人参皂苷m1的叔丁基二甲基醚液相制备方法
【专利摘要】人参皂苷M1与叔丁基二甲基氯硅烷反应生成单醚的过程伴随生成多种少量人参皂苷M1的多叔丁基二甲硅基的多醚副产物，从薄层色谱法上可以看出这些副产物的极性大小与人参皂苷M1的单叔丁基二甲基硅醚的极性很相似，增大了分离难度，本发明公开了高效制备液相法制备分离人参皂苷M1的叔丁基二甲基醚的最佳分离条件，将优化后的条件应用于液相制备，从而达到快速准确的分离目的。
【专利说明】人参皂苷M1的叔丁基二甲基醚液相制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及人参皂苷Ml的叔丁基二甲基醚的液相制备方法属于中药【技术领域】。 【背景技术】
[0002]人参具有抗衰老、抗炎、抗过敏、降血糖、修复神经损伤和保肝等作用。近年来的研究表明，人参皂苷具有抗肿瘤的作用，大部分都是以Rg3、Rh1, Rh2等为主要研究对象。他们在促进肿瘤细胞凋亡和肿瘤细胞分化等方面表现出显著作用，不同结构的人参皂苷在抗肿瘤活性方面存在差异，其中二醇型人参皂苷抗肿瘤活性明显强于三醇型人参皂苷。
[0003]随着皂苷药代动力学研究的深入，发现真正发挥抗肿瘤作用的是皂苷动物体内的次级代谢产物Compound K,人参阜苷Compound K属于原人参二醇型阜苷。研究表明人参阜苷Compound K的酯化衍生物具有更好的抗肿瘤活性。EMl (Ml的硬脂酸酯、棕榈酸酯和油酸酯的混合物)与Ml相比具有更强的抗肿瘤活性。但是EMl来源有限，难以分离纯化。而利用化学合成技术获得的系列Ml衍生物水溶性差。采用酯键、醚键等方式给Ml的修饰基引入水溶性较好的基团，使其兼具脂溶性和水溶性，人参皂苷Ml的结构式上有六个羟基，从而选择性酯化和提高单酯化产率具有很重要的研究价值。
【发明内容】
[0004]本发明公开了一种液相制备人参皂苷Ml的叔丁基二甲基醚的方法。采用高效液相色谱法探索最佳分离条件，包括检测波长，流动相比例，流速，确定样品各组分出峰时间， 将优化后的条件应用于液相制备，从而达到快速准确的分离目的。
[0005]本发明的积极效果在于探索出最佳的人参皂苷Ml的单叔丁基二甲基硅醚的液相制备条件，从而解决了人参皂苷Ml的叔丁基二甲基醚的分离提纯难题。产物损 失小且方法简捷可行。
[0006]具体方法
高效液相色谱法得到优化后的制备条件色谱柱:C18色谱柱(10 X 250mm, 5Mm)
检测波长:203 nm 流动相比例:95%甲醇/水流速:1.0 mL/min 柱温:25°C
制备型高效液相法人参皂苷Ml的叔丁基二甲基醚的出峰时间为20.6 min.[0007]实验例I
仪器及试剂:Agilent 1260 LC型高效液相色谱仪；
LC3000型高效液相色谱仪；
甲醇(99.9%)，北京百灵威试剂有限公司；
哇哈哈纯净水；1、色谱柱的选择
分别采用Agilent C18不同长短的色谱柱进行分离实验,本实验选用10X250 mm, 5 u m 的C18色谱柱，可以达到较好的分离效果。
[0008]2、检测波长的选择
人参皂苷Ml的单醚化衍生物采用液相进行检测时通过198-600 nm的紫外波长范围内进行检测，发现人参皂苷Compound K衍生物在203 nm下有最大吸收波长。因而在实验操作中采用203 nm作为本实验的检测波长。
[0009]3、流动相及其比例的组合
实验中根据人参皂苷Ml的单醚化衍生物的结构特征，分别进行了液相色谱流动相比例选择，以经济快速准确为出发点，选择的流动相为甲醇/水体系，流动相比例为95%的甲醇/水。
