一种高纯度7s大豆球蛋白的制备方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种高纯度7S大豆球蛋白的制备方法及其应用。本发明公开的一种7S大豆球蛋白的制备方法，包括如下步骤：（1）将脱脂大豆粉用酸沉法得蛋白粗提液；（2）将（1）的粗提液进行强阴离子交换层析进行分离纯化，收集目的洗脱液1；（3）将目的洗脱液1进行陶瓷羟基磷灰石层析分离纯化，收集目的洗脱液2，即为目的蛋白；所述目的蛋白为沉降系数为7S的大豆球蛋白。本发明公开的方法工艺简单，易于流水线分离纯化，便于7S大豆球蛋白的工业化生产。
【专利说明】一种高纯度7S大豆球蛋白的制备方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种高纯度7S大豆球蛋白的制备方法及其应用。
【背景技术】
[0002]大豆不仅是优良的油料作物，而且是理想的食用蛋白资源，随着现代科技的发展以及人们对大豆蛋白营养特性和功能特性认识的加深，高蛋白含量的脱脂大豆粉及其分离纯化的蛋白已经广泛应用于动物养殖、食品加工等领域。 [0003]根据超速离心法的沉降系数不同将大豆蛋白分为2S、7S、11S和15S大豆球蛋白。7S与IlS球蛋白占大豆总蛋白含量的80%以上，它们的功能性质(水溶性、乳化性与表面活性等)与营养性质存在显著差异，IIS大豆球蛋白具有高凝胶性，7S大豆球蛋白具有高乳化性。近年来，7S大豆球蛋白的营养价值引起了研究者的重视。大量研究表明，7S球蛋白在降低血压方面具有十分显著的作用，其作用机理可能是其在消化过程中产生了促进脂肪代谢的多肽，从而降低血液中脂肪含量。因此，为了发挥各个蛋白在其特性方面的作用，创造经济效益，需要对大豆蛋白进行分离纯化，得到纯度较高的单一蛋白。
[0004]目前分离IlS与7S大豆球蛋白的方法主要是根据等电点不同采取酸沉淀法使两种蛋白分步沉淀。但由于Iis与7S大豆球蛋白的等电点相差不大，该方法往往需要采用多步分离，并借助低温设备与高速离心装置提高分离的精度，分离工艺繁杂冗长，大多只能用于实验室样品的制备；其次，大部分方法分离所得的蛋白纯度较低，限制了两种蛋白在实际生产中的应用，目前还没有一种工艺相对简单且能够面向工业化生产的有效方法。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种高纯度7S大豆球蛋白的制备方法及其应用。
[0006]本发明提供的一种7S大豆球蛋白的制备方法，包括如下步骤:
[0007](I)将脱脂大豆粉用酸沉法得蛋白粗提液；
[0008](2)将(I)的粗提液进行强阴离子交换层析进行分离纯化，收集目的洗脱液I ;
[0009](3)将目的洗脱液I进行陶瓷羟基磷灰石层析分离纯化，收集目的洗脱液2，即为目的蛋白；
[0010]所述目的蛋白为沉降系数为7S的大豆球蛋白。
[0011]上述方法中，所述步骤(1)的步骤为:
[0012]I)将所述脱脂大豆粉与含有IOmM巯基乙醇的Tris-HCl缓冲液按照lg:20ml的比例混合，37°C提取I小时，离心后收集上清液；
[0013]2)将I)的上清液pH调至6.4，离心收集上清液；
[0014]3)将2)的上清液pH调至4.8，离心收集沉淀；
[0015]4)将3)的沉淀用Tris-HCl缓冲液溶解，经滤膜过滤收集滤液，即为所述蛋白粗提液；
[0016]所述Tris-HCl 缓冲液为 50mM pH8.0 的 Tris-HCl 缓冲液；[0017]所述滤膜为0.45 μ m滤膜。
[0018]上述任一所述的方法中，所述步骤(2)中，强阴离子交换层析的柱填料为CaptoQ;
[0019]所述强阴离子交换层析的柱的内径为1.6cm，填料高度为5cm ；
