专利名称：一种应用于吡虫啉农药残留检测的单克隆抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗农药吡虫啉单克隆抗体及其制备方法，属于生物技术领域。专用于 农产品和农业生产环境中吡虫啉残留的灵敏、快速检测，特别适用于大批量样品检测。
背景技术：
吡虫啉(imidacloprid)，1_(6_氯_3_吡啶甲基)_N_硝基_2_咪唑啉亚胺，属于 新型烟碱类杀虫剂，中等毒性，通过作用于昆虫体内的乙酰胆碱酯酶受体而使害虫麻痹，最 终死亡。吡虫啉可以有效的防治蚜虫，飞虱，叶蝉等农业害虫，在农业生产中得到了广泛的 使用。由于近年来该农药在农业生产中的大量使用不仅对环境造成了污染，而且对人体健 康和一些非靶标生物带来了严重的威胁，有相关报道表明，吡虫啉对蜜蜂和家蚕有较强的 毒害作用，人若不慎误食含有吡虫啉农药残留的食品后也会出现头晕、呕吐等中毒症状。因 此，建立吡虫啉残留的检测方法刻不容缓。目前对吡虫啉农药的残留分析大多采用气相色谱法(GC)和高效液相色谱法 (HPLC)，这些方法必须使用昂贵的仪器设备，对样品前处理复杂，操作人员必须经过专业培 训，所以这些方法并不适合样品的批量筛选，这样就给食品安全监管部门对农产品安全监 督工作带来了诸多的不便。自从上个世纪70年代开创了农药免疫定量分析技术以来，农药残留免疫分析技 术得到了快速的发展，美国化学学会已经将免疫分析方法与气相色谱法、高效液相色谱法 一起列为化学农药残留分析的三大支柱，是21世纪最具竞争性和挑战性的超微量检测技 术。农药残留的免疫分析技术是基于抗体与待测小分子农药特异性结合的分析技术，这种 分析技术具有灵敏度高，特异性强，易于标准化，适合大容量样品分析等优点，并且该方法 不需要昂贵的实验仪器，操作简便，一般不需要对检测样品做复杂的前处理。国外研究者在 上个世纪90年代已经陆续报道了多种农药的免疫残留检测方法，国内这方面的研究较晚， 近几年才开始有相关研究人员重视并从事相关的研究，对于吡虫啉农药单克隆抗体制备方 法国内并未见相关报道。
发明内容
技术问题本发明的目的是提供一种可用于吡虫啉农药残留检测的单克隆抗体 及其制备方法，通过合成免疫抗原，免疫BALB/c鼠，通过杂交瘤技术制备能特异性识别吡 虫啉农药的单克隆抗体，可用于农产品和农业生产环境中吡虫啉残留的灵敏快速检测。技术方案1、抗吡虫啉农药特异性单克隆抗体，是由杂交瘤细胞株2F11/A9产生的，为IgG3 型抗体。2、抗吡虫啉农药单克隆抗体的制备方法，包括(1)吡虫啉农药人工抗原的合成将免疫半抗原1-[6-(2_羧乙硫基-3-吡啶)甲基]-N-硝基-2-咪唑啉亚胺，简称H1，与牛血清白蛋白BSA偶联，获得吡虫啉人工免疫原Hl-BSA ；将包被半抗原 1-(6-氯-3-吡啶甲基)-3_羧丙基-N-硝基-2-咪唑啉亚胺，简称H2，与卵清蛋白OVA偶 联，获得包被抗原H2-0VA ；(2)小鼠免疫将制备好的Hl-BSA作为免疫原免疫6-8周龄雌性BALB/c鼠，每次每只小鼠的免 疫原用量lOOyg，共免疫四次，首次免疫由等体积的免疫原和弗氏完全佐剂乳化，腹腔注 射，以后四次免疫用等体积的弗氏不完全佐剂和免疫原乳化；第一次和第二次免疫间隔3 周，以后间隔2周；从第三次开始，每次免疫后一周，鼠尾静脉采血，以H2-0VA作为包被原，用非竞争 间接ELISA法检测抗体的效价用碳酸盐包被缓冲液稀释包被H2-0VA，96孔酶标板中每孔 加入50 μ L，于37°C孵育2小时，将酶标板中包被液倒尽，并用含体积比0. 05%吐温20的磷 酸盐缓冲液洗涤5次；将明胶用磷酸盐缓冲液溶解配制成的封闭液，96孔酶标板中每孔加入 100 μ L，37°C孵育1. 5小时，将酶标板中封闭液倒尽，并用含0. 05%吐温20的磷酸盐缓冲液 洗涤5次；将小鼠血清用含0. 05%吐温20的磷酸盐缓冲液稀释，96孔酶标板中每孔加入 50 μ L，同时用未经免疫的小鼠血清设置阴性对照，37°C孵育0. 