专利名称：：荚膜组织胞浆菌变态反应原的提取方法及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及蛋白的提取方法，具体涉及一种荚膜组织胞浆菌(//Wo//a^WM/WW/W"M)变态反应原的提取方法，以及所提取的变态反应原在诊断人体荚膜组织胞浆菌的感染以及鉴别荚膜组织胞浆菌病和结核病中的用途。
背景技术：
：荚膜组织胞浆菌属于真菌界---半知菌亚门-一丝孢菌纲一-丛梗孢目一-丛梗孢科，是一种双相型真菌，在37'C血培养时为酵母型、在室温培养时为典型的菌丝体。荚膜组织胞浆菌可引起一种原发型呼吸系统真菌病一-荚膜组织胞浆菌病，在全世界30多个温带和热带国家流行。由于该病发病类型多样，临床上极易误诊为结核病、肺炎、结节病、败血症等，尤其慢性肺型荚膜组织胞浆菌病的临床表现为发热、全身不适、咳嗽、咳痰、咯血、胸痛、呼吸困难、盗汗、消瘦，患者肺部早期呈肺炎样改变，后期可有空洞形成，胸片主要表现为假阳性致密浸润，以肺尖及上叶后段最为多见，上述表现与结核病难以鉴别，而且有1015%患者同时患肺结核病。我国的江苏、北京、广西、上海，山东、湖南等省均有荚膜组织胞浆菌病的病例报导，可査病例中约1/3被误诊为结核病。以美国荚膜组织胞浆菌素(Histoplasmin)在我国湖南进行的组织胞浆菌病调查中，健康人群感染率约为8.3%，据此推测我国有近1亿人感染该菌；在湖南长沙对住院结核病患者调査的结果表明，具有结核病临床表现而结核菌细菌学检査阴性者的荚膜组织胞浆菌素阳性检出率高达33.61%，这应引起对荚膜组织胞浆菌病的高度重视。由于荚膜组织胞浆菌病与结核病临床症状极其相近，而在我国440万"结核病患者"中2/3细菌学检查为阴性，主要根据临床体征与X线胸片判为结核。根据上述"结核病患者"中荚膜组织胞浆菌素高阳性率的流调结果推测，部分"结核病患者"可能是胞浆菌病患者的误诊。综上所述，对荚膜组织胞浆菌病和结核病的鉴别诊断极为重要，但由于我国临床医生对该病了解甚少，加上缺乏荚膜组织胞浆菌病诊断制品，造成我国多数荚膜组织胞浆菌病患者被误诊。因此研制荚膜组织胞浆菌病诊断制剂对解决目前国内大量结核病与荚膜组织胞浆菌病误诊、漏诊的状况十分必要。目前在诊断荚膜组织胞浆菌病中使用最广泛、历史最悠久的制品是荚膜组织胞浆菌素，该制品类似于旧结核菌素，由荚膜组织胞浆菌滤液制备而成(该方法由Emmons氏于1945年建立，由荚膜组织胞浆菌在液体天冬素培养基22'C静置培养8周后，离心3000rpm去除菌体，经过滤除菌，过滤后滤液经1:100稀释而成)(Emmons,C.W.,Olson,B.J".,andEldridge，W.W.:Studiesoftheroleoffungiinpulmonarydisease.I.Crossreactionsofhistoplasmin,PublicHealthR印，1945,60,1383.)。皮肤迟发型变态反应类制剂如结核菌素、布氏菌素等均经历了由菌体培养滤液制剂到提取变态反应蛋白的换型过程，而荚膜组织胞浆菌素目前仍然是由滤液制备的制品。该制品含培养基成分而且菌体杂质较高，容易引起非特异性反应；无法以化学定量法测定有效物质含量，只能以致敏动物标化确定效价，难以得到精确的结果，量效关系难以等同，而且结果受动物致敏状态、注射部位的影响；非纯化制品以及滤液残留物易引起较强的副反应，产生大红肿、硬结、水泡等现象。在国外，己有制备菌体组织胞浆菌素的报道(Levine,H.B.，Scalarone，G.M.