专利名称：一种用高速逆流色谱从海参中分离制备脑苷脂的方法
技术领域：
本发明涉及一种海参中食用和药用活性成分的提纯方法，特别是涉及一种用高速 逆流色谱从海参中分离制备脑苷脂的方法。
背景技术：
海参(Ho lothuri an, sea cucumber)为棘皮云力物门(Echinodermata)海参纲 (Holothuroidea)动物，是重要的海洋食品和药物资源。海参中含有海参多糖、海参皂苷、海 参胶原蛋白肽、海参脑苷脂(Cerebrosides from sea cucumber)、神经节苷脂等多种生物 活性物质，具有提高免疫功能、抗肿瘤、抗凝血、降血脂和增强大脑学习记忆能力等功效。从 海参的各类生物活性物质中寻找和开发新药以及功能因子，已成为海参深度开发利用的重 要方向。海参脑苷脂是一类存在于海参体壁中具有独特结构和活性的鞘糖脂类化合物 (sphingolipids)，它属于中性鞘糖脂，由单糖、长链脂肪酸(FA)和长链神经鞘氨醇碱基 (简称长链碱，LCB)三部分组成。脑苷脂类化合物主要有抗肿瘤、免疫调节、诱导细胞凋 亡、抗菌、抗肝毒等生物活性(姜健，杨宝灵，邰阳.海参资源及生物活性物质的研究.生 物技术通讯，2004，15(5) :537-540)。目前文献报道，海参脑苷脂主要由三种不同极性 的脑苷脂系列物组成，海参种类和来源不同，所含脑苷脂的结构和功效存有差异(Koji Yamada. Chemo-Pharmaceutical Studies on the Glycosphingolipid Constituents from Echinoderm，SeaCucumbers, as the Medicinal Materials. The Pharmaceutical Society of Japan. 2002,122(12) : 1133-1143)。通常采用正反相硅胶柱层析的方法分离制备脑苷 脂，以除去磷脂、甘油三酯等其它脂质成分，过多的层析步骤使得脑苷脂的制备时间长，损 失较大，得率较低，限制其进一步研究。因此，有必要建立一种高效快速的从鲜海参、干海参 及海参制品等样品中分离制备脑苷脂的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用高速逆流色谱从海参中分离制备脑苷脂的方法，它 能满足现有技术的上述需求。一种用高速逆流色谱从海参中分离制备脑苷脂的方法，其特征在于(1)向海参 干粉中加入氯仿甲醇混合液，室温下浸泡过夜，过滤，按此步骤重复操作3 8次，合并各次 所得滤液，减压浓缩后得脑苷脂粗提物；(2)将石油醚、甲醇和水混合，振荡摇勻，静置分层 后分离，取上相作为固定相，下相作为流动相，对两相分别进行超声脱气10 30分钟；(3) 将上述脑苷脂粗提物溶解于等体积的固定相和流动相的混合溶液中，过滤得样品溶液；(4) 将上述配制好的固定相泵入高速逆流色谱仪的色谱柱中；然后开启高速逆流色谱仪，调节 主机转速和流动相流速，将流动相也泵入上述色谱柱内；待两相在色谱柱内平衡后，使上述 样品溶液经进样阀进入上述色谱柱；进样完毕后继续泵入流动相，分步收集分离物，并用薄 层色谱法检测，合并目标物，浓缩，冻干，得到脑苷脂。
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本发明由于采用了组成和配比合理的混合溶剂，控制主机转速和流动相流速等工 艺条件可获得高纯度的脑苷脂，不需使用固相载体，无不可逆吸附，样品无损失、无污染、高 效、快速、低成本且可大量分离制备脑苷脂，获得的脑苷脂纯度可达90%以上，适用于由多 种工艺制备的脑苷脂粗提物中分离制备脑苷脂。
图1为高速逆流色谱分离叶瓜参脑苷脂的色谱图。
