一种苋籽降血压活性肽制备及分离纯化方法
【专利摘要】本发明涉及一种苋籽降血压活性肽制备及分离纯化方法；本方法利用碱溶酸沉制得苋籽粗蛋白，然后利用碱性蛋白酶酶解获得降血压活性肽，最后利用大孔树脂吸附、凝胶层析以及半制备高效液相色谱方法分离纯化获得具有降血压功效的活性肽；本方法从植物中提取的多肽食用安全性高，副作用小，对高血压患者可以起到降压作用，而对正常血压则无降压作用，具有很好的发展前景。
【专利说明】一种苋籽降血压活性肽制备及分离纯化方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种苋籽降血压活性肽制备及分离纯化方法。
【背景技术】
[0002]苋籽含有丰富的蛋白质、氨基酸、不饱和脂肪酸以及维生素E、维生素C、类胰岛素和角藍稀等生理活性物质，是一种优质闻广、闻效的多功能珍贵植物，具有很闻的综合开发利用价值。苋籽粗蛋白含量14?18%，显著高于一般谷物。苋籽蛋白组成主要是清蛋白、球蛋白和谷蛋白三种碱溶性蛋白，不同品种的苋籽蛋白组成稍有不同，但醇溶蛋白含量都很低，约为1.6%?2.0%，谷蛋白的含量最高约为60%?73%。因此，把苋籽蛋白作为一种新的植物蛋白资源开发利用是具有一定前途的。
[0003]近年来，研究发现天然植物蛋白质经体外酶解或体内消化酶解后，能够产生具有特殊生理功能的活性肽。这类肽食用安全性高，副作用小，对高血压患者可以起到降压作用，而对正常血压则无降压作用。目前来源于食物蛋白质的生物活性肽越来越引起有识人士的重视，特别是具有降血压活性的多肽成为生物活性肽研究的热点之一。
[0004]本发明拟用苋籽为原料，分离纯化出一种具有降血压功效的多肽，这种从植物中提取的多肽安全性好，将会具有很好的发展前景。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种苋籽降血压活性肽制备及分离纯化方法，以苋籽为原料，优化苋籽蛋白提取工艺、蛋白酶水解苋籽蛋白制备降血压活性肽工艺以及通过大孔树脂吸附、凝胶层析和半制备高效液相色谱(HPLC)等技术分离纯化出高活性的降血压活性肽，旨在为苋籽降血压活性肽的开发利用提供理论依据。发明的技术方案概述如下:
[0006](I)苋籽蛋白的制备
[0007]将苋籽粉末与质量浓度为0.018%的NaOH溶液按重量比为1:35配制料液，恒温振荡摇床升温至35°C，振荡提取30min，将反应后的料液用lmol/LHCl溶液调pH至等电点4.6使可溶性蛋白沉淀；之后6000r/min离心20min，弃上清液，取沉淀；将离心后的沉淀于_55°C真空冷冻干燥16h，即制得苋籽蛋白；
[0008](2)苋籽降血压活性肽的制备
[0009]取苋籽蛋白于烧杯中，配制成质量浓度为4%，于90°C热处理lOmin，然后取出冷却至54.4°C，用ImoL/LNaOH调节pH=8.78，加入E/S=3.5%的碱性蛋白酶诺维信，于54.4°C,160r/min水浴摇床中振荡3h，并用ImoL/LNaOH维持反应体系的pH=8.78±0.05之间，取出在100°C, 1min灭酶后迅速冷却,在10000r/min, 4°C离心20min,取上清液冷冻干燥即得粗苋籽ACE抑制肽；
[0010](3)苋籽降血压活性肽的分离
[0011]在3.2 X 10cm的层析柱中装满预处理好的DA201-C大孔树脂，湿法上柱，让其自然沉淀得高87cm，床体积(BV)700mL的树脂固定床；将质量浓度为10mg/ml，pH=5，体积为IBV的酶解液以6mL/min的速度流经层析柱，吸附完成后用IBV的蒸馏水将未吸附的蛋白以及粘附在树脂上的杂质冲洗干净，再将洗脱体积4BV的体积分数75%的乙醇溶液以5mL/min的速度流经层析柱进行洗脱，以A280nm ( 0.05时停止洗脱，旋转蒸发浓缩后冷冻干燥，得到见杆ACE抑制妝；
[0012](4)苋籽降血压活性肽的纯化
[0013]首先采用凝胶层析，将葡聚糖凝胶G25用3?5倍体积水膨胀3h，用水清洗直至上清液没有杂质，缓慢装进10X100 (内径mmX长度cm)层析柱中，管内不能有气泡，否则重新装柱；装完柱子后垂直自然沉降一晚上，使柱床紧密均一；上样是，先让管内的水位降至凝胶表层2?3mm，加入2mL质量浓度为50mg/mL的大孔树脂纯化后的苋籽ACE抑制肽溶液，待肽溶液留至凝胶表层2?3mm时，加入3?4mL的水冲洗柱壁，连接恒流泵，用纯水以0.4ml/min的流速洗脱，每5min收集一管，收集完后以同样的流速冲洗、平衡柱子；