，Campbell,GuyD.:Histoplasmin-CYL，ayeastphasereagentinskinteststudieswithHuman,AmericanReviewofRespiratoryDisease,1979,119,629.)，该方法为将合成培养基上培养物离心收集，经洗涤后加入蒸馏水振荡24小时，过滤收集上清液应用于皮试；其剂量14.5ug相当于FDA1:100荚膜组织胞浆菌素(国际参考品)剂量。但由于该制品仍未以化学方法提纯，造成其灵敏度与特异性均不理想。引起皮肤变态反应的变态反应原为热稳定性蛋白，通常用于提取蛋白的方法均可用于菌素的提取与纯化。目前所报道的方法主要有硫酸铵沉淀法、三氨醋酸纯化法、醋酸提取法、丙酮萃取法以及乙醇提取等方法。根据多年对各种提取方法的比较研究，本发明确定以盐析和弱酸沉淀分步提取的方法制备荚膜组织胞浆菌变态反应原，该方法国内外均未见报道，其工艺简单，蛋白纯度高，用于诊断人体荚膜组织胞浆菌的感染以及荚膜组织胞浆菌病和结核病的鉴别诊断时具有较高的敏感性、特异性和安全性。
发明内容本发明提供了一种荚膜组织胞浆菌变态反应原的提取方法，所述的方法以盐析和弱酸沉淀分步提取的方法从荚膜组织胞浆菌培养滤液中提纯荚膜组织胞浆菌变态反应原蛋白、以化学定量与生物定量相结合方式，制备荚膜组织胞桨菌变态反应原。具体来说，所述的方法包括以液体表面培养方式培养荚膜组织胞浆菌、经高压蒸汽处理后过滤去除菌体、取无菌体滤液，用盐析和弱酸沉淀法提取荚膜组织胞浆菌变态反应原。本发明的提取方法中所述的盐析和弱酸沉淀法包括下列步骤向无菌体培养滤液中加入三氯醋酸，收集沉淀，经溶解后，加入硫酸铵，收集沉淀，用三氯醋酸多次洗涤,然后将溶解的沉淀透析,透析内液经无菌过滤后得荚膜组织胞浆菌变态反应原。其中，加入的三氯醋酸的终浓度为4%。本发明的提取方法中所述的液体表面培养方式是指将荚膜组织胞桨菌接种于葡萄糖琼脂斜面培养基上，25'C培养。将斜面生长良好且无污染的菌丝体培养物接种于葡萄糖甘油液体培养基表面，25'C静置培养8周以上。本发明还涉及根据上述所述提取方法制备的荚膜组织胞浆菌变态反应原及其在诊断人体荚膜组织胞浆菌的感染以及鉴别荚膜组织胞浆菌病和结核病中的应用。以本发明所述方法制备的荚膜组织胞浆菌变态反应原蛋白纯度〉80%，灵敏度与特异性均高于国外同类制品ayg纯化蛋白效力与FDAl:100荚膜组织胞浆素以及胞浆菌菌体冻溶蛋白素14.5ug剂量等效)，为荚膜组织胞浆菌变态反应原对荚膜组织胞浆菌感染的诊断提供了理论依据；经安全性试验、异常毒性、热源实验和致敏效应试验证实本发明制备的荚膜组织胞浆菌变态反应原是安全的。本发明的方法工艺简单易于标准化，获得的荚膜组织胞浆菌变态反应原用于诊断荚膜组织胞浆菌的感染以及荚膜组织胞浆菌病和结核病的鉴别诊断有较高的敏感性、特异性和安全性。具体实施例方式到现在为止，已经给出了本发明的一般性描述。借助于下列实施例，参照特定的实施方案，以下给出更详细的说明，目的是为了更好地理解本发明的目的、特征、优点和操作方法。然而，无意于将本发明的范围限定在此范围内。在如下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。实施例1:荚膜组织胞浆菌变态反应原的制备本实施例详细说明了荚膜组织胞浆菌的液体表面膜培养技术和荚膜组织胞浆菌变态反应原的盐析和弱酸沉淀提取方法。1.1荚膜组织胞浆菌的液体表面膜培养将荚膜组织胞桨菌(ATCC12700)接种于葡萄糖琼脂斜面培养基上，25'C培养。将斜面生长良好且无污染的菌丝体培养物接种于葡萄糖甘油液体培养基表面，25°C静置培养8周以上。