[0020]所用的洗脱缓冲液由如下A溶液和B溶液组成:
[0021]A 溶液:50mM pH8.0 的 Tris-HCl 缓冲液；
[0022]B溶液:在50mM pH8.0的Tris-HCl缓冲液中加入NaCl至终浓度IM ；
[0023]洗脱方式为线性梯度洗脱，所述B溶液在所述洗脱缓冲液中的体积百分含量变化为从O到100% ；
[0024]所用洗脱缓冲液的用量为7个柱体积；
[0025]所述洗脱缓冲液的流速为10ml/min ；
[0026]在280nm处监测洗脱液的吸光度，收集各洗脱峰；将各洗脱峰进行SDS-PAGE电泳，根据蛋白分子量确定哪种洗脱峰为目的洗脱液I。
[0027]上述任一所述的方法中，所述步骤(3)中，所述陶瓷羟基磷灰石的柱的内径为
1.6cm，填料高度为5cm ；
[0028]所用的洗脱缓冲液由50mM pH6.5的PB缓冲液和500mM pH6.5的PB缓冲液组成；
[0029]洗脱方式为线性梯度洗脱，所述500mM pH6.5的PB缓冲液在所述洗脱液中的体积百分含量变化为从O到100% ；
[0030]所述洗脱缓冲液的用量为6-7个柱体积；
[0031]所述洗脱缓冲液的流速为10ml/min。
[0032]上样量为7个柱体积；
[0033]在280nm处监测洗脱液的吸光度，收集各洗脱峰；将各洗脱峰进行SDS-PAGE电泳，根据蛋白分子量确定哪种洗脱峰为目的洗脱液2。
[0034]上述任一所述的方法在制备7S大豆球蛋白中的应用也属于本发明的保护范围；
[0035]所述7S大?球蛋白为沉降系数为7S的大?球蛋白。
[0036]相比于现有技术，本发明具有如下优点和有益效果:
[0037]( I)将酸沉淀和柱层析有效结合，从而提高了 7S大豆球蛋白的纯度，蛋白的纯度在97%以上。
[0038](2) 7S大豆球蛋白分离纯化工艺简单，易于流水线分离纯化，便于工业化生产。
【专利附图】
【附图说明】
[0039]图1为7S大豆球蛋白的Capto Q纯化谱图。
[0040]图2为7S大豆球蛋白的SDS-PAGE电泳检测。
[0041 ] 图3为7S大豆球蛋白的CHT纯化谱图。
【具体实施方式】
[0042]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0043]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0044]50mM pH8.0的Tris-HCl缓冲液按照如下方法制备:121gTris碱，加800ml纯水，溶解后，用浓盐酸调节pH值到8.0，然后再定容到1L，配制成IM的母液，然后按照1:20倍稀释成50mMpH8.0的Tris-HCl缓冲液。
[0045]500mM pH6.5的PB缓冲液按照如下方法制备:
[0046]A 液:取 NaH2P04.H2027.6g 溶于蒸馏水，定容至 1000ml。
[0047]B 液:取 Na2HP04.7H2053.6g 溶于蒸馏水，定容至 1000ml。
[0048]取A液68.5ml与B液31.5ml混合，用水定容至400ml,调pH至6.5。
[0049]50mM pH6.5的PB缓冲液按照如下方法制备:将500mM pH6.5的PB缓冲液用水稀释10倍。
[0050]巯基乙醇购自北京益德益华科技发展有限公司，产品目录号为M-6250。
[0051]脱脂大豆粉购自安阳市奇天生物技术有限公司，产品目录号为201010101010。
[0052]Capto Q 填料购自 GE Healthcare，货号为 20091005。
[0053]XK16/20 柱购自 GE Healthcare，货号为 28_9889-37。
[0054]CHT 填料购自 Bio-Rad，货号为 Bio-Scale CHTl。