具体实施例方式本发明的方法由四个步骤组成(1)向海参干粉中加入氯仿甲醇混合液，室温下 浸泡过夜，过滤，按此步骤重复操作3 8次，合并各次所得滤液，减压浓缩后得脑苷脂粗 提物；(2)将石油醚、甲醇和水混合，振荡摇勻，静置分层后分离，取上相作为固定相，下相 作为流动相，对两相分别进行超声脱气10 30分钟；(3)将上述脑苷脂粗提物溶解于等体 积的固定相和流动相的混合溶液中，过滤得样品溶液；(4)将上述配制好的固定相泵入高 速逆流色谱仪的色谱柱中；然后开启高速逆流色谱仪，调节主机转速和流动相流速，将流动 相也泵入上述色谱柱内；待两相在色谱柱内平衡后，使上述样品溶液经进样阀进入上述色 谱柱；进样完毕后继续泵入流动相，分步收集分离物，并用薄层色谱法检测，合并目标物，浓 缩，冻干，得到脑苷脂。本发明中向所述海参干粉中加入氯仿甲醇混合液的量为3 5L/kg海参干粉。所 述氯仿甲醇混合液中氯仿与甲醇的体积比为1 8 1。所述石油醚、甲醇和水的体积比为 4 8 3 4 1。所述主机转速为500 IOOOrpm ；所述流动相流速为1 4mL/min。下面通过实施例进一步详细说明本发明。实施例一从叶瓜参(Cucumaria frondosa)中提取制备脑苷脂(1)叶瓜参脑苷脂粗提物 的制备称取叶瓜参干粉1kg，加4L体积比为1 1的氯仿甲醇混合液，室温下浸泡过夜， 过滤，按此步骤重复5次，合并各次所得滤液，减压浓缩至膏状，得叶瓜参脑苷脂粗提物，备 用。(2)所用溶剂的配制将体积比为5 4 1的石油醚、甲醇和水置于分液漏斗中，剧 烈振荡摇勻，使两相达到平衡，静置分层后分离，取上相作为固定相，下相作为流动相，分别 对上下相进行超声脱气20分钟，冷却后备用。(3)样品溶液的制备准确称取上述叶瓜参 脑苷脂粗提取物168mg，充分溶解于等体积(各IOmL)的上相和下相的混合溶剂中，过滤，得 样品溶液。(4)分离制备将上述配制好的固定相(上相)以15mL/min的流速泵入高速逆 流色谱柱，然后开启制备型高速逆流色谱仪，调节主机转速为900rpm，以1. 2mL/min的流速 将流动相(下相)也泵入上述色谱柱内，待柱内两相建立动态平衡后，使上述样品溶液由进 样阀进样，进样完毕后继续泵入流动相，分步收集分离物，并用薄层色谱法检测。其中所收 集的叶瓜参脑苷脂的保留时间为275 480min，浓缩，冷冻干燥后得叶瓜参脑苷脂20. 8mg, 得率为12. 4%，经高效液相色谱法(HPLC)检测，如图1所示，纯度为92. 3%。实施例二从海地瓜(Acaudina molpadioides)中提取制备脑苷脂(1)海地瓜脑苷脂粗提 物的制备称取海地瓜干粉lkg，加3L体积比为2 1的氯仿甲醇混合液，室温下浸泡过夜，
4过滤，按此步骤重复3次，合并各次所得滤液，减压浓缩至膏状，得海地瓜脑苷脂粗提物，备 用。(2)所用溶剂的配制将体积比为5. 5 3.5 1的石油醚、甲醇和水置于分液漏斗中， 剧烈振荡摇勻，使两相达到平衡，静置分层后分离，取上相作为固定相，下相作为流动相，分 别对上下相进行超声脱气20分钟，冷却后备用。(3)样品溶液的制备准确称取上述海地瓜 脑苷脂粗提取物lOOmg，充分溶解于等体积(各IOmL)的上相和下相的混合溶剂中，过滤，得 样品溶液。(4)分离制备将上述配制好的固定相(上相)以15mL/min的流速泵入高速逆 流色谱柱，然后开启制备型高速逆流色谱仪，调节主机转速为950rpm，以1. 5mL/min的流速 将流动相(下相)也泵入上述色谱柱内，待柱内两相建立动态平衡后，使上述样品溶液由进 样阀进样，进样完毕后继续泵入流动相，分步收集分离物，并用薄层色谱法检测。其中所收 集的海地瓜脑苷脂的保留时间为205 400min，浓缩，冷冻干燥后得海地瓜脑苷脂9. 9mg, 得率为9.9%，经HPLC检测，纯度为91.0%。