[0014]其次采用半制备高效液相色谱:将使用凝胶层析后收集的样本再经过半制备高效液相色谱纯化，其液相条件:Varian ProStar218系统，VarianC18 (21.2*150mm)色谱柱，流速10ml/min,检测波长220nm,进样量10mg/ml—Iml,柱温25°C,洗脱条件:0?40min,乙腈质量比为5?45%，三氟乙酸质量比为0.1%。收集6?9min所得的组分既得苋籽降血压活性肽。
[0015]本方法以苋籽为原料，优化了苋籽蛋白的提取工艺，利用蛋白酶水解苋籽蛋白制备降血压活性肽工艺，最后通过大孔树脂吸附、凝胶层析和半制备高效液相色谱(HPLC)等技术分离纯化出高活性的降血压活性肽。这种从植物中提取的多肽安全性好，将会具有很好的发展前景。
[0016]本发明所述的一种苋籽降血压活性肽制备及分离纯化方法，以苋籽为原料，优化苋籽蛋白提取工艺、蛋白酶水解苋籽蛋白制备降血压活性肽工艺以及通过大孔树脂吸附、凝胶层析和半制备高效液相色谱(HPLC)等技术分离纯化出高活性的降血压活性肽，这种从植物中提取的多肽食用安全性高，副作用小，对高血压患者可以起到降压作用，而对正常血压则无降压作用。
【权利要求】
1.一种苋籽降血压活性肽制备及分离纯化方法，其特征在于: (1)苋籽蛋白的制备 将苋籽粉末与质量浓度为0.018%的NaOH溶液按重量比为1:35配制料液，恒温振荡摇床升温至35°C，振荡提取30min ;将反应后的料液用lmol/LHCl溶液调pH至等电点4.6使可溶性蛋白沉淀；之后6000r/min离心20min，弃上清液，取沉淀；将离心后的沉淀于_55°C真空冷冻干燥16h，即制得苋籽蛋白； (2)苋籽降血压活性肽的制备 取苋籽蛋白于烧杯中，配制成质量浓度为4%，于90°C热处理lOmin，然后取出冷却至54.4°C，用ImoL/LNaOH调节pH=8.78，加入E/S=3.5%的碱性蛋白酶诺维信，于54.4 °C,160r/min水浴摇床中振荡3h，并用ImoL/LNaOH维持反应体系的pH=8.78±0.05之间，取出在100°C, 1min灭酶后迅速冷却,在10000r/min, 4°C离心20min,取上清液冷冻干燥即得粗苋籽ACE抑制肽； (3)苋籽降血压活性肽的分离 在3.2 X 10cm层析柱中装满预处理好的DA201-C大孔树脂，湿法上柱，让其自然沉淀得高87cm，床体积(BV) 700mL的树脂固定床，将质量浓度为10mg/ml，pH=5，体积为IBV的酶解液以6mL/min的速度流经层析柱，吸附完成后用IBV的蒸馏水将未吸附的蛋白以及粘附在树脂上的杂质冲洗干净，再将洗脱体积4BV的体积分数75%的乙醇溶液以5mL/min的速度流经层析柱进行洗脱，以A280nm ( 0.05时停止洗脱，旋转蒸发浓缩后冷冻干燥，得到苋籽ACE抑制肽； (4)苋籽降血压活性肽的纯化 首先采用凝胶层析，将葡聚糖凝胶G25用3?5倍体积水膨胀3h，用水清洗直至上清液没有杂质，缓慢装进10X100 (内径mmX长度cm)层析柱中，管内不能有气泡，否则重新装柱，装完柱子后垂直自然沉降一晚上，使柱床紧密均一；上样是，先让管内的水位降至凝胶表层2?3mm，加入2mL质量浓度为50mg/mL的大孔树脂纯化后的苋籽ACE抑制肽溶液，待肽溶液留至凝胶表层2?3mm时,加入3?4mL的水冲洗柱壁,连接恒流泵,用纯水以0.4ml/min的流速洗脱，每5min收集一管；收集完后以同样的流速冲洗、平衡柱子； 然后采用半制备高效液相色谱:将使用凝胶层析后收集的样本再经过半制备高效液相色谱纯化，其液相条件:Varian ProStar218系统，VarianC18 (21.2*150mm)色谱柱,流速10ml/min,检测波长220nm,进样量10mg/ml—Iml,柱温25°C,洗脱条件:0?40min,乙腈质量比为5?45%，三氟乙酸质量比为0.1%。收集6?9min所得的组分既得苋籽降血压活性肽。
2.一种苋籽降血压活性肽，其特征在于:根据权利要求1所述的制备方法获得。
【文档编号】C07K14/415GK104342473SQ201310339637
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2013年8月6日 优先权日:2013年8月6日
【发明者】周家华, 常虹, 熊融, 陈飞平, 李红 申请人:北京市农林科学院