凡在培养期间或培养终止时，有发育异常或污染杂菌者，必须废弃。1.2荚膜组织胞浆菌的菌体处理培养终止时，将培养物经12rC、30分钟高压蒸汽处理后，用灭菌绸布过滤除去菌体，收集培养滤液。1.3荚膜组织胞浆菌变态反应原的提取向上述培养滤液中加入固体三氯醋酸，使其终浓度为4%,室温静置12小时，离心、弃上清液；将沉淀用生理盐水溶解，加入硫酸铵，使其终浓度为56%，于28'C过夜静置，离心、弃上清液；将沉淀用4%的三氯醋酸溶液多次洗涤，直至上清液与蒽酮液反应呈黄色为止。将所获沉淀再次用生理盐水溶解，移入透析袋用流水和蒸馏水反复透析直至透析外液与1%氯化钡溶液反应无白色絮状沉淀产生为止，改换磷酸盐缓冲液再次透析15小时。将透析内液用0.22ym滤膜过滤除菌，即得荚膜组织胞浆菌变态反应原。通常根据应用需要将荚膜组织胞浆菌变态反应原原液稀释至lmg/ml或5mg/ml后定量无菌分装。实施例2:盐析和弱酸沉淀法提取荚膜组织胞浆菌变态反应原的产率用实施例l所述方法制备三批荚膜组织胞浆菌变态反应原原液，批号分别为20010501、20010502、20010503，荚膜组织胞浆菌纯化变态反应原的产率见表1:表1:盐析和弱酸沉淀法提取荚膜组织胞浆菌变态反应原的产率<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>结果表明每升培养滤液可得到荚膜组织胞浆菌变态反应原18.30士3.27mg，批与批之间的变异系数为18%，小于20%。实施例3:荚膜组织胞浆菌变态反应原对荚膜组织胞浆菌致敏动物的皮肤试验反应情况荚膜组织胞浆菌变态反应原主要用于对荚膜组织胞浆菌感染的诊断，其理论依据是该蛋白应与荚膜组织胞浆菌致敏机体成特异性阳性反应。本实施例通过动物试验对此进行验证，并比较用新方法制备的变态反应原与国际参考品的效价。用含0.0005%吐温-80及3.Og/L苯酚的pH7.27.4的0.Olmol/L的PBS将荚膜组织胞浆菌变态反应原原液分别稀释为浓度为1Ug/ml、2ug/ml、4ug/ml、8ug/ml的受试样品，国际参考品采用1:100稀释的荚膜组织胞浆菌素(HistoplasminDiluted,美国PARK-DAV公司制备)。将体重400600g经荚膜组织胞浆菌致敏的豚鼠至少4只去毛，去毛后在豚鼠背部两侧以轮圈法注射上述各受试品和参考品，每点皮内注射0.2ml样品，用双盲法分别记录24及48小时的红肿反应纵径与横径。算出每个稀释度样品和参考品的平均红肿反应(纵横直径相加除2)，计算2天的总和，求其比值。测定结果见表2、表3、表4。表2.20010501批原液效价测定结果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表3.20010502批原液效价测定结果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表4.20010503批原液效价测定结果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>上述结果表明荚膜组织胞浆菌变态反应原对荚膜组织胞浆菌致敏豚鼠的皮肤试验均呈阳性反应，三批原液lyg/ml、2yg/ml和4yg/ml的稀释度与参考品的比值均可达到1±0.2，即l4yg/ml荚膜组织胞浆菌变态反应原即可与1:100荚膜组织胞浆素(国际参考品)等效。