5小时，将酶标板中反应液 倒尽，并用含0. 05%吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤5次；用含0. 05%吐温20的磷酸盐缓冲液稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体，96 孔酶标板中每孔加入50μ L，37°C孵育0. 5小时，将酶标板中反应液倒尽，并用含0. 05%吐 温20的磷酸盐缓冲液洗涤5次；用底物缓冲液现配四甲基联苯胺显色液，96孔酶标板中每孔加入50μ L，37°C暗 处反应IOmin ；96孔酶标板中每孔加入2mol/L硫酸25 μ L，终止反应；终止显色后的酶标板立即在450nm下测定各孔单波长吸光值；(3)细胞融合选择经间接非竞争ELISA法检测效价最高的BALB/c小鼠，取脾脏，将脾细胞与对 数生长期的Sp2/0骨髓瘤细胞通过杂交瘤技术制备杂交瘤细胞，37°C，体积比5%二氧化碳 培养箱培养7-10天后，通过检测融合孔上清筛选杂交瘤细胞；(4)杂交瘤筛选融合孔上清，采用间接非竞争ELISA法进行初步筛选，其方法为用碳酸盐包被缓冲液稀释包被原H2-0VA，96孔酶标板中每孔加入50 μ L，于37°C 孵育2小时，将酶标板中包被液倒尽，并用含0. 05%吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤5次；将明胶用磷酸盐缓冲液溶解配制成的封闭液，96孔酶标板中每孔加入 100 μ L，37°C孵育1. 5小时，将酶标板中封闭液倒尽，并用含0. 05%吐温20的磷酸盐缓冲液 洗涤5次；将免疫小鼠血清用含0. 05%吐温20的磷酸盐缓冲液稀释，96孔酶标板中每孔 加入50μ L，以未融合细胞的上清作为阴性对照，以免疫小鼠的血清为阳性对照，37°C孵育 0. 5小时，将酶标板中反应液倒尽，并用含0. 05%吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤5次；
用含0. 05%吐温20的磷酸盐缓冲液稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体，96 孔酶标板中每孔加入50μ L，37°C孵育0. 5小时，将酶标板中反应液倒尽，并用含0. 05%吐 温20的磷酸盐缓冲液洗涤5次；用底物缓冲液现配四甲基联苯胺显色液，96孔酶标板中每孔加入50μ L，37°C暗 处反应IOmin ；96孔酶标板中每孔加入2mol/L硫酸25 μ L，终止显色；终止显色后的酶标板立即在450nm下测定各孔单波长吸光值；有融合细胞的上清的读数等于或大于阴性对照读数的2. 1倍时，这样的融合孔即 为阳性孔；为了进一步确定得到阳性孔所分泌抗体是针对吡虫啉农药，再通过竞争间接 ELISA法筛选。其方法为用碳酸盐包被缓冲液稀释包被原H2-0VA，96孔酶标板中每孔加入50 μ L，于37°C 孵育2小时，将酶标板中包被液倒尽，并用含0. 05%吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤5次；将明胶用磷酸盐缓冲液溶解配制成的封闭液，96孔酶标板中每孔加入 100 μ L，37°C孵育1. 5小时，将酶标板中封闭液倒尽，并用含0. 05%吐温20的磷酸盐缓冲液 洗涤5次；配制一系列浓度的吡虫啉农药标准品，丙酮溶解，用含0. 05%吐温20的磷酸盐缓 冲液稀释20倍后，与细胞培养上清等体积充分混合，以每孔50μ L加到酶标板中，以未融合 细胞的上清与含0. 05%吐温20的磷酸盐缓冲液等体积混合液作为阴性对照，37°C孵育0. 5 小时，将酶标板中反应液倒尽，并用含0. 05%吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤5次；用含0. 