[0055]实施例1、7S大豆球蛋白的分离纯化
[0056]一、7S大豆球蛋白的粗提取
[0057](一)将脱脂大豆粉按照lg:20ml的比例加入50mMpH8.0的Tris-HCl缓冲液(含IOmM巯基乙醇)中，37°C提取I小时，28°C 1000Orpm离心15分钟，收集上清液。
[0058](二)用2mol/L的HCl将上清液的pH调至6.4，28°C 1000Orpm离心15分钟，再次
收集上清。
[0059](三)再用2mol/L的HCl将上清液的pH调至4.8，28°C 1000Orpm离心15分钟，收
集沉淀。
[0060](四)沉淀用50mMpH8.0的Tris-HCl缓冲液溶解，经0.45 μ m滤膜过滤收集滤液。
[0061]二、7S大豆球蛋白的强阴离子交换层析
[0062](一)取IOmlCapto Q填料装填XK16/20柱子(柱子内径为1.6cm，填料高度为5cm)，装填完毕后用50mM pH8.0的Tris-HCl缓冲液平衡10个柱体积。
[0063](二)将步骤一得到的滤液上柱，采用50mM pH8.0的Tris-HCl缓冲液平衡柱子，平衡完毕后采用洗脱缓冲液进行线性梯度洗脱，线性梯度洗脱的总体积是7个柱体积。
[0064]洗脱缓冲液由A溶液和B溶液组成:
[0065]A 溶液:50mM ρΗ8.0 的 Tris-HCl 缓冲液；
[0066]B溶液:在50mM pH8.0的Tris-HCl缓冲液中加入NaCl至终浓度1M。
[0067]线性梯度洗脱时B溶液在洗脱缓冲液中的体积百分含量变化为0-100%。
[0068]流速为10ml/min，在280nm处测收集管溶液的吸光度，收集各洗脱峰。
[0069]洗脱曲线如图1所示。
[0070]图1中，C-1 (洗脱峰体积为7.5mL)、C-2 (洗脱峰体积为6mL)和C-3 (洗脱峰体积为5mL)为三个洗脱峰。
[0071]三、采用SDS-PAGE电泳分别检测各洗脱峰，确定目的蛋白分布峰。
[0072]分离胶浓度为10%，浓缩胶浓度为4%，以分子量标准蛋白(条带大小分别为100、20、10、5、3.4KDa)以及三个步骤二的洗脱峰C_l、C-2和C-3进行电泳，电泳条件为浓缩胶恒压80V，分离胶恒压120V。 电泳结束后用考马斯亮兰G250染色液染色6小时以上，脱色观察。检测结果如图2所示。
[0073]图2 中，1、Capto Q 穿透；2、Capto Q 洗脱 I (C-1) ;3、Capto Q 洗脱 2 (C-2) ;4、Capto Q洗脱3(D-1) ;7、CHT洗脱2 (D_2);8、低分子量蛋白质marker ο
[0074]穿透是指上样过程中流出的溶液，即未与柱子内的填料结合的液体。
[0075]图2表明，洗脱峰C-3中含有7S大豆球蛋白(即分子量为180210Da的蛋白质)，7S大豆球蛋白由α、α '和β组成。
[0076]四、7S大豆球蛋白的陶瓷羟基磷灰石纯化
[0077]取IOml CHT填料装填ΧΚ16/20柱子(柱子内径为1.6cm，填料高度为5cm)，装填完毕后用50mM pH6.5的PB缓冲液平衡10个柱体积，将步骤三检测的含有7S球蛋白的C-3样品上柱，上样体积为7个柱体积，上样完毕后继续用50mM pH6.5的PB缓冲液平衡，平衡完毕，再用洗脱缓冲液进行线性梯度洗脱，线性梯度洗脱的总体积是6-7个柱体积。
[0078]洗脱缓冲液由50mM PB (pH6.5)和500mM PB (pH6.5)缓冲液组成。
[0079]线性梯度洗脱时500mM PB (pH6.5)缓冲液在洗脱缓冲液中的体积百分含量变化为 0-100%。
[0080]流速为10ml/min，在280nm处测收集管溶液的吸光度，收集各洗脱峰。
[0081]洗脱曲线如图3所示。
