸4.4％，谷氨酰10.2％，谷氨酸5.6％脯氨酸7.9％，甘氨酸0.4％，丙氨酸4.2％，半胱氨酸0.6％，缬氨酸1％，异亮氨酸3.5％，亮氨酸6.2％，酪氨酸3.4％，苯丙氨酸4.1％ 组氨酸6.1％ 精氨酸0，甲硫氨酸5.7％ 赖氨酸6.6％；该糖结合蛋白的糖在凝血活性的抑制反应中同时表现为从猪胃中提取的粘蛋白特异性，钙离子非依赖型，含糖量为28％。
4.按照权利要求1所述的糖结合蛋白，其特征在于该糖结合蛋白的糖与氨基酸O健连接；其组成的单糖为D型；该糖结合蛋白的飞行质谱本(M+H)+的m/z为17.8kDa；等电聚焦电泳检测，该糖结合蛋白pI为5.6。
5.一种权利要求1所述的糖结合蛋白的制备方法，其特征在于1).在3-5℃时，将海绵用含0.9％NaCl的pH 6-9、0.01-0.1M磷酸缓冲液抽提；2)将磷酸抽提液加入交联的卵粘蛋白-粘蛋白亲和层析柱上，水洗脱，洗脱液浓缩冻干；3)将冻干粉溶于磷酸缓冲液中，溶液加到Sephadex G-200分子筛层析上；检测洗脱峰的凝血活性，将具有冷凝血活性的洗脱成份冻干燥，得到糖结合蛋白。
6.一种权利要求1所述的糖结合蛋白的制备方法，其特征在于按照糖结合蛋白的N末端氨基酸序列，用3′RACE法扩增cDNA全长，1)液氮研磨海绵，用TRIzol试剂提取总RNA，并检测其完整性；2)cDNA的3′末端的克隆按照Clontech公司的SMART RACE cDNA扩增试剂盒说明书进行，用去除RNA酶的DNAase I去除总RNA中的DNA污染；以3′RACE CDS Primer A和1μg海绵总RNA合成3′-RACE-ReadycDNA；逆转录产物用通用引物混合物和根据5′端序列设计的3′RACE基因特异引物，以3′-RACE-Ready cDNA为模板按照试剂盒说明书扩增目的基因全长；扩增产物经1％琼脂糖电泳检测并纯化后连接到PMD18-T载体上，转化大肠杆菌Novanblue，蓝白斑筛选及酶切鉴定长度为489bp；其中根据5′端核苷酸序列应用Primer premier 5设计正义基因特异引物(GSP)，序列如下Sense primer5′ACNWSNWSNTGYCARWSNATHGTNG 3′，起止碱基1-20bp，GC％45.0引物序列RACE通用引物(Long)5′-ctaatacgactcactatagggcaagcagtggtatcaacgcagagt-3′RACE通用引物(Short)5′-ctaatacgactcactatagggc-3′3′RACE CDS Primer A5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)30N-1N-3′；3)将该cDNA转入到酵母菌中，表达的糖蛋白特征为权利要求1所述的糖结合蛋白。
全文摘要
本发明涉及一种具有抗人类获得性免疫系统综合症病毒活性的糖结合蛋白，其中的蛋白质N末端为苏氨酸－丝氨酸－丝氨酸－半胱氨酸－谷氨酰胺－丝氨酸－异亮氨酸－缬氨酸－缬氨酸－谷氨酸。在人类获得性免疫系统综合症病毒急性感染期，慢性感染时细胞融合过程中该糖结合蛋白具有抗人类获得性免疫系统综合症病毒活性。其结构类似物可成为一种潜在的抗爱滋病药物导向化合物。同时，它具有在体外促进小鼠脾细胞有丝分裂活性。它又可做为一种有丝分裂剂应用在细胞学的研究中。
文档编号C07K7/00GK1927882SQ20051004716
公开日2007年3月14日 申请日期2005年9月9日 优先权日2005年9月9日
发明者李伟, 熊川男, 田仁荣, 郑永唐, 张付云, 白雪芳, 杜昱光 申请人:中国科学院大连化学物理研究所