05%吐温20的磷酸盐缓冲液稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体，96 孔酶标板中每孔加入50μ L，37°C孵育0. 5小时，将酶标板中反应液倒尽，并用含0. 05%吐 温20的磷酸盐缓冲液洗涤5次；用底物缓冲液现配四甲基联苯胺显色液，96孔酶标板中每孔加入50μ L，37°C暗 处反应IOmin ；96孔酶标板中每孔加入2mol/L硫酸25 μ L，终止显色，终止显色后的酶标板立即 在450nm下测定各孔单波长吸光值，用只加细胞培养上清而不含农药的孔作阳性对照吸光 值为Btl，加农药的孔吸光值为B，gB < Btl，则说明所制备的抗体能与农药反应，这样的孔即 为阳性孔，阳性孔通过有限稀释法进行亚克隆，其杂交瘤细胞分泌的上清即为所制的单克 隆抗体。产生上述单克隆抗体的杂交瘤细胞株2F11/A9于2010年5月19日保藏于中国典 型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO :C201047。有益效果与现有检测技术相比，其优点和积极效果表现在实用性好传统的农药分析主要在实验室进行，其前处理过程烦琐，分析速度 慢、成本高，使用的大量有机溶剂易造成环境污染，且对实验室的仪器化程度和人员素质 要求较高，不能满足农产品贸易中对快速、简便、准确、大量检测的需求。而我们提供的 ELISA(酶联免疫吸附分析)检测方法具有操作简单、快速(以封闭好的微量分析板做检测 只需要1. 5-2小时即可)、分析成本低、分析容量大、安全可靠等优点，一般不需贵重仪器，可大量简化甚至省去前处理过程，对使用人员的专业技术水平要求不高，容易普及和推广， 特别适用于大批量样本检测和现场监测。抗原和抗体稳定性好此法合成的免疫原和包被原具有较好的稳定性，_20°C冰箱 至少可以存放5年不影响其免疫原性。杂交瘤细胞冻存于液氮至少保持3年，抗体的稳定 性也比较好，纯化的抗体-20°C冰箱至少可以存放2年。特异性好这种方法所得到的抗吡虫啉的单克隆抗体可以特异性的识别吡虫啉农 药，对其他农药几乎没有识别。灵敏度高检测限要低于其他常规的检测方法，可以达到1. 08μ g/L。本发明在人工化学合成抗原、免疫小鼠、细胞融合、筛选等大量前期工作基础上获 得了能稳定分泌特异性抗吡虫啉农药单克隆抗体的杂交瘤细胞株。以制备的特异性抗吡虫 啉农药单克隆抗体为基础，以偶联物H2-0VA作为检测抗原，通过优化检测体系，建立了一 套更加灵敏的吡虫啉农药残留酶联免疫(ELISA)检测方法，为吡虫啉农药残留检测试剂盒 的开发提供了基础，为环境安全检测提供了重要的工具。
具体实施例方式1、吡虫啉农药免疫原Hl-BSA的合成方法为(1)吡虫啉农药免疫半抗原1-[6-(2-羧乙硫基-3-吡啶)甲基]_N_硝基_2_咪 唑啉亚胺(分子式为=
结构式为的合成采用朱国念
等人发表在学术刊物《中国农业科学》上的方法合成化合物1-[6-(2-羧乙硫基-3-吡啶) 甲基]-N-硝基-2-咪唑啉亚胺(Hl)。该化合物被我们用作吡虫啉农药免疫半抗原。朱国念 等人发表的含有上述化合物合成方法的研究论文在《中国农业科学》上的具体位置为2005 年第38卷第511至515页。(2)吡虫啉农药免疫原Hl-BSA的合成反应瓶中加入吡虫啉农药免疫半抗原Hl 0. 026g和N-羟基琥珀酰亚胺0. 018g，再加入N, N- 二甲基甲酰胺0. 3mL溶解；称取0. 04g 二环己基碳二亚胺，用0.2mL N, N-二甲基甲酰胺溶解，并缓慢滴加到反应瓶中，反应在磁 力搅拌下室温进行12小时。反应终液经8000r/min离心5分钟，取上清缓慢地加入到2mL 15mg/mL的牛血清白蛋白(BSA)中，反应在磁力搅拌下室温搅拌6小时。待反应完成后，将 反应液置于透析袋内，于0.02mol/L，pH 6. 8的磷酸缓冲液中4°C搅拌透析，每四小时换一 次透析液，共透析60小时。