实施例4:荚膜组织胞浆菌变态反应原用于诊断荚膜组织胞浆菌病的敏感性和特异性研究荚膜组织胞浆菌变态反应原主要用于荚膜组织胞浆菌病与结核病的鉴别诊断，因而确定两种皮肤反应制剂对两种致敏原致敏机体的交叉反应程度有重要意义；同时，为进一步确定该制品的诊断敏感性和特异性，应扩大致敏范围，验证两种皮肤反应制剂对其它分枝杆菌致敏机体的交叉反应情况。本实施例观察了荚膜组织胞浆菌纯化蛋白衍生物与结核菌纯化蛋白衍生物(TB-PPD)对荚膜组织胞浆菌与结核杆菌致敏豚鼠的皮肤反应(DTH)情况，以及荚膜组织胞浆菌纯化蛋白衍生物与其他分枝杆菌的交叉免疫应答情况。4.1荚膜组织胞浆菌变态反应原与结核分枝杆菌及其它分枝杆菌致敏机体的交叉反应研究分别以荚膜组织胞浆菌、卡介菌、结核、鸟、蟾蜍、土地、胃、不产色、施氏、次要、产鼻疽、堪萨斯、海、亚洲、瘰疬、戈登、苏加、龟、偶发、耻垢、楚布、猪、母牛、牛等分枝杆菌致敏豚鼠(选取生长良好且无污染的各种菌，分别以生理盐水洗下后，离心称重，用灭菌的液体石蜡制备浓度为100mg/tnl的菌悬液，用吸管反复吹打至乳浊状，10磅灭活15分钟，即为致敏原；选取TB-PPD和荚膜组织胞浆菌变态反应原皮试阴性的豚鼠为受试对象，于腹股沟皮下注射各致敏原6只12次，并于末次致敏后36周用荚膜组织胞浆菌变态反应原(50U/ml)、国外同类产品(1:100稀释荚膜组织胞浆菌素，美国PARK-DAV公司制备)以及TB-PPD(50IU/ml)或PPD-B对不同菌致敏豚鼠进行皮肤变态反应试验(皮内注射0.1ml/只)，观察24小时和48小时的局部硬结反应大小，根据48小时结果进行判定，局部硬结反应》5mra判为阳性。试验结果见表5表28。表5.荚膜组织胞浆菌致敏豚鼠组48小时皮试结果<table>complextableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表5结果表明，荚膜组织胞浆菌变态反应原及国际参考品与荚膜组织胞浆菌致敏豚鼠均呈阳性反应，局部硬结反应直径累计值分别为215mm和213.5mm,平均值均为11.9mm;TB-PPD与荚膜组织胞浆菌致敏豚鼠无交叉反应，局部硬结反应直径累计值为0，平均值为0。表6.结核分枝杆菌致敏豚鼠组48小时皮试结果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表6结果表明，TB-PPD与结核分枝杆菌致敏豚鼠均呈阳性反应，局部硬结反应直径累计值为77.5mm,平均值为12.9mm;荚膜组织胞浆菌变态反应原及国外参考品与结核分枝杆菌致敏豚鼠均无交叉反应，局部硬结反应直径累计值均为0，平均值均为0。表7.卡介苗致敏豚鼠组48小时皮试结果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表7结果表明，TB-PPD与卡介苗致敏豚鼠均呈阳性反应，局部硬结反应直径累计值为51.5mm，平均值为8.6mm;荚膜组织胞浆菌变态反应原及国外参考品与卡介苗致敏豚鼠均无交叉反应，局部硬结反应直径累计值均为0，平均值均为0。表8.牛分枝杆菌致敏豚鼠组48小时皮试结果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表8结果表明，TB-PPD与牛分枝杆菌致敏豚鼠均呈阳性反应，局部硬结反应直径累计值为79mm，平均值为13.2mm;荚膜组织胞浆菌变态反应原及国外参考品与牛分枝杆菌致敏豚鼠均无交叉反应，局部硬结反应直径累计值均为0，平均值均为0。表9.