专利名称：一种柳珊瑚多羟基甾醇及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种柳珊瑚甾醇型多羟基甾醇，具体来说是涉及一种从竹柳珊瑚中提取出的 新的柳珊瑚多羟基甾醇，另外还涉及这种甾醇的制备方法及其在抑制癌细胞生长和抗海洋生 物污损方面的应用。
背景技术：
细枝竹节柳珊瑚(i5is肌'加WracAKZ^Ste)属于75^属，该属的柳珊瑚中富含独特的
多羟基甾醇，这些甾醇的结构类型主要有螺环结构的多羟基甾醇(hippuristanol)和柳珊瑚 甾醇型(gorgosterol)两种骨架，其中部分甾醇有显著的抗肿瘤活性。但是目前国内外还不 曾见有关竹柳珊瑚的有效成分的研究报道。
发明内容
本发明的目的在于从细枝竹节柳珊瑚中分离出具有药用价值的多羟基甾醇，另一个目的 是开发出这种多羟基甾醇的制备方法，进一步的目的是开发出这种多羟基甾醇在抗癌和抗海 洋污损生物幼虫附着方面的应用。
我们通过将细枝竹节柳珊瑚用有机溶剂提取得到的粗提取物用氯仿或乙酸乙酯萃取，再 将氯仿萃取物或乙酸乙酯萃取物通过常压硅胶柱层析，并用薄层层析追踪，得到的化合物对 人体多种癌症细胞株的生长都有抑制作用，还对海洋污损生物幼虫的附着有强抑制作用，从 而实现了本发明的目的。
本发明的柳珊瑚多羟基甾醇，特征是其结构用式(l)表示-
式(l)
所述的式(l)的化合物的分子式是C32H5206，化学名称是Gorgost-5-ene-la， 3 e ， 7cc, lla, 12 P -pentaol 12-acetate，外观为白色粉末。
本发明的柳珊瑚多羟基甾醇的制备方法，其特征包括以下的步骤
(1)将细枝竹节柳珊瑚(/Ws肌77odrac/^Wa"a)用有机溶剂提取，将提取液浓縮得到 粗提取物；(2) 将步骤(l)得到的粗提取物悬溶于水，用氯仿或乙酸乙酯萃取，浓縮得到氯仿萃取 物或乙酸乙酯萃取物；
(3) 将步骤(3)得到的氯仿萃取物或乙酸乙酯萃取物进行常压硅胶柱层析，以氯仿-丙 酮、氯仿-乙酸乙酯、石油醚-丙酮或石油醚-乙酸乙酯溶剂系统为洗脱剂，从体积比100:0到 0:100进行梯度洗脱，用薄层层析追踪合并组分，将在薄层层析上能用体积比7:3的氯仿-甲 醇溶剂系统展开的组分，用体积比8:2到7:3的氯仿-甲醇溶剂系统进行梯度洗脱，收集在薄 层层析上用体积比7:3氯仿-甲醇溶剂系统展开时比移值为0. 6 0. 8的组分，得到的粗产物 再纯化，得到最终产物。
步骤(l)所述的有机溶剂可以是甲醇、乙醇、二氯甲烷、甲醇和二氯甲烷的混合溶剂或乙 醇和二氯甲烷的混合溶剂等，所述的浓縮可以采用常规的方法例如减压浓缩等。 步骤(2)所述的浓縮可以采用常规的方法例如减压浓縮等。 步骤(3)所述的纯化可以采用常规的方法例如重结晶等。
通过结构鉴定，证明上述制备方法得到的产物结构用式(1)表示，其中本发明的产物的(+ ) ESIMS谱在/sA 533处显示分子离子峰，结合高分辨HRESIMS和13C丽R (DEPT)谱，推出其 分子式为C32H5206，其"CNMR (DEPT)谱显示32个碳信号，包括30个基本骨架碳7个甲基、 5个亚甲基、8个次甲基、3个季碳、5个被氧化次甲基(^64. 5， 65.7， 72.9， 74.1， 86.2)、 一个三取代双键[& 108.8 (t), 116.0 (d)]和一个乙酰基[(& 173.4 (s) 21.2 (q)， SH 2.10 (3H， s))。其丽R谱显示4个三取代甲基(S H 0. 78， 0.91， 1.08， 2.10)、 4个二 取代甲基(ShO. 83， 0.88， 0.90, 0.92)、 一个烯氢(5 H 5. 