透析结束后，将透析袋中的液体经8000r/min离心5分钟，所得 上清液即为吡虫啉农药免疫原H1-BSA。将所得免疫原Hl-BSA取出分装保存于_20°C冰箱 中备用。2、吡虫啉农药包被抗原H2-0VA的合成方法为(1)吡虫啉农药包被半抗原1-(6-氯-3-吡啶甲基)-3-羧丙基-N-硝基-2-咪唑 啉亚胺(分子式为=C13H16O4N5Cl,结构式为jQQ^^ )的合成 称取吡虫啉1. 03g(4mmol)于IOOml三口烧瓶中，用15mL DMF溶解，在0°C的条件下，边搅拌边加入NaH(0. 1032g，4. 3mmol)，反应1小时后，向反应液中滴加4-溴丁酸乙酯 (2. 23g，lOmmol)，继续在室温下搅拌12小时，然后将反应物倒入80mL水中，调节溶液的pH 值到6-7之间，混合物用氯仿(2X80mL)萃取，有机层经过水洗后用无水硫酸钠干燥，然后 减压浓缩得粗品。硅胶柱层析(环己烷/乙酸乙酯2 7(v/v))得纯品。将1.71g(4.6mm0l) 由上述步骤得到的纯品在酸性溶液中水解(2mol/L HCl,60-70°C,4h)之后用lmol/L NaOH 溶液调整PH值至6，用乙酸乙酯萃取(2 X 50mL)，无水硫酸钠干燥，然后减压浓缩得粗品。 硅胶柱层析(乙酸乙酯/甲醇4 1 (ν/ν))得1-(6-氯-3-吡啶甲基)-3-羧丙基-N-硝 基-2-咪唑啉亚胺(Η2)纯品。(2)吡虫啉农药免疫原H2-0VA的合成反应瓶中加入吡虫啉农药包被半抗原 Η2 0.026g和N-羟基琥珀酰亚胺0.0115g，再加入N，N-二甲基甲酰胺0. 3mL溶解；称取 0.0248g 二环己基碳二亚胺，用0. 2mL N，N-二甲基甲酰胺溶解，并缓慢滴加到反应瓶中，反 应在磁力搅拌下室温进行12小时。反应终液经SOOOr/min离心5分钟，取上清缓慢地加入 到2mL 10mg/mL的卵清蛋白(OVA)中，反应在磁力搅拌下室温搅拌6小时。待反应完成后， 将反应液置于透析袋内，于0. 02mol/L, pH 6. 8的磷酸缓冲液中4°C搅拌透析，每四小时换 一次透析液，共透析60小时。透析结束后，将透析袋中的液体经8000r/min离心5分钟，所 得上清液即为吡虫啉农药免疫原H2-0VA。将所得免疫原H2-0VA取出分装保存于_20°C冰 箱中备用。3、单克隆抗体有效性验证通过添加回收实验验证抗体在吡虫啉农药残留检测中的有效性。在一定量的样 品中添加一定量的农药标准品，通过添加提取液将样品中的吡虫啉萃取出来，经过稀释后 用于ELISA分析，经过公式换算后得到样品中农药的含量，进而计算回收率，若回收率在 80% -120%之间，则认为该抗体可用于此样品中吡虫啉残留检测。实施例1 自来水样品中检测吡虫啉农药残留量ELISA反应体系主要条件H2-0VA包被物1. 82 μ g/mL在微量分析板中每孔加50 μ L，单克隆抗体稀释32倍 作为工作浓度，明胶作封闭物，抗原抗体反应液(含0. 05%吐温20的磷酸盐缓冲液)中 丙酮含量为5%、ρΗ值为7. 5、离子强度为0. 8mol/L，微量分析板中每孔50 μ L。待测样品准备自来水样品将吡虫啉标准品净重250mg加入到ImL丙酮溶液中溶解，配制成 250mg/mL的吡虫啉丙酮溶液，量取自来水1L，加入1 μ L 250mg/mL的吡虫啉丙酮溶液，配制 成250 μ g/L的吡虫啉自来水样品。采用ELISA检测方法对以上样品进行检测，操作如下(1)包被H2-0VA作为包被物，1. 82 μ g/mL在微量分析板中每孔加50 μ L，37°C孵育2小时， 倒净，以含0. 05%吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤5次并倒置，在吸水纸上拍干；(2)封闭1 %明胶作封闭物，微量分析板每孔100 μ L，37°C孵育1. 5小时，倒净，以含0. 05%
吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤5次并倒置，在吸水纸上拍干；(3)加抗体与待测样品的混合液
取待测样品100 μ L加到900 μ L反应基质中配制成待测液，稀释16倍的细胞培养 上清与待测液和含0. 05%吐温20的磷酸盐缓冲液等体积充分混合，以每孔50 μ L加到微量 分析板中，37°C孵育0. 5小时，倒净，以含0. 05%吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤5次并倒置， 在吸水纸上拍干；(4)加酶标二抗用pH 7. 4,0. 15mol/L的含0. 05%吐温20的磷酸盐缓冲液将商品化的辣根过氧化 物酶标记的羊抗鼠抗体稀释20000倍，微量分析板每孔加50μ L，37°C孵育0. 5小时，倒净， 以含0. 05%吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤5次并倒置，在吸水纸上拍干。(5)显色微量分析板每孔加50 μ L的四甲基联苯胺底物溶液，37°C显色反应10分钟。(6)终止反应并读数加2mol/L的硫酸，微量分析板每孔加25 μ L终止显色反应，酶联仪上450nm处读 出，吸光值，B0 = 0. 805，待测样品吸光值B = 0. 193 ；(7)数据处理计算出结合率B/B。= 23. 975%，代入公式1Logit (B/B0) = In[(B/B0)/(l-B/B0)] 公式 1得到Logit (B/B。)= -1. 154代人如下检测方程Logit (B/B0) +3. 7732LogC_2. 9435 = 0 公式 2其中C为微量分析板孔中测得的吡虫啉浓度，求得C = 12. 189 μ g/L。待测样品中 吡虫啉残留量(以浓度X表示)可通过公式3求得X= 10X2C 公式 3求得待测样本吡虫啉残留量浓度X = 243. 8 μ g/L，其回收率(以Y表示)可通过 公式4求得回收率)=实际检测浓度/实际添加浓度X 100% 公式4求得回收率为97. 5%，说明该抗体可用于检测环境中水样的吡虫啉残留量。实施例2 大米样品中检测吡虫啉农药残留量ELISA反应体系主要条件同实施例1。待测样品准备称取Ig大米，研磨成粉末，将浓度为250 μ g/L的吡虫啉标准溶液(丙酮溶解)ImL 添加到Ig的样品中，则大米样品中的吡虫啉含量为250 μ g/kg，震荡(60r/min) 2小时，震荡 结束后静置几分钟，取上清100 μ L加到900 μ L含0. 05%吐温20的磷酸盐缓冲液中配制成 待测液。采用ELISA检测方法对以上样品进行检测，操作如下步骤(1)、(2)同实施例1。(3)加抗体与待测样品的混合液稀释16倍的细胞培养上清与待测液和含0. 05%吐温20的磷酸盐缓冲液等体积充 分混合后，以每孔50μ L加到微量分析板中，37°C孵育0. 5小时，倒净，以含0. 05%吐温20 的磷酸盐缓冲液洗涤5次并倒置，在吸水纸上拍干；
步骤⑷、(5)、(6)同实施例1 ；步骤(6)中读取吸光值，B0 = 0. 857，待测样品吸光值B = O. 190 ；(7)数据处理计算出结合率B/B。= 22. 184%，代入公式1Logit (B/B0) = In[(B/B0)/(l-B/B0)]公式 1得到Logit (B/B0) = -1. 255代人如下检测方程Logit (B/B0) +3. 7732LogC-2. 9435 = O 公式 2其中C为微量分析板孔中测得的吡虫啉浓度，求得C= 12. 963 μ g/kg。待测样品 中吡虫啉残留量(以浓度X表示)可通过公式3求得X= 10X2C 公式 3求得待测样本吡虫啉残留量浓度X = 259. 3 μ g/kg，其回收率(以Y表示)可通过 公式4求得回收率)=实际检测浓度/实际添加浓度X 100% 公式4求得回收率为103. 7%，说明该抗体可用于检测农产品大米的吡虫啉残留量。
权利要求