鸟分枝杆菌致敏豚鼠组48小时皮试结果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表9结果表明，PPD-B与鸟分枝杆菌致敏豚鼠均呈阳性反应，局部硬结反应直径累计值为42.5mm，平均值为7.lmm;荚膜组织胞浆菌变态反应原及国外参考品与鸟分枝杆菌致敏豚鼠均无交叉反应，局部硬结反应直径累计值均为0，平均值均为0。表10.蟾蜍分枝杆菌致敏豚鼠组48小时皮试结果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表10结果表明，PPD-B与蟾蜍分枝杆菌致敏豚鼠均呈阳性反应，局部硬结反应直径累计值为89咖，平均值为14.8mm;荚膜组织胞浆菌变态反应原及国外参考品与蟾蜍分枝杆菌致敏豚鼠均无交叉反应，局部硬结反应直径累计值均为0，平均值均为0。表11.土地分枝杆菌致敏豚鼠组48小时皮试结果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>表ll结果表明，PPD-B与土地分枝杆菌致敏豚鼠均呈阳性反应，局部硬结反应直径累计值为82mm，平均值为13.7mm;荚膜组织胞浆菌变态反应原及国外参考品与土地分枝杆菌致敏豚鼠均无交叉反应，局部硬结反应直径累计值均为0，平均值均为O。表12.胃分枝杆菌致敏豚鼠组48小时皮试结果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>表12结果表明，PPD-B与胃分枝杆菌致敏豚鼠均呈阳性反应，局部硬结反应直径累计值为76mm，平均值为12.7mm;荚膜组织胞浆菌变态反应原及国外参考品与胃分枝杆菌致敏豚鼠均无交叉反应，局部硬结反应直径累计值均为0，平均值均为0。表13.不产色分枝杆菌致敏豚鼠组48小时皮试结果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>表13结果表明，PPD-B与不产色分枝杆菌致敏豚鼠均呈阳性反应，局部硬结反应直径累计值为84mm，平均值为14.0mra;荚膜组织胞浆菌变态反应原及国外参考品与产色分枝杆菌致敏豚鼠均无交叉反应，局部硬结反应直径累计值均为0，平均值均为0。表14.施氏分枝杆菌致敏豚鼠组48小时皮试结果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>表14结果表明，PPD-B与施氏分枝杆菌致敏豚鼠均呈阳性反应，局部硬结反应直径累计值为75mm，平均值为12.5mm;荚膜组织胞浆菌变态反应原及国外参考品与施氏分枝杆菌致敏豚鼠均无交叉反应，局部硬结反应直径累计值均为0，平均值均为0。表15.次要分枝杆菌致敏豚鼠组48小时皮试结果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>表15结果表明，PPD-B与次要分枝杆菌致敏豚鼠均呈阳性反应，局部硬结反应直径累计值为78mm，平均值为13.Omm;荚膜组织胞浆菌变态反应原及国外参考品与次要分枝杆菌致敏豚鼠均无交叉反应，局部硬结反应直径累计值均为0，平均值均为0。表16.产鼻疽分枝杆菌致敏豚鼠组48小时皮试结果<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>表16结果表明，PPD-B与产鼻疽分枝杆菌致敏豚鼠均呈阳性反应，局部硬结反应直径累计值为72mm，平均值为12.0mm;荚膜组织胞浆菌变态反应原及国外参考品与产鼻疽分枝杆菌致敏豚鼠均无交叉反应，局部硬结反应直径累计值均为0，平均值均为0。表17.