专利名称：一种制备四种茶黄素单体的方法
技术领域：
本发明涉及一种制备茶黄素单体的方法。
背景技术：
茶黄素类属于植物酚性色素，具有抗病毒、抗菌、抗氧化、抗癌等作用，对动脉粥样硬 化、脑梗塞、血小板凝聚、高血压、高血脂症、脂代谢紊乱等心脑血管系统疾病有较好的预 防和治疗作用，是发酵茶类三大色素(茶黄素、茶红素、茶褐素)中功效最显著、最具科学 理论依据、现阶段最具开发应用前景的化合物。迄今为止，已从红茶或儿茶素氧化物中分离 鉴定出25种茶黄素类物质，其中以4种在红茶中含量最高，分别是茶黄素(TF)、茶黄素一 3 —没食子酸酯(TF-3-G)、茶黄素一3' —没食子酸酯(TF-3'-G)和茶黄素双没食子酸酯(TFDG)。 就不同种类的茶黄素类化学成分而言，生物活性有较大的差别，双酯茶黄素(TFDG)生物活 性最高，单酯茶黄素(TF-3-G 、 TF-3'-G)活性次之，非酯茶黄素(TF)活性最弱。实际上， 不同的茶黄素成分有其独特的性质，可能在不同方面有着不同的功效。据美国Rutgers大学 2000年研究结果，茶黄素单没食子酸酯(TF-3-G 、 TF-3，-G)对WI38VA转化细胞和Caco-2 结肠癌细胞有着最强的抑制活性，它们对致癌基因Cox-2的表达有着更为强烈的抑制作用。
现有一种用高速逆流色谱法分离得到茶黄素(TF)、茶黄素一3 —没食子酸酯(TF-3-G) 与茶黄素一3'—没食子酸酯(TF-3'-G)的混合物(即单酯茶黄素)和茶黄素双没食子酸酯 (TFDG)三种物质，由于茶黄素一3 —没食子酸酯(TF-3-G)与茶黄素一3' —没食子酸酯 (TF-3'-G)为同分异构体，分子量相同，无法将两者分离，上述方法所得到的是两者的混合 液，而不是单一物；高速逆流色谱进样量少，只适合分离少量的标准品，该方法很难进行放 大，无法适合大规模工业化生产。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服上述现有技术存在的缺陷，提供一种能从茶黄素提取 物中分离出四种茶黄素单体的方法，可以根据需要选择性地生产任何种类的茶黄素单体，以 满足医药、食品、化工等领域开发不同产品的需要；同时也可以使茶黄素提取物的利用得以 大大提高，适合大规模工业化生产。
为此，本发明采用以下的技术方案 一种制备四种茶黄素单体的方法，其步骤如下1) 用水或乙醇水溶液溶解茶黄素提取物，配成茶黄素提取物溶液；2)将茶黄素提取物溶液缓慢
通过装有聚酰胺材料的层析柱；3)用洗脱溶剂对层析柱进行洗脱，依次收集分别含茶黄素、 茶黄素-3-没食子酸酯、茶黄素-3'-没食子酸酯和茶黄素双没食子酸酯单体的四种洗脱液，所 述的洗脱溶剂为由酯或酮、醇和有机酸组成的混合溶剂4)将四种洗脱液分别浓縮，得到四 种浓縮液；5)采用弱碱性水溶液分别将四种浓縮液的pH值调至中性后，用有机溶剂萃取得 萃取液，干燥萃取液得茶黄素的四种单体。本发明采用聚酰胺树脂和特殊的洗脱溶剂对茶黄 素提取物溶液进行分离，特别是能有效地将茶黄素-3 —没食子酸酯(TF-3-G)与茶黄素-3' 一没食子酸酯(TF-3'-G)分离开，从而能分离得到高纯度的茶黄素(TF)、茶黄素一3 —没食 子酸酯(TF-3-G)、茶黄素一3' —没食子酸酯(TF-3'-G)和茶黄素双没食子酸酯(TFDG)四种单 体，大大提高了茶黄素提取物的利用率，非常适合大规模工业化生产。