抗吡虫啉农药特异性单克隆抗体，是由杂交瘤细胞株2F11/A9产生的，为IgG3型抗体。
2.权利要求1所述抗吡虫啉农药单克隆抗体的制备方法，包括(1)吡虫啉农药人工抗原的合成将免疫半抗原1-[6-(2-羧乙硫基-3-吡啶)甲基]-N-硝基-2-咪唑啉亚胺，简称Hl， 与牛血清白蛋白BSA偶联，获得吡虫啉人工免疫原Hl-BSA ；将包被半抗原1-(6_氯-3-吡 啶甲基)-3-羧丙基-N-硝基-2-咪唑啉亚胺，简称H2，与卵清蛋白OVA偶联，获得包被抗原 H2-0VA ；(2)小鼠免疫将制备好的Hl-BSA作为免疫原免疫6-8周龄雌性BALB/c鼠，每次每只小鼠的免疫原 用量lOOyg，共免疫四次，首次免疫由等体积的免疫原和弗氏完全佐剂乳化，腹腔注射，以 后四次免疫用等体积的弗氏不完全佐剂和免疫原乳化；第一次和第二次免疫间隔3周，以 后间隔2周；从第三次开始，每次免疫后一周，鼠尾静脉采血，以H2-0VA作为包被原，用非竞争间接 ELISA法检测抗体的效价用碳酸盐包被缓冲液稀释包被H2-0VA，96孔酶标板中每孔加入 50 μ L，于37°C孵育2小时，将酶标板中包被液倒尽，并用含体积比0. 05%吐温20的磷酸盐 缓冲液洗涤5次；将明胶用磷酸盐缓冲液溶解配制成的封闭液，96孔酶标板中每孔加入IOOyL, 37°C孵育1. 5小时，将酶标板中封闭液倒尽，并用含0. 05%吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤5 次；将小鼠血清用含0. 05%吐温20的磷酸盐缓冲液稀释，96孔酶标板中每孔加入50 μ L， 同时用未经免疫的小鼠血清设置阴性对照，37°C孵育0. 5小时，将酶标板中反应液倒尽，并 用含0. 05%吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤5次；用含0. 05%吐温20的磷酸盐缓冲液稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体，96孔酶 标板中每孔加入50μ L，37°C孵育0. 5小时，将酶标板中反应液倒尽，并用含0. 05%吐温20 的磷酸盐缓冲液洗涤5次；用底物缓冲液现配四甲基联苯胺显色液，96孔酶标板中每孔加入50yL，37°C暗处反 应 IOmin ；96孔酶标板中每孔加入2mol/L硫酸25 μ L，终止反应；终止显色后的酶标板立即在450nm下测定各孔单波长吸光值；(3)细胞融合选择经间接非竞争ELISA法检测效价最高的BALB/c小鼠，取脾脏，将脾细胞与对数生 长期的Sp2/0骨髓瘤细胞通过杂交瘤技术制备杂交瘤细胞，37°C，体积比5%二氧化碳培养 箱培养7-10天后，通过检测融合孔上清筛选杂交瘤细胞；(4)杂交瘤筛选融合孔上清，采用间接非竞争ELISA法进行初步筛选，其方法为用碳酸盐包被缓冲液稀释包被原H2-0VA，96孔酶标板中每孔加入50μ L，于37°C孵育 2小时，将酶标板中包被液倒尽，并用含0. 05%吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤5次；将明胶用磷酸盐缓冲液溶解配制成的封闭液，96孔酶标板中每孔加入IOOyL,37°C孵育1. 5小时，将酶标板中封闭液倒尽，并用含0. 05%吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤5 次；将免疫小鼠血清用含0. 05%吐温20的磷酸盐缓冲液稀释，96孔酶标板中每孔加入 50μ L，以未融合细胞的上清作为阴性对照，以免疫小鼠的血清为阳性对照，37°C孵育0. 5 小时，将酶标板中反应液倒尽，并用含0. 05%吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤5次；用含0. 