堪萨斯分枝杆菌致敏豚鼠组48小时皮试结果<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>表17结果表明，PPD-B与堪萨斯分枝杆菌致敏豚鼠均呈阳性反应，局部硬结反应直径累计值为6L5mm，平均值为10.2mm;荚膜组织胞桨菌变态反应原及国外参考品与堪萨斯分枝杆菌致敏豚鼠均无交叉反应，局部硬结反应直径累计值均为0,平均值均为0。表18.海分枝杆菌致敏豚鼠组48小时皮试结果<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>表20结果表明，PPD-B与瘰疬分枝杆菌致敏豚鼠均呈阳性反应，局部硬结反应直径累计值为62.5mrn，平均值为10.4mm;荚膜组织胞浆菌变态反应原及国外参考品与瘰疬分枝杆菌致敏豚鼠均无交叉反应，局部硬结反应直径累计值均为0，平均值均为O。表21.戈登分枝杆菌致敏豚鼠组48小时皮试结果<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>表22结果表明，PPD-B与苏加分枝杆菌致敏豚鼠均呈阳性反应，局部硬结反应直径累计值为75mm，平均值为12.5mm;荚膜组织胞浆菌变态反应原及国外参考品与苏加分枝杆菌致敏豚鼠均无交叉反应，局部硬结反应直径累计值均为0,平均值均为O。<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>表24结果表明，PPD-B与偶发分枝杆菌致敏豚鼠均呈阳性反应，局部硬结反应直径累计值为64.0ram，平均值为10.7咖；荚膜组织胞浆菌变态反应原及国外参考品与偶发分枝杆菌致敏豚鼠均无交叉反应，局部硬结反应直径累计值均为0，平均值均为0。<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>表25结果表明，PPD-B与耻垢分枝杆菌致敏豚鼠均呈阳性反应，局部硬结反应直径累计值为92mm，平均值为15.3mm;荚膜组织胞浆菌变态反应原及国外参考品与耻垢分枝杆菌致敏豚鼠均无交叉反应，局部硬结反应直径累计值均为0,平均值均为0。表26.楚布分枝杆菌致敏豚鼠组48小时皮试结果<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>表26结果表明，PPD-B与楚布分枝杆菌致敏豚鼠均呈阳性反应，局部硬结反应直径累计值为69mm，平均值为111.5mm;荚膜组织胞浆菌变态反应原及国外参考品与楚布分枝杆菌致敏豚鼠均无交叉反应，局部硬结反应直径累计值均为0，平均值均为0。表27.猪分枝杆菌致敏豚鼠组48小时皮试结果<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>表27结果表明，PPD-B与猪分枝杆菌致敏豚鼠均呈阳性反应，局部硬结反应直径累计值为80mm，平均值为13.3mm;荚膜组织胞浆菌变态反应原及国外参考品与猪分枝杆菌致敏豚鼠均无交叉反应，局部硬结反应直径累计值均为0,平均值均为O。表28.母牛分枝杆菌致敏豚鼠组48小时皮试结果<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>表28结果表明，PPD-B与母牛分枝杆菌致敏豚鼠均呈阳性反应，局部硬结反应直径累计值为89mm，平均值为14.8mm;荚膜组织胞浆菌变态反应原及国外参考品与母牛分枝杆菌致敏豚鼠均无交叉反应，局部硬结反应直径累计值均为0，平均值均为0。