77 , 1H， d， , 4. 6 Hz) 、 5个 被氧化次甲基[SH 4. 71 (1H， d, ,8.6 Hz)， 4.22 (1H, br s), 3.90 (1H, overlap), 3.86 (1H， overlap), 3.78 (1H' br s)]、和3个属于gorgosterol型甾醇中C-30环丙烷基特征 性高场信号[(SH 0.43 (1H， dd, /=4. 3, 8.9 Hz), -0.11 (1H， t， /=4. 5 Hz), 0.21 (2H， overlap))(参考文献l.TanakaJ， Trianto A， Musman M， IssaH. H. ， Ohtani I. I.， Ichiba T, Higa T， Yoshidac W. Y. ， Scheuer P. J. Tetrahedron 2002, 58， 6259 - 6266. 2. Rao C. B., Ramana K. V. ， Rao D. V. ， Fahy E. ， Faulkner D. J. J. Nat. Prod. 1988， 51, 954 — 958.)。这些NMR数据和参考文献报道的化合物gorgost-5-ene-3 P ， 7a， 11a, 12 e _ -tetrol 12-acetate禾口 gorgostane-let, 3 P ， 5a， 6 0 , lla， 12 P -hexol 12-acetate (参考文 献Tanaka _J， Trianto A, Musman M, IssaH. H., Ohtani I. I. ， Ichiba T, Higa T， Yoshidac W. Y.， Scheuer P. J. Tetrahedron 2002， 58, 6259 - 6266.)很相似，其中本发明的产物 与gorgost-5-ene-3 e ， 7a， lla， 12 0 -tetrol 12-acetate的区别只在于本发明的产物中一个 亚甲基被氧化为次甲基。在其HMBC谱中，SH1.08 (3H， s， H-19)和Sc74. 1 (d)， 40.8 (d， C-9), 43.6 (s， C-IO)， 142.9 (s， C_5)相关，这说明本发明的产物与gorgost-5-ene_3 e ， 7a，lla, 12 0-tetrol 12-acetate的区别是C-1 ( Sc74. 1， d)被氧化为次甲基。另外，在NOESY i普中，H-l (Sh4.22，1H, br s)和H-(SH 1.82, m)/H-19 (SH 1.08， 3H， s)相关，这 表明H-1为万-构型，即C-1位置上的羟基是c-取代。通过将本发明的产物与 gorgost-5-ene-3 0 , 7cc， 11a, 12 P -tetrol 12-acetate及其它类似化合物的丽R数据比较、 以及分析本发明的产物的2D丽R (HSQC， HMBC, and NOESY)谱，将本发明的产物的结构定为 gorgost-5-ene-loc， 3 P ， 7a, lla， 12 P -pentaol 12-acetate, 其结构式由式(1)表示。
通过体外抗肿瘤活性筛选实验，结果显示本发明的柳珊瑚多羟基甾醇浓度在100M/mL 时，对数生长期的肺癌细胞株A549、鼻咽癌细胞株H0NE1、宫颈癌细胞株HeLa、胃癌细胞株 SGC-7901和肝癌细胞株细胞H印—G2的生长抑制率分别为(67±1.8) %、 (56±7.2) %、 (59±4. 1) %、 (11±3.6) %、 (10±4.5) %，证明本发明的柳珊瑚多羟基甾醇可以用于制备 治疗癌症的药物。