步骤l)中作为原料的茶黄素提取物(也称茶黄素混合物)，可以是市场上的各种茶黄素 产品，包括20%、 40%、 60%含量的茶黄素产品，例如可从无锡明欣生物工程有限公司、海 南群力药业有限公司购得含量20—60%的茶黄素提取物；也可以由茶叶原料经氧化转化后提 取得到，其方法一般是用乙酸乙酯萃取含茶黄素的水溶液，干燥乙酸乙酯层萃取液即可得到 茶黄素提取物，该提取物也可以经过进一步的分离纯化处理，以得到各种含量不同的茶黄素 提取物。
步骤2)中，在茶黄素提取物溶液缓慢通过层析柱时，茶黄素成分会被吸附结合在聚酰 胺材料上。该项操作可以在10 8(TC的温度下进行，亦可采取恒温控制色谱柱(即层析柱) 的方法进行。
所述的制备四种茶黄素单体的方法，所述的酯为乙酸乙酯、乙酸丙酯或乙酸甲酯，所述 的酮为丙酮、丁酮、戊酮或甲基异戊酮，所述的醇为甲醇、乙醇或丙醇，所述的有机酸为甲 酸或乙酸；洗脱溶剂中的酯或酮醇有机酸的比例为4~10: 1~3: 1 6。
所述的制备四种茶黄素单体的方法，所述的酯优选为乙酸乙酯，所述的酮优选为丙酮， 所述的醇优选为乙醇，所述的有机酸优选为乙酸，所述的洗脱溶剂中的乙酸乙酯或丙酮乙 醇乙酸的比例为4 10: 1~3: 1~6。
所述的制备四种茶黄素单体的方法，所述的聚酰胺材料为20-200目的聚酰胺树脂。
所述的制备四种茶黄素单体的方法，步骤5)中所述的弱碱性水溶液为碳酸钠水溶液、 碳酸氢钠水溶液、氨水溶液或氢氧化钠水溶液，或者它们的混合溶液；所述的有机溶剂为乙 酸乙酯、乙酸丁酯或己酸乙酯，优选为乙酸乙酯。
所述的制备四种茶黄素单体的方法，步骤6)中所述的干燥方法为冷冻干燥、旋转蒸发 或喷雾干燥。
所述的制备四种茶黄素单体的方法，步骤2)中所述层析处理的流速为0.1~5柱床体积/ 小时；步骤3)中所述洗脱溶剂的流速为0.5~8柱床体积/小时，加快洗脱溶剂通过色谱柱， 加快洗脱的过程。洗脱液的液压可在一定范围内变化，在1X1(^帕 5X1(^帕的压力范围内 操作。
所述的制备四种茶黄素单体的方法，聚酰胺树脂使用后，采用碱溶液(如5%NaOH)、 水、酸溶液(如10%乙酸)或有机溶剂进行单独或组合式洗漆以再生聚酰胺树脂，供重复使 用。
所述的制备四种茶黄素单体的方法，步骤4)中所用的浓縮方法为旋转蒸发或降膜浓縮。
可用单个色谱柱或多色谱柱系统来实施本发明方法，还可用在本领域内称为"模拟移动 床色谱法"或"环形色谱法"的技术实施本发明方法。
本发明具有以下有益效果从茶黄素提取物中能同时分离出高纯度的茶黄素、茶黄素一3 一没食子酸酯、茶黄素一3'—没食子酸酯和茶黄素双没食子酸酯四种单体，从而可以根据需 要选择性地生产任何种类的茶黄素单体，以满足医药、食品、化工等领域开发不同产品的需 要；同时也可以使茶黄素提取物的利用得以大大提高，能用于多种保健品的开发；该方法非 常适合大规模工业化生产。
附图1是实施例1分离得到的茶黄素(TF)的液相分析图谱。 附图2是茶黄素(TF)标准样的液相分析图谱。
附图3是实施例1分离得到的茶黄素一3 —没食子酸酯(TF-3-G)的液相分析图谱。
附图4是实施例1分离得到的茶黄素一3'—没食子酸酯(TF-3'-G)的液相分析图谱。
附图5是单酯型茶黄素(TF-3-G 、 TF-3'-G)标准样的液相分析图谱。
附图6是实施例1分离得到的茶黄素双没食子酸酯(TFDG)的液相分析图谱。
附图7是茶黄素双没食子酸酯(TFDG)标准样的液相分析图谱。