结论综合上述结果，荚膜组织胞浆菌变态反应原及国际参考品与卡介苗、结核、鸟、蟾蜍、土地、胃、不产色、施氏、次要、产鼻疽、堪萨斯、海、亚洲、瘰疬、戈登、苏加、龟、偶发、耻垢、楚布、猪、母牛、牛等分枝杆菌致敏的豚鼠均无交叉反应；荚膜组织胞浆菌变态反应原及国际参考品与荚膜组织胞浆菌致敏的豚鼠均呈特异性阳性反应，局部硬结反应平均值均为11.9mm。4.2荚膜组织胞浆菌变态反应原与结核分枝杆菌及其它分枝杆菌的血清学交叉反应研究采用酶联免疫吸附(ELISA)试验，以荚膜组织胞浆菌、结核、鸟、胞内、蟾蜍、胃、不产色、施氏、次要、产鼻疽、堪萨斯、海、亚洲、瘰疠、戈登、苏加、龟脓、偶发、耻垢、楚布、猪、母牛、牛等分枝杆菌(IOOmg/ml的115°C、20分钟灭活的菌悬液)分别致敏小鼠，制备各菌株的小鼠抗血清，用荚膜组织胞浆菌和其它各菌株制备相应的抗原(抗原分别为荚膜组织胞浆菌变态反应原、结核菌纯蛋白衍生物即TB-PPD和其他各分枝杆菌菌液经115'C、20分钟灭活后的上清液)，研究荚膜组织胞浆菌与结核分枝杆菌及其它分枝杆菌的血清学交叉反应。结果表明以荚膜组织胞浆菌抗原进行包被来检测各种菌的抗血清，显示荚膜组织胞浆菌变态反应原与本菌抗血清呈强阳性反应，与结核分枝杆菌及其它分枝杆菌抗血清均呈阴性反应；以结核分枝杆菌及其它分枝杆菌提取的抗原分别进行包被来检测荚膜组织胞桨菌的抗血清，显示结核分枝杆菌及其它各分枝杆菌与本菌抗血清呈强阳性反应，与荚膜组织胞浆菌抗血清均呈阴性反应。结论荚膜组织胞浆菌变态反应原与结核分枝杆菌及其它各分枝杆菌的抗血清无交叉反应；荚膜组织胞浆菌抗血清与结核分枝杆菌及其它分枝杆菌亦无交叉反应。即荚膜组织胞浆菌变态反应原与荚膜组织胞浆菌抗血清呈特异性阳性反应。具体实验结果见表2930。表29:荚膜组织胞浆菌变态反应原与荚膜组织胞浆菌和结核及其它分枝杆菌抗血清的交叉反应结果<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>判定标准阴性0D值《0.05X2.1=0.105阳1生0D值>阴性判定值±3SD=0.129上述结果表明荚膜组织胞浆菌变态反应原与本菌抗血清呈强阳性反应，与结核及其它分枝杆菌抗血清均呈阴性反应。表30.以结核及其它分枝杆菌的抗原进行包被，研究荚膜组织胞浆菌抗血清与结核及其它分枝杆菌的交叉反应结果<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>判定标准阴性0D值《0.05X2.1=0.105阳性OD值>0.105±3SD上述结果表明荚膜组织胞浆菌变态反应原、结核杆菌抗原及其它分枝杆菌的抗原与本菌抗血清呈强阳性反应，荚膜组织胞浆菌抗血清与结核杆菌抗原及其它分枝杆菌抗原均呈阴性反应。实施例4.1和4.2分别从动物体内实验和体外血清学实验两个角度验证了荚膜组织胞浆菌变态反应原与荚膜组织胞浆菌致敏动物和荚膜组织胞浆菌抗血清呈特异性阳性反应，这为荚膜组织胞浆菌变态反应原对荚膜组织胞浆菌感染的诊断提供了理论依据。实施例5:荚膜组织胞浆菌变态反应原对豚鼠的安全性试验取荚膜组织胞浆菌变态反应原(浓度lmg/ml)，给豚鼠皮下注射0.5ml制品，6周后解剖所有豚鼠，观察心、肝、肺、脾及淋已有否异常病变，结果见表31。表3L荚膜组织胞浆菌变态反应原的豚鼠安全试验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>实施例6:荚膜组织胞浆菌变态反应原的热源实验荚膜组织胞浆菌变态反应原含糖蛋白，为观察多糖是否导致机体发热，实验以多糖含量20%的4ug/ml制品(常规人用量的40倍)按0.5ml/kg给家兔行静脉注射，注射后测家兔体温。