通过抗污损生物附着活性筛选实验，结果显示本发明的柳珊瑚多羟基甾醇纯产物对多 室草苔虫(^/^^s"eri"/7a)幼虫附着的半数有效抑制浓度ECs。为5. g/mL，半数有效致死 浓度LC50〉100yg/mL，证明本发明的柳珊瑚多羟基甾醇可以用于抗海洋污损生物幼虫附着。
本发明的柳珊瑚多羟基甾醇对肺癌细胞、鼻咽癌细胞、宫颈癌细胞的生长有较强的抑制 作用，对胃癌细胞和肝癌细胞的生长也有一定的抑制作用，另外这种化合物还能有效地抗海 洋污损生物幼虫附着，在制备抗癌药物和抗污剂方面都有良好的应用前景。 具体实施方法
以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。 实施例1:
将湿重2Kg的细枝竹节柳珊瑚肌'/7or力^c力yWa"a)冷冻干燥切碎后用10 L体积比 2:1的乙醇和二氯甲烷的混合溶剂提取3次，将提取液减压浓縮得粗提取物。
将粗提取物悬溶于水，用氯仿萃取3次，每次用氯仿300mL，收集氯仿层减压浓縮得到 氯仿萃取物25g。
用氯仿-甲醇混合溶剂将氯仿萃取物溶解拌硅胶，用1250mL氯仿拌450g硅胶进行湿法装 柱，以1000 mL氯仿-丙酮溶剂系统为洗脱剂，从体积比100:0到0:100进行梯度洗脱，用 薄层层析TLC (GF254)追踪合并得到8个组分，将在TLC (GF254)上能用氯仿-甲醇体积比7:3溶 剂系统展开的组分，用400 mL体积比从8:2到7:3变化的氯仿-甲醇溶剂系统梯度冲洗(用 常压玻璃柱)，收集在TLC (GF254)上用体积比7:3氯仿-甲醇溶剂系统展开时比移值为0.6 0.8的组分，得到粗产品26 mg。
将粗产品用氯仿-甲醇的混合溶剂重结晶，得到纯产物18mg，该产物在硅胶GF254薄层 层析板上用稀硫酸显色剂显色为红色，根据上述的结构分析证实其结构由式(l)表示。
5实施例2:体外抗肿瘤活性筛选实验
分别收集对数生长期的肺癌细胞株A549、鼻咽癌细胞株H0NE1、宫颈癌细胞株HeLa、胃 癌细胞株SGC-7901和肝癌细胞株H印—G2，用10%血清1640培养基使其悬浮，再接种于96孔 培养板，每孔细胞数为5000 / 80PL，置于5%， C02培养箱37°C培养。用10%血清1640培养基 将实施例1得到的纯产物稀释成浓度为25Pg/mL， 5Cmg/mL， 100化/mL的实验溶液。次日于实 验组1的培养板中加入浓度为25Pg/mL的实验溶液20A，实验组2的培养板中加入浓度为 50Pg/mL的实验溶液20叱，实验组3的培养板中加入浓度为100Pg/mL的实验溶液20化，并 使每孔中的终浓度达到测试(实验组浓度采用对倍稀释)。另外阴性对照组中加入等量的10% 血清1640培养基。48h后，吸弃实验组和对照组中的培养液，每孔加入MTT 20叱(2. 5 mg/mL)， 继续培养4h，再每孔加入DMSO IOO叱终止反应，37°C放置20min，用酶标仪检测各孔在570nm 处的吸光度A值，计算细胞生长抑制率。细胞生长率八实验组0D+对照组0D)X10(m。结果 见表1。
表l本发明的式(l)的化合物对肿瘤细胞的抑制作用
肿瘤细胞株(抑制率M士SD)
肺癌细胞株鼻咽癌细胞宫颈癌细胞胃癌细胞株肝癌细胞株
A549株H0NE1株HeLaSGC-7901H印—G2
实验组l23±7.49. 9±8.610±12. 1
实验组254±7. 952±8.043±6.016±6.8
实验组367±1.856±7. 259±4.111±3.610±4. 5