具体实施例方式
实施例l
以市场上的茶黄素提取物(TF, TF-3-G， TF-3' -G和TFDG四种茶黄素的总含量为40%) 为原料。称取2g茶黄素提取物，溶于20ml水中作为上柱溶液。
将粒径为80-100目的聚酰胺树脂填充到直径为20 mm、长800 mm的试验规模柱中，填充柱床体积为180ml，给该柱装上加热套，将树脂依次用水、5。/。NaOH水溶液、水、10%乙 酸水溶液、水、95%乙醇和水进行清洗，以去除含有的各种杂质。
将该填充柱在20。C恒温，加载上柱溶液到聚酰胺树脂顶部。在20。C温度下，用乙酸乙酯 乙醇乙酸=6: 2: 3的混合溶剂以2 BV (柱床体积)/小时的恒定流速将各种茶黄素从柱中 洗脱，根据颜色，可收集到四段洗出液，按先后的顺序分别是茶黄素(TF)、茶黄素一3 —没 食子酸酯(TF—3—G)、茶黄素一3'—没食子酸酯(TF—3'—G)、茶黄素双没食子酸酯(TFDG)。 洗脱液浓縮干燥后，得到四种高纯度茶黄素产品。其中茶黄素(TF)纯度为98%，茶黄素一 3 —没食子酸酯(TF—3—G)纯度为95%，茶黄素—3'—没食子酸酯(TF—3'—G)纯度为 94%,茶黄素双没食子酸酯(TFDG)纯度为97%。
树脂的再生处理，可将树脂依次用3BV的水、5。/。NaOH水溶液、水、10%乙酸水溶液、 水、95%乙醇和水进行清洗。
实施例2
将实施例1中的混合溶剂更换成甲基异戊酮乙醇乙酸=6: 2: 3，重复实施例1中的 操作，可获得四段洗出液，干燥后，其中茶黄素(TF)纯度为97%，茶黄素一3 —没食子酸 酯(TF—3—G)纯度为93%，茶黄素一3，一没食子酸酯(TF—3' —G)纯度为96%,茶黄素 双没食子酸酯(TFDG)纯度为98%。
实施例3
以市场上的茶黄素提取物(TF， TF-3-G， TF-3' -G和TFDG四种茶黄素的总含量为60%) 为原料。称取4g茶黄素提取物，溶于20ml水中作为上柱溶液。
将粒径为150-200目的聚酰胺树脂填充到直径为25mm、长600mm的试验规模柱中，填 充柱床体积为215ml，给该柱装上加热套，将树脂依次用水、5%NaOH水溶液、水、10%乙 酸水溶液、水、95%乙醇和水进行清洗，以去除含有的各种杂质。
将该填充柱在40'C恒温，加载上柱溶液到聚酰胺树脂顶部。在4(TC温度下，通过泵先用 10BV的乙酸乙酯乙醇乙酸=4: 1: 3的混合溶剂以2BV/小时的恒定流速洗脱，再乙酸 乙酯乙醇甲酸=4: 1: 2的混合溶剂以2BV/小时的恒定流速将各种茶黄素从柱中洗脱，
根据颜色收集洗出液，可收集到四段洗出液，按先后的顺序分别是茶黄素(TF)、茶黄素一3 一没食子酸酯(TF—3—G)、茶黄素一3'—没食子酸酯(TF—3'—G)、茶黄素双没食子酸酯 (TFDG)。洗脱液浓縮后，采用弱碱性水溶液调节其pH至中性，干燥后，得到四种高纯度 茶黄素产品，其中茶黄素(TF)纯度为97%，茶黄素_3 —没食子酸酯(TF—3—G)纯度为 89%，茶黄素一3'—没食子酸酯(TF—3'—G)纯度为87%，茶黄素双没食子酸酯(TFDG) 纯度为98%。 实施例4
将实施例3中的混合溶剂更换成甲基异戊酮甲醇乙酸=8: 1: 4和甲基异戊酮甲 醇乙酸=9: 2: 2，重复实施例3中的操作，可获得四段洗出液，干燥后，其中茶黄素(TF) 纯度为97%，茶黄素一3 —没食子酸酯(TF—3—G)纯度为96%，茶黄素一3'—没食子酸酯 (TF—3'—G)纯度为94%，茶黄素双没食子酸酯(TFDG)纯度为96%。