结果见表32。表32.荚膜组织胞浆菌变态反应原的热源实验<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>上述结果表明，以较正常制品多糖含量高一倍，注射剂量超量静脉注射家免，热原实验合格，可证实在常规多糖含量〈10.0%的人体注射量0.01ug/0.lml时不会产生发热。实施例7:荚膜组织胞浆菌变态反应原的异常毒性试验将荚膜组织胞浆菌变态反应原原液(浓度50U/m1))IO倍稀释后进行小鼠(18-22g、清洁级、每组5只)和豚鼠(250-350g、清洁级、每组2只)的异常毒性试验，即给每只小鼠腹腔注射0.5na或每只豚鼠腹腔注射5ml受试样品，注射后连续观察7天，并在第7天给所有动物称重。结果所有受试动物体重均增加、未见异常反应、无死亡发生，即荚膜组织胞浆菌变态反应原无异常毒性。实施例8:荚膜组织胞桨菌变态反应原的致敏效应试验皮肤变态反应原类制品一个常见的副反应是对机体的致敏作用，本实施例将探讨荚膜组织胞桨菌变态反应原是否为致敏原、诱导机体的迟发型过敏反应。试验组与对照组分别用体重300-400g未作任何试验的健康豚鼠各3只，试验组每只豚鼠皮内注射O.lml含500U(20ug)的荚膜组织胞浆菌变态反应原样品，对照组每只豚鼠皮内注射O.lml稀释液，共3次，每次间隔5天。在第三次注射后15天，试验组与对照组每只豚鼠各皮内注射O.lml含500U(20yg)的荚膜组织胞浆菌变态反应原样品，连续3天观察注射部位是否产生迟发型过敏反应。实验结果表明，所用的三批荚膜组织胞桨菌变态反应原制品注射组动物与对照组动物均未产生迟发型过敏反应，证实荚膜组织胞浆菌变态反应原为非致敏原，不会诱导机体的迟发型过敏反应。权利要求1.一种荚膜组织胞浆菌变态反应原的提取方法，其特征在于，所述的方法包括以液体表面培养方式培养荚膜组织胞浆菌、经高压蒸汽处理后过滤去除菌体，取无菌体滤液用盐析和弱酸沉淀法提取荚膜组织胞浆菌变态反应原。2、根据权利要求1所述的方法，所述的盐析和弱酸沉淀法包括下列步骤向无菌体培养滤液中加入三氯醋酸，收集沉淀，经溶解后，加入硫酸铵，收集沉淀，用三氯醋酸多次洗涤；然后将溶解的沉淀透析，透析内液经无菌过滤后得荚膜组织胞浆菌变态反应原。3、根据权利要求l所述的方法，其中所述的弱酸为三氯醋酸。4、根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述的液体表面培养方式是指将经斜面培养的菌丝体培养物接种于葡萄糖甘油液体培养基表面，25'C静置培养8周以上。5、根据权利要求2或3所述的方法，其中所述的三氯醋酸的终浓度为4%。6、一种根据权利要求1所述的提取方法制备的荚膜组织胞浆菌变态反应原。7、一种根据权利要求1所述的提取方法制备的荚膜组织胞浆菌变态反应原在诊断人体荚膜组织胞桨菌的感染以及鉴别荚膜组织胞浆菌病和结核病中的应用。全文摘要本发明涉及一种荚膜组织胞浆菌变态反应原的提取方法，该方法采用液体表面培养方式培养荚膜组织胞浆菌，经高压蒸汽处理后过滤去除菌体，用盐析和弱酸沉淀分步提取的方法提取荚膜组织胞浆菌变态反应原。该方法工艺简单，蛋白纯度高，获得的荚膜组织胞浆菌变态反应原可用于诊断人体荚膜组织胞浆菌的感染以及荚膜组织胞浆菌病和结核病的鉴别诊断，有较高的敏感性、特异性和安全性。文档编号C07K1/14GK101372500SQ20051012393公开日2009年2月25日申请日期2005年11月25日优先权日2005年11月25日发明者苗徐,沈小兵,王国治,城苏,陈保文申请人:中国药品生物制品检定所