[0082]图3中，D-1 (洗脱峰体积为15mL)和D_2 (洗脱峰体积为7mL)为两个洗脱峰。
[0083]五、采用SDS-PAGE电泳分别检测各洗脱峰，确定目的蛋白分布峰。
[0084]分离凝胶浓度为10%，浓缩胶浓度为4%，以分子量标准蛋白(条带大小分别为100、20、10、5、3.4KDa)以及步骤四的两个洗脱峰D-1和D-2进行电泳，电泳条件为浓缩胶恒压80V，分离胶恒压120V。电泳结束 后用考马斯亮兰G250染色液染色6小时以上，脱色观察。检测结果如图2所示。
[0085]图2表明，D-2峰含有7S大豆球蛋白，经过第二次柱纯化后7S大豆球蛋白得到有效分离富集，7S大豆球蛋白的纯度达到97%。
【权利要求】
1.一种7S大豆球蛋白的制备方法，包括如下步骤: (1)将脱脂大豆粉用酸沉法得蛋白粗提液； (2)将(I)的粗提液进行强阴离子交换层析进行分离纯化，收集目的洗脱液I; (3)将目的洗脱液I进行陶瓷羟基磷灰石层析分离纯化，收集目的洗脱液2，即为目的蛋白； 所述目的蛋白为沉降系数为7S的大豆球蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述步骤(1)的步骤为: 1)将所述脱脂大豆粉与含有IOmM巯基乙醇的Tris-HCl缓冲液按照lg:20ml的比例混合，37°C提取I小时，离心后收集上清液； 2)将I)的上清液pH调至6.4，离心收集上清液； 3)将2)的上清液pH调至4.8，离心收集沉淀； 4)将3)的沉淀用Tris-HCl缓冲液溶解，经滤膜过滤收集滤液，即为所述蛋白粗提液； 所述Tris-HCl缓冲液为50mM pH8.0的Tris-HCl缓冲液； 所述滤膜为0.45 μ m滤膜。
3.根据权利要求1或2所述的方 法，其特征在于:所述步骤(2)中，强阴离子交换层析的柱填料为Capto Q ； 所述强阴离子交换层析的柱的内径为1.6cm，填料高度为5cm ； 所用的洗脱缓冲液由如下A溶液和B溶液组成: A 溶液:50mM ρΗ8.0 的 Tris-HCl 缓冲液； B溶液:在50mM pH8.0的Tris-HCl缓冲液中加入NaCl至终浓度IM ； 洗脱方式为线性梯度洗脱，所述B溶液在所述洗脱缓冲液中的体积百分含量变化为从O 到 100% ； 所用洗脱缓冲液的用量为7个柱体积； 所述洗脱缓冲液的流速为10ml/min ； 在280nm处监测洗脱液的吸光度，收集各洗脱峰；将各洗脱峰进行SDS-PAGE电泳，根据蛋白分子量确定哪种洗脱峰为目的洗脱液I。
4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于:所述步骤(3)中，所述陶瓷羟基磷灰石的柱的内径为1.6cm,填料高度为5cm ； 所用的洗脱缓冲液由50mM pH6.5的PB缓冲液和500mM pH6.5的PB缓冲液组成；洗脱方式为线性梯度洗脱，所述500mM pH6.5的PB缓冲液在所述洗脱液中的体积百分含量变化为从O到100% ； 所述洗脱缓冲液的用量为6-7个柱体积； 所述洗脱缓冲液的流速为10ml/min ； 在280nm处监测洗脱液的吸光度，收集各洗脱峰；将各洗脱峰进行SDS-PAGE电泳，根据蛋白分子量确定哪种洗脱峰为目的洗脱液2。
5.权利要求1-4任一所述的方法在制备7S大豆球蛋白中的应用； 所述7S大豆球蛋白为沉降系数为7S的大豆球蛋白。
【文档编号】C07K1/14GK103739689SQ201410026071
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2014年1月21日 优先权日:2014年1月21日
【发明者】谯仕彦, 白晶, 宋青龙, 何涛 申请人:北京龙科方舟生物工程技术有限公司