实施例5
以市场上的茶黄素提取物(TF， TF-3-G， TF-3， -G和TFDG四种茶黄素的总含量为20%) 为原料。称取8g茶黄素提取物，溶于20ml水中作为上柱溶液。
将粒径为100-150目的聚酰胺树脂填充到直径为25mm、长600mm的试验规模柱中，填 充柱床体积为215ml，给该柱装上加热套，将树脂依次用水、5MNaOH水溶液、水、10%乙 酸水溶液、水、95%乙醇和水进行清洗，以去除含有的各种杂质。
将该填充柱在25'C恒温，加载上柱溶液到聚酰胺树脂顶部。在25。C温度下，通过泵用
IOBV的乙酸乙酯乙醇乙酸=6: 1: 3的混合溶剂以2BV/小时的恒定流速将各种茶黄素
从柱中洗脱，根据颜色收集洗出液，可收集到四段洗出液，按先后的顺序分别是茶黄素(TF)、 茶黄素—3 —没食子酸酯(TF—3—G)、茶黄素—3，一没食子酸酯(TF—3， —G)和茶黄素双 没食子酸酯(TFDG)。洗脱液浓縮后，采用弱碱性水溶液调节其pH至中性，干燥后，得到 四种高纯度茶黄素产品。其中茶黄素(TF)纯度为96%，茶黄素一3 —没食子酸酯(TF — 3 一G)纯度96%，茶黄素一3，一没食子酸酯(TF—3，-G)纯度为94%，茶黄素双没食子酸酯 (TFDG)纯度为95%。 实施例6
将实施例5中的混合溶剂更换成乙酸乙酯甲醇乙酸=6: 1: 3，重复实施例5中的操
作，可获得四段洗出液，干燥后，其中茶黄素(TF)纯度为93%，茶黄素一3 —没食子酸酯 (TF — 3 —G)纯度为94%，茶黄素一3，一没食子酸酯(TF — 3'-G)纯度为93%,茶黄素双 没食子酸酯(TFDG)纯度为92%。 实施例7
以市场上的茶黄素提取物(TF， TF-3-G， TF-3' -G和TFDG四种茶黄素的总含量为60%) 为原料。称取2g茶黄素提取物，溶于20ml水中作为上柱溶液。
将粒径为80-100目的聚酰胺树脂填充到直径为20mm、长600mm的试验规模柱中，填 充柱床体积为157ml，给该柱装上加热套，将树脂依次用水、5%NaOH水溶液、水、10%乙 酸水溶液、水、95%乙醇和水进行清洗，以去除含有的各种杂质。
将该填充柱在25'C恒温，加载上柱溶液到聚酰胺树脂顶部。在25。C温度下，通过泵用
IOBV的乙酸乙酯乙醇甲酸=7: 1: 3的混合溶剂以2BV/小时的恒定流速将各种茶黄素 从柱中洗脱，根据颜色收集洗出液，可收集到四段洗出液，按先后的顺序分别是茶黄素(TF)、 茶黄素—3 —没食子酸酯(TF—3—G)、茶黄素—3'—没食子酸酯(TF—3'—G)和茶黄素双 没食子酸酯(TFDG)。洗脱液浓缩后，采用弱碱性水溶液调节其pH至中性，干燥后，得到 四种高纯度茶黄素产品。其中茶黄素(TF)纯度为96%，茶黄素一3 —没食子酸酯(TF — 3 —G)纯度为95%，茶黄素一3'—没食子酸酯(TF—3'-G)纯度为93%、茶黄素双没食子酸 酯(TFDG)纯度为97%。 实施例8
将实施例7中的混合溶剂更换成乙酸乙酯甲醇甲酸=8: 2: 3，重复实施例5中的操 作，可获得四段洗出液，干燥后，其中茶黄素(TF)纯度为95%，茶黄素一3 —没食子酸酯 (TF—3—G)纯度为93%，茶黄素一3' —没食子酸酯(TF—3，一G)纯度为92%,茶黄素双 没食子酸酯(TFDG)纯度为94%。