05%吐温20的磷酸盐缓冲液稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体，96孔酶 标板中每孔加入50μ L，37°C孵育0. 5小时，将酶标板中反应液倒尽，并用含0. 05%吐温20 的磷酸盐缓冲液洗涤5次；用底物缓冲液现配四甲基联苯胺显色液，96孔酶标板中每孔加入50yL，37°C暗处反 应 IOmin ；96孔酶标板中每孔加入2mol/L硫酸25 μ L，终止显色； 终止显色后的酶标板立即在450nm下测定各孔单波长吸光值； 有融合细胞的上清的读数等于或大于阴性对照读数的2. 1倍时，这样的融合孔即为阳 性孔；为了进一步确定得到阳性孔所分泌抗体是针对吡虫啉农药，再通过竞争间接ELISA法 筛选。其方法为用碳酸盐包被缓冲液稀释包被原H2-0VA，96孔酶标板中每孔加入50 μ L，于37°C孵育 2小时，将酶标板中包被液倒尽，并用含0. 05%吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤5次；将明胶用磷酸盐缓冲液溶解配制成的封闭液，96孔酶标板中每孔加入100 μ L， 37°C孵育1. 5小时，将酶标板中封闭液倒尽，并用含0. 05%吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤5 次；配制一系列浓度的吡虫啉农药标准品，丙酮溶解，用含0. 05%吐温20的磷酸盐缓冲液 稀释20倍后，与细胞培养上清等体积充分混合，以每孔50 μ L加到酶标板中，以未融合细胞 的上清与含0. 05%吐温20的磷酸盐缓冲液等体积混合液作为阴性对照，37°C孵育0. 5小 时，将酶标板中反应液倒尽，并用含0. 05%吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤5次；用含0. 05%吐温20的磷酸盐缓冲液稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体，96孔酶 标板中每孔加入50μ L，37°C孵育0. 5小时，将酶标板中反应液倒尽，并用含0. 05%吐温20 的磷酸盐缓冲液洗涤5次；用底物缓冲液现配四甲基联苯胺显色液，96孔酶标板中每孔加入50yL，37°C暗处反 应 IOmin ；96孔酶标板中每孔加入2mol/L硫酸25 μ L，终止显色，终止显色后的酶标板立即在 450nm下测定各孔单波长吸光值，用只加细胞培养上清而不含农药的孔作阳性对照吸光值 为Btl，加农药的孔吸光值为B，gB < Btl，则说明所制备的抗体能与农药反应，这样的孔即为 阳性孔，阳性孔通过有限稀释法进行亚克隆，其杂交瘤细胞分泌的上清即为所制的单克隆 抗体。
3.产生权利要求1或2所述的杂交瘤细胞株2F11/A9于2010年5月19日保藏于中国 典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO :C201047。
全文摘要
本发明涉及抗吡虫啉农药单克隆抗体及其制备方法，属于生物技术领域。用免疫半抗原1-[6-(2-羧乙硫基-3-吡啶)甲基]-N-硝基-2-咪唑啉亚胺与牛血清白蛋白的偶联物免疫BALB/c鼠，将免疫后的小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞Sp2/0通过杂交瘤技术制备杂交瘤细胞，获得了能稳定分泌抗吡虫啉农药单克隆抗体的杂交瘤株2F11/A9。此抗体经过有效性验证证明可用于农业生产环境和农产品中吡虫啉残留的灵敏快速检测。本发明涉及的抗吡虫啉农药单克隆抗体制备技术简便可行，抗体的整个制备过程无需要特别的仪器设备，容易工厂化规模生产。
文档编号C07K16/44GK101880325SQ20101020493
公开日2010年11月10日 申请日期2010年6月22日 优先权日2010年6月22日
发明者刘凤权, 华修德, 李刚, 秦娜, 钱国良 申请人:南京农业大学