实施例三从仿刺参(Apostichopus japonicus)中提取制备脑苷脂(1)仿刺参脑苷脂粗提 物的制备将鲜仿刺参冻干，粉碎。称取仿刺参干粉lkg，加3. 6L体积比为3 1的氯仿 甲醇混合液，室温下浸泡过夜，过滤，按此步骤重复4次，合并各次所得滤液，减压浓缩至膏 状，得仿刺参脑苷脂粗提物，备用。(2)所用溶剂的配制将体积比为5 3.5 1的石油 醚、甲醇和水置于分液漏斗中，剧烈振荡摇勻，使两相达到平衡，静置分层后分离，取上相作 为固定相，下相作为流动相，分别对上下相进行超声脱气20分钟，冷却后备用。(3)样品溶 液的制备准确称取上述仿刺参脑苷脂粗提取物130mg，充分溶解于等体积(各IOmL)的上 相和下相的混合溶剂中，过滤，得样品溶液。(4)分离制备将上述配制好的固定相(上相) 以15mL/min的流速泵入高速逆流色谱柱，然后开启制备型高速逆流色谱仪，调节主机转速 为850rpm，以1. 8mL/min的流速将流动相(下相)也泵入上述色谱柱内，待柱内两相建立动 态平衡后，使上述样品溶液由进样阀进样，进样完毕后继续泵入流动相，分步收集分离物， 并用薄层色谱法检测。其中所收集的仿刺参脑苷脂的保留时间为230 330min，浓缩，冷冻 干燥后得仿刺参脑苷脂9. 9mg,得率为7. 6%，经HPLC检测，纯度为90. 2%。
权利要求
一种用高速逆流色谱从海参中分离制备脑苷脂的方法，其特征在于(1)向海参干粉中加入氯仿甲醇混合液，室温下浸泡过夜，过滤，按此步骤重复操作3～8次，合并各次所得滤液，减压浓缩后得脑苷脂粗提物；(2)将石油醚、甲醇和水混合，振荡摇匀，静置分层后分离，取上相作为固定相，下相作为流动相，对两相分别进行超声脱气10～30分钟；(3)将上述脑苷脂粗提物溶解于等体积的固定相和流动相的混合溶液中，过滤得样品溶液；(4)将上述配制好的固定相泵入高速逆流色谱仪的色谱柱中；然后开启高速逆流色谱仪，调节主机转速和流动相流速，将流动相也泵入上述色谱柱内；待两相在色谱柱内平衡后，使上述样品溶液经进样阀进入上述色谱柱；进样完毕后继续泵入流动相，分步收集分离物，并用薄层色谱法检测，合并目标物，浓缩，冻干，得到脑苷脂。
2.按权利要求1所述用高速逆流色谱从海参中分离制备脑苷脂的方法，其特征在于向 所述海参干粉中加入氯仿甲醇混合液的量为3 5L/kg海参干粉。
3.按权利要求1所述用高速逆流色谱从海参中分离制备脑苷脂的方法，其特征在于所 述氯仿甲醇混合液中氯仿与甲醇的体积比为1 8 1。
4.按权利要求1所述用高速逆流色谱从海参中分离制备脑苷脂的方法，其特征在于所 述石油醚、甲醇和水的体积比为4 8 3 4 1。
5.按权利要求1所述用高速逆流色谱从海参中分离制备脑苷脂的方法，其特征在于所 述主机转速为500 IOOOrpm ；所述流动相流速为1 4mL/min。
全文摘要
本发明公开了一种用高速逆流色谱从海参中分离制备脑苷脂的方法，其特征在于向海参干粉中加入氯仿和甲醇混合液，室温浸泡，滤液浓缩后得到脑苷脂粗提物；将石油醚、甲醇和水混合，对形成的固定相和流动相分别进行超声脱气；所得粗提物采用该混合溶剂溶解后过滤制得样品溶液；先将固定相泵入高速逆流色谱仪的色谱柱中，然后调节主机转速和流动相流速，泵入流动相，待两相平衡后，经进样阀将样品溶液泵入色谱柱中，再继续泵入流动相，分步收集，并用薄层色谱法检测，合并目标物，浓缩，冻干，得到脑苷脂。本发明制备工艺简单、操作简便、纯化效率高、分离时间短、稳定性好，适用于多种海参样品中脑苷脂的分离制备，适合工业化生产。
文档编号C07H1/08GK101891776SQ201010227080
公开日2010年11月24日 申请日期2010年7月11日 优先权日2010年7月11日
发明者冯婷玉, 孙通, 徐杰, 李兆杰, 王静凤, 董平, 薛长湖 申请人:中国海洋大学