本发明的保护范围并不限于上述实施例，凡与本发明的技术方案相同或等同的技术内容 均落入本发明的保护范围内。
权利要求
1、一种制备四种茶黄素单体的方法，其步骤如下1)用水或乙醇水溶液溶解茶黄素提取物，配成茶黄素提取物溶液；2)将茶黄素提取物溶液通过装有聚酰胺材料的层析柱；3)用洗脱溶剂对层析柱进行洗脱，依次收集分别含茶黄素、茶黄素-3-没食子酸酯、茶黄素-3’-没食子酸酯和茶黄素双没食子酸酯单体的四种洗脱液，所述的洗脱溶剂为由酯或酮、醇和有机酸组成的混合溶剂；4)将四种洗脱液分别浓缩，得到四种浓缩液；5)采用弱碱性水溶液分别将四种浓缩液的pH值调至中性后，用有机溶剂萃取得萃取液，干燥萃取液得茶黄素的四种单体。
2、 根据权利要求1所述的制备四种茶黄素单体的方法，其特征在于所述的酯为乙酸乙酯、 乙酸丙酯或乙酸甲酯，所述的酮为丙酮、丁酮、戊酮或甲基异戊酮，所述的醇为甲醇、乙醇 或丙醇，所述的有机酸为甲酸或乙酸；洗脱溶剂中的酯或酮醇有机酸的比例为4~10: 1~3:1~6。
3、 根据权利要求2所述的制备四种茶黄素单体的方法，其特征在于所述的酯为乙酸乙酯， 所述的酮为丙酮，所述的醇为乙醇，所述的有机酸为乙酸，所述的洗脱溶剂中的乙酸乙酯或 丙酮乙醇乙酸的比例为4~10: 1~3: 1 6。
4、 根据权利要求2所述的制备四种茶黄素单体的方法，其特征在于所述的聚酰胺材料为 20-200目的聚酰胺树脂。
5、 根据权利要求4所述的制备四种茶黄素单体的方法，其特征在于步骤5)中所述的弱 碱性水溶液为碳酸钠水溶液、碳酸氢钠水溶液、氨水溶液或氢氧化钠水溶液，或者它们的混 合溶液；所述的有机溶剂为乙酸乙酯、乙酸丁酯或己酸乙酯。
6、 根据权利要求5所述的制备四种茶黄素单体的方法，其特征在于步骤5)中所述的有 机溶剂为乙酸乙酯。
7、 根据权利要求5所述的制备四种茶黄素单体的方法，其特征在于步骤6)中所述的干 燥方法为冷冻干燥、旋转蒸发或喷雾干燥。
8、 根据权利要求5所述的制备四种茶黄素单体的方法，其特征在于步骤2)中所述层析 处理的流速为0.1~5柱床体积/小时；步骤3)中所述洗脱溶剂的流速为0.5 8柱床体粉小时。
9、 根据权利要求5所述的制备四种茶黄素单体的方法，其特征在于所述的聚酰胺树脂使 用后，采用碱溶液、水、酸溶液或有机溶剂进行单独或组合式洗涤。
10、 根据权利要求5所述的制备四种茶黄素单体的方法，其特征在于步骤4)中所用的浓 縮方法为旋转蒸发或降膜浓縮。
全文摘要
本发明公开了一种制备茶黄素单体的方法。现有方法无法将茶黄素-3-没食子酸酯与茶黄素-3’-没食子酸酯分离。本发明的技术方案如下将茶黄素提取物溶液缓慢通过装有聚酰胺材料的层析柱；用洗脱溶剂对层析柱进行洗脱，依次收集分别含茶黄素、茶黄素-3-没食子酸酯、茶黄素-3’-没食子酸酯和茶黄素双没食子酸酯单体的四种洗脱液，所述的洗脱溶剂为由酯或酮、醇和有机酸组成的混合溶剂；将四种洗脱液分别浓缩，采用弱碱性水溶液分别将四种浓缩液的pH值调至中性后，用有机溶剂萃取得萃取液，干燥萃取液得茶黄素的四种单体。本发明能同时分离出茶黄素的四种单体，大大提高了茶黄素提取物的利用率。
文档编号C07D311/04GK101190909SQ20061015485
公开日2008年6月4日 申请日期2006年11月24日 优先权日2006年11月24日
发明者江和源, 王川丕, 高晴晴 申请人:中国农业科学院茶叶研究所