[0010]4、流速的选择
在确定流动相的比例后，本实验也对流动相的流速也进行了条件优化，采用:v* =95: 5的流动相，对各流速也进行了条件优化。实验结果表明在流速为I mL /min时，分离效果达到最佳。
[0011]5、柱温的选择
确定流动相的配比和流速等条件后，实验对柱温的选择也进行了条件优化。实验考查了不同温度下的醚化产物分离度，实验结果发现，在柱温为室温25°C时，分离效果好。
[0012]6、确定人参皂苷Ml的叔丁基二甲基醚的出峰时间色谱柱:Agilent C18 色谱柱(4.6X250mm, 5Mm)
检测波长:203 nm 流动相比例:95%甲醇/水流速:1.0 mL/min 柱温:25°C
进样量10 ML(样品浓度为5mg/mL)
得到人参皂苷Ml的叔丁基二甲基醚的出峰时间为19.8 min ；
峰面积为84%
液相色谱图如图1
7、人参皂苷Ml的叔丁基二甲基醚的液相制备色谱柱:C18色谱柱(10 X 250mm, 5Mm)
检测波长:203 nm 流动相比例:95%甲醇/水流速:1.0 mL/min 柱温:25°C
进样量:1.0 mL(5mg/mL)
收集20.6 min出峰的流动相
8、高效液相色谱法确定制备后人参皂苷Ml的叔丁基二甲基醚的纯度色谱柱:Agilent C18 色谱柱(4.6X250mm, 5Mm)
检测波长:203 nm流动相比例:95%甲醇/水流速:1.0 mL/min 柱温:25°C
进样量10 ML(样品浓度为5mg/mL)
得到人参皂苷Ml的叔丁基二甲基醚的出峰时间为19.9 min 峰面积为98%，说明此制备方法制备的人参皂苷Ml的叔丁基二甲基醚样品纯度高。
[0013]液相色谱图如图2。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1确定人参皂苷Ml的叔丁基二甲基醚制备时间的高效液相色谱图图2制备所得人参皂苷Ml的叔丁基二甲基醚的高效液相色谱图
【具体实施方式】
[0015]实施例1
仪器及试剂:Agilent 1260 LC型高效液相色谱仪；
LC3000型高效液相色谱仪；
甲醇(99.9%)，北京百灵威试剂有限公司；
哇哈哈纯净水；
制备条件:
色谱柱:C18色谱柱(10 X 25Omm, 5Mm)
检测波长:203 nm 流动相比例:95%甲醇/水流速:1.0 mL/min 柱温:25°C
按照以上条件制备得到高纯度人参皂苷Ml的叔丁基二甲基醚。
【权利要求】
1.液相制备人参皂苷Ml的叔丁基二甲基醚的方法:采用高效液相色谱法探索最佳分离条件，包括色谱柱，检测波长，流动相比例，流速，柱温，确定样品各组分出峰时间，将优化后的条件应用于液相制备，从而达到快速准确的分离目的。
2.根据权利要求1:高效液相色谱法得到优化后的制备条件色谱柱:C18色谱柱(10 X 250mm, 5Mm)检测波长:203 nm 流动相比例:95%甲醇/水流速:1.0 mL/min 柱温:25°C。
3.根据权利要求1:高效液相色谱法得到人参皂苷Ml的叔丁基二甲基醚出峰时间为 19.8 分。
4.根据权利要求1:制备型高效液相法得到人参皂苷Ml的叔丁基二甲基醚的出峰时间为20.6分。
【文档编号】C07J17/00GK103601784SQ201310636173
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年12月3日 优先权日:2013年12月3日
【发明者】弓晓杰, 肖景楠, 陈丽荣 申请人:大连杰信生物科技有限公司