实施例3:对多室草苔虫(^;^y^ /7ei^""a)幼虫的抗附着活性筛选实验 该实验用的是聚苯乙烯24孔径板，将实施例1得到的多羟基甾醇纯产物作为测试样品溶 解于二甲亚砜(DMSO)，然后加入经高压灭菌器过滤(0.22 um )的海水(FSW)配成不同的 浓度(0.2 Pg/ mL， 1 Pg/ mL， 10 Pg/ mL， 50 Pg/ mL， 100 Pg/ mL)。在每个孔板中加入 20个游动的幼虫和1 mL配制好的测试样品，每个样品做4个平行孔，用加有DMSO的FSW 海水作为阴性对照物。将配有测试样品的24孔径板放于28。C的培养箱中放置1小时后，观 察实验结果。通过显微镜计算1)已附着在板壁上的幼虫个数，2)没有附着在板壁上的幼 虫个数，3)已死了的幼虫个数。计算巳附着在板壁上的幼虫个数占实验用的总幼虫个数的百 分比，再通过EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM Version 1.5软件计算其抑制幼虫附着的半数 有效抑制浓度EC5，结果显示，实施例1得到的多羟基甾醇纯产物对多室草苔虫幼虫附着的半 数有效抑制浓度ECs。为5. 8 u g/mL，半数有效致死浓度LC50〉100 " g/mL。
权利要求
1. 用下述式(1)表示的化合物式(1)。
2. 权利要求1所述的化合物的制备方法，其特征包括以下的步骤(1) 将细枝竹节柳珊瑚(/sh w72。r&ac力7Waste)用有机溶剂提取，将提取液浓縮得到 粗提取物；(2) 将步骤(l)得到的粗提取物悬溶于水，用氯仿或乙酸乙酯萃取，浓縮得到氯仿萃取 物或乙酸乙酯萃取物；(3) 将步骤(3)得到的氯仿萃取物或乙酸乙酯萃取物进行常压硅胶柱层析，以氯仿-丙 酮、氯仿-乙酸乙酯、石油醚-丙酮或石油醚-乙酸乙酯溶剂系统为洗脱剂，从体积比100:0到 0:100进行梯度洗脱，用薄层层析追踪合并组分，将在薄层层析上能用体积比7:3的氯仿-甲 醇溶剂系统展开的组分，用体积比8:2到7:3的氯仿-甲醇溶剂系统进行梯度洗脱，收集在薄 层层析上用体积比7:3氯仿-甲醇溶剂系统展开时比移值为0. 6 0. 8的组分，得到的粗产物 再纯化，得到最终产物。
3. 根据权利要求2所述的化合物的制备方法，其特征是步骤(l)所述的有机溶剂是甲醇、 乙醇、二氯甲烷、甲醇和二氯甲烷的混合溶剂或乙醇和二氯甲烷的混合溶剂，所述的浓縮是 减压浓縮，步骤(2)所述的浓縮是减压浓縮，步骤(3)所述的纯化是重结晶。
4. 权利要求1所述的化合物在制备治疗癌症的药物方面的应用。
5. 权利要求1所述的化合物在抗海洋污损生物幼虫附着方面的应用。
全文摘要
本发明涉及一种柳珊瑚多羟基甾醇及其制备方法和应用。特征是其结构由式(1)表示，通过下述方法得到将细枝竹节柳珊瑚(Isis minorbrachyblasta)的有机溶剂提取物用氯仿或乙酸乙酯萃取，萃取物进行常压硅胶柱层析进行梯度洗脱，用薄层层析追踪，将在薄层层析上能用体积比7∶3的氯仿-甲醇展开的组分，用体积比8∶2到7∶3的氯仿-甲醇进行梯度洗脱，收集在薄层层析上用体积比7∶3氯仿-甲醇展开时比移值为0.6～0.8的组分，纯化。本发明的柳珊瑚多羟基甾醇对肺癌细胞、鼻咽癌细胞、宫颈癌细胞、胃癌细胞和肝癌细胞的生长都有一定的抑制作用，另外这种化合物还能有效地抗海洋污损生物幼虫附着，因此在制备抗癌药物和抗污剂方面都有良好的应用前景。
文档编号C07J9/00GK101445543SQ200810220428
公开日2009年6月3日 申请日期2008年12月25日 优先权日2008年12月25日
发明者偲 张, 漆淑华 申请人:中国科学院南海海洋研究所